鄧如杰

（廣東省懷集縣林業(yè)技術(shù)推廣中心，廣東 肇慶 526400）

菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat.）原產(chǎn)地在中國，又名黃華、壽客、金英、秋菊、陶菊、隱逸花、家菊、日精、女華、延年，屬菊科，是多年生宿根草本或亞灌木植物。菊花的品種繁多，色彩多樣，花型變化很大，香、姿、韻俱佳，入我國傳統(tǒng)四大名花之列，屬當(dāng)代中國十大名花之一，深受國內(nèi)和國外的關(guān)注和喜愛。目前，中國栽培的菊花品種約3000個。菊花生長旺盛，萌發(fā)能力較強(qiáng)，一朵菊花可以經(jīng)過多次摘心，分生出上千上萬個花蕾。部分菊花品種的枝條較多而且柔軟，可以組成菊門、菊籬、菊亭、菊橋、菊球、菊塔等形式精美的造型。

菊花育種是從株高、花期、花色、抗性和花型等多方面對菊花進(jìn)行改良。由于菊花的病毒種類比較多，而且危害較為嚴(yán)重，使用傳統(tǒng)的扦插繁殖苗，容易引起病毒的蔓延。因此，運(yùn)用脫毒培養(yǎng)和組培快繁生產(chǎn)母本植株的技術(shù)，對優(yōu)良品種的脫毒和復(fù)壯起著重要作用。本研究以菊花為材料，從6-BA、NAA組合和配比、不同部位的外植體等方面來探討并建立供試菊花的再生系統(tǒng)，對影響菊花再生系統(tǒng)的因素進(jìn)行詳細(xì)地研究。

1.材料和方法

1.1 植物材料：菊花無菌試管苗

1.2 試劑及儀器設(shè)備

1.2.1 試劑

NAA 、6-BA：SIGMA 公司

NAA：1 mol/L NaOH溶解，終濃度為0.5 g/L，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

6-BA：少量1mol/LHCl溶解，終濃度為0.5g/L，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

其他常規(guī)的化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2.2 儀器設(shè)備

超凈工作臺（蘇凈集團(tuán)）

自動高壓滅菌鍋（Yamato Sterilizer SM510）

20μL、200μL、1mL 移液槍（Gilson）

1.3 基本培養(yǎng)基

植物組織培養(yǎng)基：實(shí)驗(yàn)中以MS(Murashige and Skoog 1962)為基本培養(yǎng)基，瓊脂7-8g/L，滅菌前調(diào)pH到5.8－5.9。

1.3.1 誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基

以MS為基本培養(yǎng)基，配加不同濃度的6-AB和NAA，其中6-BA取0、1、2、3、4mg/L五水平，NAA取0、0.1，0.2，0.3，0.4mg/L 五水平。

1.3.2 生根培養(yǎng)基

以1/2MS為基本培養(yǎng)基，配加不同濃度的NAA（0、0.1、0.2mg/L）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 培養(yǎng)條件

溫度25士1℃，光照強(qiáng)度2000－2400 lx，光照時間為16h/d。

1.4.2 外植體的選擇

選取約25天苗齡的菊花無菌苗葉片（取充分展開的中上部幼嫩葉片）、莖段（取莖段的兩節(jié)之間部位）、葉柄（取中上部幼嫩葉的葉柄）和根段（取15天苗齡的無菌苗幼嫩根段）為外植體。接種至MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.3mg/L分化培養(yǎng)基上。每7天觀察不同外植體的生長情況，并于35天后統(tǒng)計不同外植體平均再生芽數(shù)。

1.4.3 不同濃度6-BA和NAA對誘導(dǎo)芽的影響

為了探索適合菊花不定芽再生的最佳配方，本實(shí)驗(yàn)以MS為基本培養(yǎng)基，配加6-BA、NAA兩種激素，激素配比見表1。以20－25天苗齡的經(jīng)過滅菌的無菌苗中上部的幼嫩葉片為外植體，切成0.5×0.5cm，葉背靠近培養(yǎng)基接種在不同種類的培養(yǎng)基上，每瓶接種5塊外植體，每個處理6瓶，觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表1 6-BA和NAA的不同濃度配比

