郭田燕，李俊玲，王鶴潔，竇敏敏，李 君，秦 健，杜 榮

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗教學(xué)中心，山西太谷 030801；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801）

糖皮質(zhì)激素（Glucocorticoid，GC）對動物機(jī)體生命活動有非常重要的作用[1]，主要體現(xiàn)在生理和藥理2 個方面。在生理方面，當(dāng)機(jī)體受到外界環(huán)境各種應(yīng)激刺激（饑餓、寒冷、缺氧等）時，GC 分泌增多，使機(jī)體加速代謝來抵抗外界刺激[2]；在藥理方面，臨床上通常會使用糖皮質(zhì)激素來治療一些疾病，如抗炎癥、抗過敏和調(diào)節(jié)免疫力等[3-5]。哺乳動物在妊娠期間，來自母體的糖皮質(zhì)激素可以通過胎盤作用到胎鼠，在胎兒的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用[6-7]。但如果母體處于應(yīng)激導(dǎo)致內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素增加或者長期用藥導(dǎo)致子宮內(nèi)外源性糖皮質(zhì)激素含量升高，超過一定限度時會對胎兒的生長發(fā)育產(chǎn)生不良影響[8]。其中，骨骼肌是糖皮質(zhì)激素作用的靶點之一，當(dāng)體內(nèi)糖皮質(zhì)激素水平處于病理劑量時，會導(dǎo)致肌肉發(fā)育受阻、質(zhì)量下降[9]。

Pax3、Pax7 均是Pax（paired box）家族的成員，是肌源性祖細(xì)胞的重要調(diào)控因子，其中，Pax3 主要激活肌細(xì)胞生成因子Myf5 和肌細(xì)胞決定因子MyoD，在初級生肌過程中扮演重要角色[10-11]；Pax7 則是維持肌衛(wèi)星細(xì)胞的重要因子[12]，在肌肉的發(fā)生和再生過程中發(fā)揮著不可或缺的作用[13]。研究表明，肌肉發(fā)育負(fù)調(diào)控因子Myostatin 在胚胎期主要是通過抑制成肌細(xì)胞的增殖分化來影響骨骼肌發(fā)育，Myostatin可以通過下調(diào)肌肉發(fā)育正調(diào)控的相關(guān)基因來影響骨骼肌的生長[14-15]。

本試驗通過建立小鼠母體應(yīng)激模型，探討母體遭遇糖皮質(zhì)激素過量時對胎兒骨骼肌發(fā)育的影響是否對Myostatin、Pax3 和Pax7 的表達(dá)產(chǎn)生影響，并通過生物信息學(xué)分析其潛在的調(diào)控關(guān)系，旨在為進(jìn)一步深入研究家畜母體應(yīng)激對子代骨骼肌發(fā)育影響的分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為防治動物母體糖皮質(zhì)激素過度導(dǎo)致的胎兒肌肉發(fā)育遲緩提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 供試動物為10 只8 周齡雌鼠、5 只10 周齡雄鼠，質(zhì)量25～30 g，均購自山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑和設(shè)備 地塞米松針劑和生理鹽水購自同仁大藥房，小鼠糖皮質(zhì)激素酶聯(lián)分析試劑盒購自江蘇酶免實業(yè)有限公司，Trizol 試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑和熒光定量試劑均購自TaKaRa 公司。

生物組織包埋機(jī)（益迪醫(yī)藥設(shè)備廠）、切片機(jī)和烤片機(jī)（益迪醫(yī)藥設(shè)備廠）、光學(xué)顯微鏡（德國Leica）、熒光定量PCR 儀（美國BIO-RAD）、核酸蛋白測定儀（美國Thermo）。

1.2 方法

1.2.1 動物飼養(yǎng)及處理 雌雄鼠分籠飼養(yǎng)于SPF級動物房。試驗處理當(dāng)日18：00 雌雄2∶1 合籠過夜，并于次日6：30 檢查雌鼠的陰栓，查見陰栓之日定為懷孕第0 天（Embryonic day，E0）。將孕鼠隨機(jī)分成2 組：對照組（生理鹽水，0.2 mL/d）、地塞米松處理組（62.5 μg/mL，0.2 mL/d），每組4 只；懷孕第12 天（E12），開始對2 組孕鼠分別進(jìn)行連續(xù)3 d（E12～E14）的相應(yīng)處理；懷孕第15 天（E15）分別從每組取出孕鼠，采取胎盤內(nèi)的羊水及胎鼠骨骼肌，分別保存在-20 ℃冰箱和液氮中用于后續(xù)試驗。

