王賽風(fēng)，石玉星，馬東麗，張寶俊，任 璐，趙曉軍

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山西太谷 030801）

利用植物內(nèi)生細(xì)菌防治植物病害是一種行之有效的防治手段[1-2]。目前，其已被廣泛應(yīng)用于經(jīng)濟(jì)作物[3-4]、糧食作物[5-6]和中藥材[7-9]等多種植物真菌病害的防治，包括植物根、莖、葉、花各部病害及采收后果品病害等[10]。內(nèi)生細(xì)菌作為防治植物病害的天然資源菌，具有廣闊的理論研究?jī)r(jià)值和開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景[11-12]。

植物內(nèi)生細(xì)菌為宿主植物提供健康屏障，是植物生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分[13]，也是生防微生物的重要來(lái)源[14]。內(nèi)生細(xì)菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)可以促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，增強(qiáng)寄主植物的抗病能力[15-16]。目前，對(duì)于內(nèi)生細(xì)菌的研究主要集中在發(fā)現(xiàn)新來(lái)源菌株和對(duì)已發(fā)現(xiàn)的植物內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行深入研究。張立新等[17]分析了內(nèi)生細(xì)菌YT-6 對(duì)櫻桃采后灰霉病的抑制效果以及促生特性；李喬曼等[18]對(duì)內(nèi)生細(xì)菌LYM3 進(jìn)行分離鑒定并研究了其抗菌活性物質(zhì)的發(fā)酵條件；姬文秀等[19]從產(chǎn)ACC 脫氨酶的人參中分離出6 株內(nèi)生細(xì)菌，并對(duì)其活性物質(zhì)進(jìn)行了發(fā)酵條件優(yōu)化。目前，有關(guān)甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌的研究在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)以及醫(yī)藥等方面均有報(bào)道[20]。有關(guān)甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌的研究主要集中在菌株的篩選、分類(lèi)鑒定、發(fā)酵條件優(yōu)化及代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定性方面，并且對(duì)其抑菌機(jī)制和生防制劑的開(kāi)發(fā)等進(jìn)行了研究[21-22]。

植物內(nèi)生細(xì)菌MY1 由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物化學(xué)保護(hù)實(shí)驗(yàn)室篩選得到，是一株對(duì)多種植物病原真菌具有良好抑菌活性的生防菌株，經(jīng)鑒定為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）[23]。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)其發(fā)酵條件和抑菌物質(zhì)的穩(wěn)定性進(jìn)行初步研究，旨在明確其最優(yōu)培養(yǎng)條件，為今后更加有效利用菌株MY1 提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株 植物內(nèi)生細(xì)菌MY1 由曼陀羅（Datura stramonium）葉片中分離獲得，經(jīng)初步鑒定為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophic）；植物病原真菌谷瘟病菌（Pyricularia grisea）為指示病原菌，均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物化學(xué)保護(hù)實(shí)驗(yàn)室保存提供。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH[24]。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）：蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，牛肉膏3.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 值7.0[25]。

細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基（LB）：蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，NaCl 10.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 值7.0[25]。

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）：蛋白胨5.0 g，牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 值7.0[24]。

肉湯培養(yǎng)基（CM）：蛋白胨10.0 g，牛肉浸膏5.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 值7.0[25]。

NYBD 培養(yǎng)基：酵母浸膏5 g，牛肉浸膏8 g，葡萄糖10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 值7.0[25]。

BPY 培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，牛肉浸膏5.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖5.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 值7.0[24]。

YSP 培養(yǎng)基：乳糖15.0 g，酵母粉6.25 g，牛肉膏2.5 g，蛋白胨2.5 g，蒸餾水750 mL，pH 值7.0[25]。

1.2 內(nèi)生細(xì)菌MY1 發(fā)酵條件優(yōu)化

1.2.1 種子液的制備 將保存的MY1 菌株接入NA 平板上進(jìn)行活化，28 ℃培養(yǎng)5 d 后接種到LB培養(yǎng)基中，28 ℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，備用。