3 2 0.2 4 3 0.2 5 4 0.2 6 1 0.3 7 2 0.3 8 3 0.3 9 4 0.3 10 1 0.4 11 2 0.4 12 3 0.4 13 4 0.4 14 1 0.5 15 2 0.5 16 3 0.5 17 4 0.5

1.4.4 不同濃度NAA對生根的影響

將菊花無菌苗切取為1－1.5cm長，接種到NAA不同濃度的生根培養(yǎng)基中（以1/2MS為基礎(chǔ)，添加不同濃度的NAA），NAA濃度見表2。15天后比較新生菊花苗生根的情況，并統(tǒng)計結(jié)果，從而篩選出適合供試菊花組織培養(yǎng)的最佳生根培養(yǎng)基。

表2 不同NAA濃度表

1.4.5 光照對愈傷組織產(chǎn)生與不定芽再生的影響

以葉片作為外植體，接種到MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.3mg/L培養(yǎng)基上，分別放置在光照（16h/d）和黑暗處培養(yǎng)，觀察結(jié)果。

2.結(jié)果與分析

2.1 不同外植體不定芽再生能力的比較

在MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.3mg/L的培養(yǎng)基中，均觀察到葉片、莖段、葉柄具有分化現(xiàn)象發(fā)生，而根段沒有任何分化現(xiàn)象發(fā)生，具體生長狀況見表3。

表3 不同外植體不定芽再生能力比較表

通過對不同外植體產(chǎn)生不定芽再生能力的比較，可知來源于不同組織或器官的外植體有不同的分化能力。當(dāng)細(xì)胞分裂素與生長素共同使用時能刺激愈傷組織的形成，而實(shí)驗(yàn)使用的激素不適合根段的愈傷組織的形成，所以根段沒有觀察到任何分化現(xiàn)象發(fā)生，具體再生芽數(shù)見表4。根據(jù)結(jié)果可以得出：葉片最適合作為外植體。

表4 不同外植體產(chǎn)生再生芽的比較

2.2 不同濃度6-BA和NAA對誘導(dǎo)芽的影響

葉盤接種到所設(shè)計的培養(yǎng)基上，從第4天開始，可以不同程度看到葉盤膨大。20天后，誘導(dǎo)芽陸續(xù)地產(chǎn)生。培養(yǎng)30天，觀察并統(tǒng)計長度均在5毫米以上芽的數(shù)量，芽的誘導(dǎo)率及生長情況見表5。

表5 不同濃度6-BA和NAA對誘導(dǎo)芽的影響

結(jié)果表明，激素濃度的不同，對菊花葉片叢生芽的產(chǎn)生有著不同的影響。在沒有添加任何激素的培養(yǎng)基上，沒有芽的產(chǎn)生；在添加不同濃度6-BA和NAA的培養(yǎng)基上，都有叢生芽的產(chǎn)生。6-BA對叢生芽的生長質(zhì)量有很大影響，當(dāng)6-BA的濃度為1mg/L時，幼苗節(jié)間長，瘦弱；當(dāng)6-BA的濃度上升為2mg/L時，幼苗的質(zhì)量明顯得到改善，幼苗濃綠、節(jié)間短、粗壯；當(dāng)6-BA的濃度上升為4mg/L時，就表現(xiàn)出萎縮或褐化等不良的癥狀，7d后接種材料就開始褐化。高亦珂（2001）和李辛雷等（2004）對菊花莖葉外植體再生體系進(jìn)行研究時，也有類似的結(jié)果。在激素濃度偏高的情況下，葉片與莖段易褐化、壞死。當(dāng)NAA的濃度為0.1mg/L時，產(chǎn)生的叢生芽較少；當(dāng)NAA的濃度增加到0.3mg/L時，產(chǎn)生叢生芽的數(shù)量會明顯增多，但如果濃度增加到0.5mg/L時，叢生芽的產(chǎn)生數(shù)量又會減少，說明濃度過高具有一定的抑制作用。李辛雷等（2004）也報道了NAA濃度升高時，叢生芽誘導(dǎo)率下降。在不同濃度6-BA和NAA配比的培養(yǎng)基上，幾種典型的生長狀況如圖1。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定，適合誘導(dǎo)菊花叢生芽再生的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA2.0mg/L +NAA0.3mg/L。