1.2.2 糖皮質(zhì)激素（GC）含量的酶聯(lián)免疫測定 將收集的羊水離心后取上清液；酶聯(lián)免疫試劑盒在室溫下平衡1 h，稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，孵育30 min 后洗板；加入酶標(biāo)試劑孵育30 min 后再次洗板；加入顯色液，避光顯色15 min 后測定OD 值。

1.2.3 胎鼠肌肉組織HE 染色觀察 將胎鼠骨骼肌組織放在Bouin's 固定液中固定24 h，流水沖洗過夜；修整組織塊并依次放入梯度酒精脫水；組織塊經(jīng)包埋機(jī)石蠟包埋，然后進(jìn)行切片- 展片- 撈片-烤片；將烤干的切片脫蠟并水化，用蘇木精和醇溶性伊紅進(jìn)行染色，再次脫水后用中性樹膠封片。將切片置于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.4 基因差異表達(dá)分析 根據(jù)GenBank 收錄的小鼠GAPDH、Myostatin、Pax3、Pax7 基因mRNA 序列，利用Primer Premier 5.0 設(shè)計特異性引物，引物序列如表1 所示。引物均由北京華大基因生物技術(shù)有限公司合成。

表1 引物序列

利用Trizol 法提取胎鼠骨骼肌總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并在核酸蛋白測定儀上檢測cDNA 濃度，并稀釋至100 ng/μL。以cDNA 為模板進(jìn)行熒光定量PCR，其中，反應(yīng)體系為10 μL：SYBR Premix Ex Taq TMII（2×）5 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 補(bǔ)足到10 μL。反應(yīng)條件為95 ℃2 min；95 ℃30 s，58 ℃34 s，40 個循環(huán)。

采用2－ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量，其中GAPDH 為內(nèi)參基因。利用SPSS 軟件中的獨立樣本t 檢驗法進(jìn)行分析，用GraphPad Prism 軟件繪圖。

1.2.5 調(diào)控元件的生物信息學(xué)預(yù)測分析 用線上軟件Genomatix 中的MatInspector Program 對小鼠Myostatin、Pax3、Pax7 基因的5′調(diào)控區(qū)元件進(jìn)行預(yù)測分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 孕鼠胎盤羊水中GC 含量變化

采用ELISA 試劑盒檢測孕鼠胎盤羊水中GC含量變化結(jié)果如圖1 所示，地塞米松處理組的GC含量極顯著高于對照組（P＜0.01），表明前期處理時注射的地塞米松進(jìn)入了孕鼠胎盤，可進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.2 胎鼠肌纖維顯微結(jié)構(gòu)的變化

胎鼠骨骼肌HE 染色結(jié)果如圖2 所示，對照組的骨骼肌纖維緊密整齊，地塞米松處理組的骨骼肌纖維稀疏凌亂。表明對孕鼠注射的地塞米松可被胎鼠吸收，并對胎鼠骨骼肌的發(fā)育產(chǎn)生不良影響。

2.3 胎鼠骨骼肌Myostatin、Pax3 和Pax7 的表達(dá)變化

熒光定量檢測胎鼠骨骼肌Myostatin、Pax3 和Pax7 的表達(dá)結(jié)果如圖3 所示，地塞米松處理組Myostatin 的表達(dá)量升高，差異極顯著（P＜0.01）；Pax3 的表達(dá)量降低，差異顯著（P＜0.05）；Pax7 的表達(dá)量下降，差異極顯著（P＜0.01）。

2.4 小鼠Myostatin、Pax3 和Pax7 基因5′調(diào)控區(qū)元件預(yù)測結(jié)果

利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測可知，各基因5′調(diào)控區(qū)存在許多肌肉發(fā)育相關(guān)的調(diào)控元件；經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，Myostatin 基因5′調(diào)控區(qū)存在GRE、PAX7 等元件；Pax3 基因5′調(diào)控區(qū)存在GRE、nGRE（negative GRE）、PAX7 等元件；Pax7 基因5′調(diào)控區(qū)存在GRE、nGRE、PAX3 等元件（圖4）。預(yù)示著糖皮質(zhì)激素可能通過糖皮質(zhì)激素受體（GR）與糖皮質(zhì)激素受體元件（GRE）結(jié)合而直接調(diào)控3 種靶基因的轉(zhuǎn)錄，也可能存在間接的相互調(diào)控關(guān)系。