1.2.2 發(fā)酵濾液的制備 按照1%（V/V）的接種量將制備好的MY1 菌株種子液接入LB 培養(yǎng)基中，28℃、160r/min 振蕩培養(yǎng)72h 后，于4℃、12000r/min離心10 min，棄菌體，收集上清發(fā)酵液，使用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾發(fā)酵液，得到MY1 發(fā)酵濾液，將濾液4 ℃留存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 菌株MY1 生長(zhǎng)曲線(xiàn)的繪制 按照1%（V/V）的接種量將MY1 種子發(fā)酵濾液接入到250 mL LB培養(yǎng)基中，以空白無(wú)菌培養(yǎng)基為對(duì)照，28 ℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，每隔4 h 檢測(cè)一次OD600值，連續(xù)測(cè)量72 h 后結(jié)束。試驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。

1.2.4 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選 按照1%（V/V）的接種量將MY1 種子發(fā)酵液分別接入到250 mL BPY、CM、LB、NB、NYBD、YSP 培養(yǎng)基中，以空白無(wú)菌培養(yǎng)基作為對(duì)照，28 ℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)；分別測(cè)定培養(yǎng)24、48、72 h 的菌體生長(zhǎng)量及發(fā)酵終止后抑菌物質(zhì)積累量，確定最佳基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1.2.4.1 菌體生長(zhǎng)量測(cè)定 采用比濁法，使用分光光度計(jì)測(cè)定發(fā)酵液的OD600值，作為菌體生長(zhǎng)量。以不接菌的培養(yǎng)基作對(duì)照，每組重復(fù)3 次。

1.2.4.2 發(fā)酵濾液抑菌物質(zhì)活性測(cè)定 以Pyricularia grisea 為靶標(biāo)菌，采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定抑菌物質(zhì)的積累量。用直徑為5 mm 的打孔器在生長(zhǎng)7 d的Pyricularia grisea 菌落邊緣打取菌餅；按照1∶9（V∶V）比例將發(fā)酵濾液和PDA 培養(yǎng)基混勻制備平板；待平板培養(yǎng)基凝固后，接入Pyricularia grisea 菌餅，25 ℃恒溫倒置培養(yǎng)。以空白PDA 培養(yǎng)基接種Pyricularia grisea 為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3 次。培養(yǎng)7 d 后，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑菌率。

1.2.5 最優(yōu)碳源的篩選 將蔗糖、葡萄糖、甘露醇、麥芽糖、果糖、可溶性淀粉、乳糖分別加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，配成質(zhì)量濃度為5 g/L 含不同碳源的液體培養(yǎng)基。將MY1 種子發(fā)酵液按照1%的接種量接種到上述培養(yǎng)基，以空白無(wú)菌培養(yǎng)基作為對(duì)照，置于28 ℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)。按照1.2.4 的方法確定最優(yōu)碳源。

1.2.6 最優(yōu)氮源的篩選 固定碳源為1.2.5 篩選出的最優(yōu)碳源，將蛋白胨、尿素、酵母粉和牛肉膏混配、牛肉膏和蛋白胨混配、胰蛋白胨和牛肉膏混配、蛋白胨和酵母粉混配、酵母粉和胰蛋白胨混配、牛肉膏、蛋白胨和酵母粉三者混配分別加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，配成質(zhì)量濃度為5 g/L 含不同氮源的液體培養(yǎng)基。以空白無(wú)菌培養(yǎng)基作為對(duì)照，按照1%的接種量接種到上述培養(yǎng)基中，置于28 ℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)。按照1.2.4 的方法確定最優(yōu)氮源。

1.2.7 最佳發(fā)酵溫度的篩選 分別以1.2.4、1.2.5、1.2.6 篩選出的基礎(chǔ)培養(yǎng)基、最優(yōu)碳源、最優(yōu)氮源配制培養(yǎng)基，按照1%的接種量接種MY1 種子發(fā)酵液。以空白無(wú)菌培養(yǎng)基作為對(duì)照，將接種后的滅菌培養(yǎng)基分別放置在26、28、30、35 ℃下，160 r/min 振蕩培養(yǎng)。按照1.2.4 的方法確定最佳發(fā)酵溫度。

1.2.8 發(fā)酵條件的正交優(yōu)化 通過(guò)正交試驗(yàn)L16（45）對(duì)菌株MY1 發(fā)酵濾液的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化（表1），每個(gè)處理重復(fù)3 次。按照1.2.4 的方法確定內(nèi)生細(xì)菌MY1 發(fā)酵的最佳pH、裝液量、接種量、轉(zhuǎn)速、發(fā)酵時(shí)間。