圖1 不同濃度6-BA和NAA配比對外植體的影響

2.3 不同濃度NAA對生根的影響

將菊花無菌苗切取為1－1.5cm長，接種于不同濃度NAA的生根培養(yǎng)基中，15天后統(tǒng)計長度超過0.5cm的根數(shù)量，結(jié)果見表6。從結(jié)果可以看出，在1/2MS培養(yǎng)基中，無論是否添加NAA都能誘導(dǎo)根的產(chǎn)生，在沒有添加激素的條件下，根的生長狀況良好，數(shù)量多、長而粗，并且有大量的根毛（如圖2）。實(shí)驗(yàn)說明NAA對根的誘導(dǎo)效果并不明顯，稍高濃度的NAA對根的生長還起到抑制作用，不添加NAA的1/2MS培養(yǎng)基更適合誘導(dǎo)根的生長。

表6 不同濃度NAA對生根的影響

圖2 不同濃度NAA對生根的影響

2.4 光照對愈傷組織產(chǎn)生與不定芽再生的影響

光照對愈傷組織產(chǎn)生與不定芽再生有很大的影響，在光照條件下（16h/d）培養(yǎng)的外植體會迅速增大，呈綠色，而且只有切口處產(chǎn)生愈傷組織，由此再生出來的不定芽較少，長勢不均。而將外植體先在黑暗處培養(yǎng)10d，整個外植體都會產(chǎn)生愈傷組織，呈淡黃色，上面有大量的凸?fàn)钗铮俎D(zhuǎn)移到光照條件下培養(yǎng)，凸?fàn)钗镒兂删G點(diǎn)，長成大量的不定芽，由此產(chǎn)生的不定芽數(shù)量多、長勢均一（如圖3）。這說明在黑暗處培養(yǎng)更利于愈傷組織的產(chǎn)生及不定芽的再生。

圖3 光照對愈傷組織產(chǎn)生與不定芽再生的影響

3.結(jié)論與討論

3.1 影響葉片外植體不定芽再生的因素

不同的培養(yǎng)條件和外植體生理狀態(tài)，對葉片的再生能力有很大的影響。葉片在含高濃度NAA的培養(yǎng)基上進(jìn)行一定的誘導(dǎo)培養(yǎng)后再轉(zhuǎn)接到低濃度NAA的培養(yǎng)基上能夠正常生長，說明濃度較高的NAA有利于誘導(dǎo)葉片外植體的生長。

不同部位及生理狀態(tài)的葉片再生能力也不同。其中15－25天苗齡的無菌苗中上部幼嫩葉片再生能力較強(qiáng)。組織的幼嫩程度與形態(tài)發(fā)生能力和植株分化能力有關(guān)，幼嫩葉片組織分化程度淺，容易受外界條件的影響而改變發(fā)育和分化方向。在外源激素存在的條件下，幼嫩的組織容易脫離原來的分化方向而再生不定芽。

不同組織器官的材料有不同的分化能力，從2.1可以看出：葉片與莖段分化能力較強(qiáng)，而根的分化能力較弱。

3.2 影響葉片外植體褐化和再生率的因素

不適宜的培養(yǎng)基，可能誘導(dǎo)外植體分泌某些容易引起褐化的物質(zhì)，或外植體不能進(jìn)行正常的新陳代謝而導(dǎo)致褐化，適宜的培養(yǎng)基對防止葉片外植體褐化很重要。實(shí)驗(yàn)中觀察到在不適宜的培養(yǎng)基中葉片外植體明顯的褐化現(xiàn)象出現(xiàn)在接種后約15d。無菌苗上部的幼嫩葉片出現(xiàn)褐化的時間比中下部晚，或褐化程度略低于下部老葉，再生率相對較高。中下部葉片再生率低，下部葉基本沒有芽再生。所有葉片外植體都隨培養(yǎng)時間的延長都會出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。不同器官的外植體也影響葉片的褐化和不定芽再生。

3.3 最佳再生體系的確立

葉片接種在MS +6-BA2.0mg/L + NAA 0.3mg/L培養(yǎng)基上，一星期左右有愈傷組織的產(chǎn)生，再經(jīng)過約20天的培養(yǎng)，愈傷組織分化出不定芽，并且芽的誘導(dǎo)率達(dá)100%，再生芽在1/2MS培養(yǎng)基上經(jīng)過10天左右的培養(yǎng)可誘導(dǎo)出根，生根率為100%。再過20天即可煉苗、移栽。