3 結(jié)論與討論

糖皮質(zhì)激素作為應(yīng)激反應(yīng)的重要參與者以及多種疾病的有效藥物，其對機(jī)體的利害雙重效應(yīng)表現(xiàn)的極其復(fù)雜且不易平衡[16]，特別是對動物和人類胚胎期發(fā)育的負(fù)面影響，一旦發(fā)生便難以補(bǔ)救[17]。有研究表明，母體長期在不良環(huán)境下應(yīng)激或糖皮質(zhì)激素使用不當(dāng)?shù)那闆r下，會對胎兒發(fā)育帶來一定的副作用[18]，這種影響涉及到多個組織器官，其中包括骨骼肌組織。本研究中，ELISA 檢測結(jié)果顯示，地塞米松處理組母鼠羊水中的GC 含量顯著升高，表明地塞米松可通過胎盤屏障作用于胎鼠。通過顯微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，地塞米松處理組胎鼠的骨骼肌肌纖維明顯的發(fā)育不良，表明母體應(yīng)激導(dǎo)致胎鼠肌肉發(fā)育障礙的模型構(gòu)建成功。有研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的地塞米松可以影響成年鼠Myomaker 和MyoD 的表達(dá)[19]，胎兒在子宮內(nèi)過早暴露于糖皮質(zhì)激素，會損害肌肉生長。GOKULAKRISHNAN 等[20]給懷孕第13～21 天的大鼠注射地塞米松的研究發(fā)現(xiàn)，胎鼠Pax7、MyoD和MyoG 的表達(dá)發(fā)生了變化，進(jìn)而抑制了肌祖細(xì)胞增殖，影響了骨骼的形成和發(fā)育。

動物胚胎期骨骼肌的發(fā)育是一個多種因子精細(xì)調(diào)控的復(fù)雜過程，其中，Pax3 是胚胎發(fā)育初期促進(jìn)成肌發(fā)生的重要因子[21-22]，而Myostatin 則是成肌細(xì)胞增殖和分化的負(fù)調(diào)控因子[23]。本試驗中，熒光定量結(jié)果顯示，母體注射地塞米松胎鼠Myostatin的表達(dá)極顯著上調(diào)，而Pax3 表達(dá)顯著下調(diào)，說明糖皮質(zhì)激素對胎兒骨骼肌發(fā)育的抑制作用可能與其調(diào)控了Pax3 和Myostatin 基因的表達(dá)有關(guān)。從出生時的肌肉表型看，Pax7 對胚胎期肌肉的形成和發(fā)育似乎并不是必需的，因為Pax7 基因敲除純合體胎鼠肌肉的發(fā)育在出生前并沒有受到影響[24]。所以，本試驗中，Pax7 基因表達(dá)的顯著下調(diào)應(yīng)該不是導(dǎo)致胎鼠肌纖維發(fā)育受阻的主要原因。但事實上，由于Pax7 會影響胚胎期肌衛(wèi)星細(xì)胞的形成和發(fā)育[25]，其在胚胎期的正常表達(dá)對動物出生后肌肉的發(fā)育和再生至關(guān)重要?？梢姡瞧べ|(zhì)激素在胚胎期對Pax7基因表達(dá)的影響可能會延伸到出生后肌肉的發(fā)育和再生能力。

糖皮質(zhì)激素對基因的轉(zhuǎn)錄激活主要是通過糖皮質(zhì)激素受體（GR）與糖皮質(zhì)激素受體元件（GRE）結(jié)合來介導(dǎo)的[26]。利用生物信息學(xué)軟件對Myostatin、Pax3 和Pax7 的5′調(diào)控區(qū)分析發(fā)現(xiàn)，都存在GRE 元件，Pax3 和Pax7 的5′調(diào)控區(qū)還存在nGRE 元件。因此，糖皮質(zhì)激素對胎鼠骨骼肌中這3 個基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控很可能是一種直接效應(yīng)。當(dāng)然，這種調(diào)控作用也可能是間接的，或者同時存在直接和間接2 種情況，因為通過生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)，2 種轉(zhuǎn)錄因子Pax3 和Pax7 基因5′調(diào)控區(qū)各自存在對方的相應(yīng)元件PAX7 和PAX3，而Myostatin 基因5′調(diào)控區(qū)也預(yù)測到PAX7 元件。這種復(fù)雜的相互調(diào)控機(jī)制還需要通過后續(xù)的體內(nèi)和體外試驗進(jìn)一步證實。

地塞米松處理孕鼠后可以通過胎盤屏障并調(diào)控骨骼肌發(fā)育相關(guān)基因Pax3、Pax7 和Myostatin 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而對胎鼠骨骼肌的發(fā)育造成不良影響，而糖皮質(zhì)激素對相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用可能是直接或（和）間接的。本研究結(jié)果為后續(xù)深入研究家畜母體應(yīng)激對胎兒骨骼肌發(fā)育影響的分子調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，也為防治母體應(yīng)激導(dǎo)致的胎兒骨骼肌發(fā)育受阻提供了理論依據(jù)。