1.3 內(nèi)生細(xì)菌MY1 抑菌物質(zhì)穩(wěn)定性測(cè)定

1.3.1 熱穩(wěn)定性測(cè)定 分別將10 mL 制備的MY1發(fā)酵濾液放置于溫度為20、40、60、80、100、121 ℃水浴中處理30 min；靜置冷卻至室溫，后采用1.2.4所述方法測(cè)定其抑菌率。

1.3.2 酸堿穩(wěn)定性測(cè)定 用1 mol/L HCl 和1 mol/L NaOH 溶液，分別調(diào)整10 mL 制備的MY1 發(fā)酵濾液pH 值為1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0，室溫下靜置3 h，后調(diào)整pH 值為7.0，采用1.2.4 所述方法測(cè)定其抑菌率。

1.3.3 紫外輻射穩(wěn)定性測(cè)定 分別取10 mL 制備的MY1 發(fā)酵濾液置于7 個(gè)滅菌培養(yǎng)皿，而后分別置于18 W 紫外燈（254 nm）下10 cm 處照射2、4、6、8、10、12 h，以未經(jīng)照射處理的發(fā)酵濾液作為對(duì)照，采用1.2.4 所述方法測(cè)定其抑菌率。

1.3.4 光穩(wěn)定性測(cè)定 分別取10 mL 制備的MY1菌株發(fā)酵濾液，置于6 個(gè)滅菌培養(yǎng)皿中，分別在光照下照射6、12、24、36、48 h，以未經(jīng)照射處理的發(fā)酵濾液作為對(duì)照，采用1.2.4 所述方法測(cè)定其抑菌率。

1.3.5 貯存穩(wěn)定性測(cè)定 分別將10 mL 制備的MY1 發(fā)酵濾液黑暗條件下貯存在室溫和4 ℃冰箱中；在貯存的第7、15、30、60 天時(shí)取樣，采用1.2.4所述方法測(cè)定其抑菌率。同時(shí)以制備好的新鮮發(fā)酵濾液作為對(duì)照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2003 進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差分析并繪制圖表；采用SPSS Statistics 17.0 軟件進(jìn)行Duncan's 新復(fù)極差法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)差異顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細(xì)菌MY1 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 菌株MY1 的生長(zhǎng)曲線(xiàn) 在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，MY1 菌株在0～12 h 生長(zhǎng)緩慢；在12～32 h 生長(zhǎng)迅速；在32～56 h 處于生長(zhǎng)穩(wěn)定期，生長(zhǎng)變化沒(méi)有明顯波動(dòng)，基本持平；在56 h 時(shí)，菌體生長(zhǎng)量達(dá)到最大值，56 h 后出現(xiàn)緩慢衰退現(xiàn)象（圖1）。

2.1.2 菌株MY1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選 菌株MY1在不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況明顯不同；在培養(yǎng)72 h后，菌株MY1 生長(zhǎng)量從小到大依次為NB 培養(yǎng)基（1.060）＜CM培養(yǎng)基（1.286）＜LB 培養(yǎng)基（1.561）＜NYBD 培養(yǎng)基（2.178）＜YSP 培養(yǎng)基（2.312）＜BPY培養(yǎng)基（2.397），OD600值在BPY 培養(yǎng)基中最大，在NB 培養(yǎng)基中最小，且BPY 培養(yǎng)基除與YSP 培養(yǎng)基無(wú)顯著差異外，與其他各培養(yǎng)基均有顯著差異（P＜0.05）。

由圖2 可知，所用基礎(chǔ)培養(yǎng)基不同，菌株MY1發(fā)酵濾液對(duì)Pyricularia grisea 的抑制率也明顯不同；培養(yǎng)72 h 后，菌株MY1 發(fā)酵濾液的抑菌率從小到大依次為NB 培養(yǎng)基（66.60%）＜CM 培養(yǎng)基（79.65%）＜LB 培養(yǎng)基（87.74%）＜YSP 培養(yǎng)基（89.36%）＜NYBD 培養(yǎng)基（89.41%）＜BPY 培養(yǎng)基（92.68%），發(fā)酵濾液的抑菌率在BPY 培養(yǎng)基中最高，在NB 培養(yǎng)基中最低，且在BPY 培養(yǎng)基中顯著高于CM 培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基和NB 培養(yǎng)基（P＜0.05）。因此，菌株MY1 的最佳基礎(chǔ)培養(yǎng)基為BPY培養(yǎng)基。

2.1.3 菌株MY1 最佳碳源的篩選 由圖3 可知，MY1 菌株在不同碳源培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況出現(xiàn)明顯差異；培養(yǎng)72 h 后，不同培養(yǎng)基中MY1 的生長(zhǎng)量從小到大依次為可溶性淀粉（1.597）＜蔗糖（2.352）＜葡萄糖（2.448）＜甘露醇（2.510）＜麥芽糖（2.527）＜乳糖（2.531）＜果糖（2.607），OD600值（菌體生長(zhǎng)量）在以果糖為碳源的培養(yǎng)基中最大，以乳糖為碳源的培養(yǎng)基中次之，以可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基中最小，且以果糖為碳源的菌體生長(zhǎng)量顯著高于其他碳源（P＜0.05），而以可溶性淀粉為碳源的菌體生長(zhǎng)量顯著低于其他（P＜0.05）。

在不同碳源的培養(yǎng)基中，MY1 發(fā)酵濾液對(duì)P.grisea 的抑制率也出現(xiàn)明顯差異；培養(yǎng)72 h 后，抑菌率從小到大依次為麥芽糖（93.96%）＜蔗糖（94.90%）＜葡萄糖（95.75%）＜果糖（97.34%）＜乳糖（100%）＝甘露醇（100%）＝可溶性淀粉（100%）（圖3），發(fā)酵濾液的抑菌率在以乳糖、甘露醇、可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基中最大，且以乳糖、甘露醇、可溶性淀粉為碳源的發(fā)酵濾液的抑菌率著顯著高于其他碳源（P＜0.05）。因此，菌株MY1 的最優(yōu)碳源為乳糖。

2.1.4 菌株MY1 最佳氮源的篩選 MY1 菌株在不同氮源培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)情況出現(xiàn)明顯差異（圖4）；培養(yǎng)72 h 后，不同培養(yǎng)基中MY1 的生長(zhǎng)量從小到大依次為尿素（0.024）＜蛋白胨（0.405）＜牛肉膏和胰蛋白胨混配（2.369）＜牛肉膏和蛋白胨混配（2.384）＜胰蛋白胨和酵母粉混配（2.466）＜蛋白胨和酵母粉混配（2.534）＜牛肉膏、酵母粉和蛋白胨混配（2.612）＜牛肉膏和酵母粉混配（2.619），相比其他幾種混配，OD600值在以牛肉膏和酵母粉混配為氮源的培養(yǎng)基中最大，在以尿素為氮源的培養(yǎng)基中最小，且菌體生長(zhǎng)量在以牛肉膏和酵母粉混配為氮源時(shí)顯著高于其他氮源（P＜0.05），在以尿素為氮源時(shí)顯著低于其他氮源（P＜0.05）。

在不同氮源的培養(yǎng)液中，菌株MY1 發(fā)酵濾液對(duì)Pyricularia grisea 的抑制率也出現(xiàn)明顯差異（圖4）；培養(yǎng)72 h 后，不同培養(yǎng)基中MY1 發(fā)酵濾液的抑菌率從小到大依次為尿素（4.22%）＜蛋白胨（68.73%）＜牛肉膏和胰蛋白胨混配（91.50%）＜蛋白胨和酵母粉混配（93.59%）＜牛肉膏和蛋白胨混配（99.79%）＜牛肉膏、酵母粉混配（100%）＝胰蛋白胨和酵母粉混配（100%）＝牛肉膏、酵母粉和蛋白胨混配（100%），相比其他幾種混配方式，發(fā)酵濾液的抑菌率在以牛肉膏、酵母粉混配，胰蛋白胨和酵母粉混配，牛肉膏、酵母粉和蛋白胨混配為氮源的培養(yǎng)液中最高，在以尿素為氮源的培養(yǎng)液中最小。因此，菌株MY1 的最優(yōu)氮源為牛肉膏和酵母粉混配，且以牛肉膏和酵母粉混配、牛肉膏和蛋白胨混配、胰蛋白胨和酵母粉混配以及牛肉膏、酵母粉和蛋白胨混配為氮源的發(fā)酵濾液的抑菌率均顯著高于其他氮源（P＜0.05），在以尿素為氮源的發(fā)酵濾液的抑菌率顯著低于其他氮源（P＜0.05）。

2.1.5 菌株MY1 最佳發(fā)酵溫度的篩選 從圖5 可以看出，MY1 菌株在不同溫度條件下生長(zhǎng)量差異顯著，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)生長(zhǎng)量整體呈增加狀態(tài)；培養(yǎng)72 h 后，不同培養(yǎng)液中MY1 的生長(zhǎng)量從小到大依次為30 ℃（2.659）＜25 ℃（2.689）＜35 ℃（2.724）＜28 ℃（2.779），在28 ℃發(fā)酵的培養(yǎng)液中的菌體生長(zhǎng)量（OD600）最大，且菌體生長(zhǎng)量在溫度為28 ℃時(shí)顯著高于其他溫度（P＜0.05）。

不同溫度條件下培養(yǎng)的MY1 發(fā)酵濾液對(duì)Pyricularia grisea 的抑制率差異顯著（圖5），其中，28 ℃抑菌率最高，35 ℃抑菌率最低；培養(yǎng)72 h 后，菌株MY1 的抑菌率從小到大依次為35 ℃（91.76%）＜25 ℃（95.44%）＜30 ℃（95.83%）＜28 ℃（99.50%），且發(fā)酵濾液的抑菌率在溫度為28 ℃時(shí)顯著高于其他溫度條件（P＜0.05）。綜合判斷，菌株MY1 的最佳發(fā)酵溫度為28 ℃。

2.1.6 菌株MY1 發(fā)酵條件的優(yōu)化 不同試驗(yàn)條件組合對(duì)MY1 菌株生長(zhǎng)量影響的結(jié)果表明（表2），第5 組的OD600值最高，即第5 組的菌體生長(zhǎng)量最好。根據(jù)極差分析可得，5 個(gè)設(shè)計(jì)因素中，pH（A）對(duì)MY1 生長(zhǎng)量影響程度最大，接種量（C）的影響程度最小（表3）。因此，選擇的最佳組合為A4B1C4D3E4，即pH 值9.0，裝液量100 mL/500 mL，接種量5%，轉(zhuǎn)速160 r/min，發(fā)酵時(shí)間96 h。

表2 MY1 菌株發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)分析（OD600）

正交試驗(yàn)中，不同試驗(yàn)條件組合對(duì)菌株MY1發(fā)酵濾液抑菌活性物質(zhì)影響的結(jié)果表明，抑菌效果最好的試驗(yàn)組合是第5、9、11、14 組（表3）。根據(jù)極差分析可得，5 個(gè)設(shè)計(jì)因素中，pH（A）對(duì)菌株MY1發(fā)酵濾液對(duì)Pyricularia grisea 抑菌活性影響程度最大，裝液量（B）最小。因此，選擇的最佳組合為A4B1C2D2E2，即pH 9.0，裝液量100 mL/500 mL，接種量2%，轉(zhuǎn)速130 r/min，發(fā)酵時(shí)間48 h（表3）。

表3 MY1 菌株發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)分析（抑菌率）

綜合成本和方差分析結(jié)果可知，最優(yōu)的發(fā)酵條件為pH 值9.0，裝液量100 mL/500 mL，接種量2%，轉(zhuǎn)速160 r/min，發(fā)酵時(shí)間96 h。

2.2 內(nèi)生細(xì)菌MY1 代謝物穩(wěn)定性測(cè)定

2.2.1 熱穩(wěn)定性測(cè)定 在20～60 ℃溫度范圍內(nèi)處理30 min 后，菌株MY1 發(fā)酵濾液對(duì)Pyricularia grisea的抑菌活性趨于穩(wěn)定；但當(dāng)溫度上升到60 ℃后，開(kāi)始出現(xiàn)抑菌活性降低的現(xiàn)象；當(dāng)溫度處在80 ℃和100 ℃時(shí)，抑菌活性雖降低但較穩(wěn)定，且發(fā)酵濾液的抑菌率在20～80 ℃時(shí)顯著高于其他（P＜0.05），當(dāng)溫度達(dá)到100、121 ℃時(shí)，雖出現(xiàn)明顯差異但抑菌率仍較高。因此，說(shuō)明菌株MY1 抑菌活性物質(zhì)的熱穩(wěn)定性良好（圖6）。

2.2.2 酸堿穩(wěn)定性測(cè)定 從圖7 可以看出，菌株MY1 發(fā)酵濾液的最佳抑菌活性是在中性（pH 值7.0）條件下，當(dāng)發(fā)生酸堿性變化時(shí)，菌株MY1 的抑菌活性雖下降但仍然保持在90%，發(fā)酵濾液的抑菌率在pH 值為7.0 時(shí)顯著高于其他（P＜0.05）。因此，說(shuō)明菌株MY1 抑菌活性物質(zhì)具有較好的pH 穩(wěn)定性。

2.2.3 紫外輻射穩(wěn)定性測(cè)定 紫外燈照射延長(zhǎng)到10 h 后，菌株MY1 發(fā)酵濾液對(duì)Pyricularia grisea 的抑制率與最佳抑菌率相比雖然有所降低，但差異不顯著（P＞0.05）（圖8）。因此，證明菌株MY1 抑菌活性物質(zhì)在紫外燈照射下穩(wěn)定性較強(qiáng)，并無(wú)分解或改變。

2.2.4 光穩(wěn)定性測(cè)定 當(dāng)自然光照射時(shí)間連續(xù)增加，菌株MY1 發(fā)酵濾液對(duì)Pyricularia grisea 的抑制活性雖然降低但維持穩(wěn)定；在連續(xù)照射48 h 后抑制率仍處于較高水平，且與6 h 差異不顯著（P＞0.05）（圖9）。因此，證明菌株MY1 在自然光照射下，抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定，并無(wú)分解或改變。

2.2.5 貯存穩(wěn)定性測(cè)定 由圖10 可知，在室溫條件下，發(fā)酵濾液有較好的貯存穩(wěn)定性，不同貯藏時(shí)間間差異不顯著；在4 ℃冷藏條件下，隨著貯存時(shí)間開(kāi)始增加，菌株MY1 發(fā)酵濾液對(duì)Pyricularia grisea的抑菌活性逐漸降低，且60 d 與7d 間差異顯著（P＜0.05）。貯存時(shí)間為60 d 時(shí)，冷藏條件對(duì)Pyricularia grisea 的抑菌率雖降低，但抑菌率值仍較高，超過(guò)80%以上，與15 d 間差異不顯著。因此，證明菌株MY1 抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性強(qiáng)，可耐長(zhǎng)期貯存。

3 結(jié)論與討論

利用生防菌株代謝產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)防治植物病害，是生物防治中常用的方法。本試驗(yàn)通過(guò)設(shè)置MY1 菌株的不同發(fā)酵條件，結(jié)果篩選出BPY培養(yǎng)基是最佳基礎(chǔ)培養(yǎng)基，乳糖是最優(yōu)碳源，酵母粉和牛肉膏是最優(yōu)氮源。菌株MY1 最適培養(yǎng)溫度為28 ℃，發(fā)酵濾液菌體生長(zhǎng)量在56 h 達(dá)到最高。選擇pH、裝液量、接種量、轉(zhuǎn)速、發(fā)酵時(shí)間5 個(gè)因素對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)一步優(yōu)化后，明確最佳發(fā)酵條件是轉(zhuǎn)速160 r/min、發(fā)酵時(shí)間96 h、接種量2%、裝液量100 mL/500 mL、pH 值9.0。

關(guān)于甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌的報(bào)道，尹向田等[26]從水稻根系土壤中篩選出甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌GSBM05，對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化后，其最適發(fā)酵培養(yǎng)基為：2.0%可溶性淀粉，2.0%豆粕，3.0%酵母粉，0.3% NaCl，3% CaCO3，最佳發(fā)酵條件：培養(yǎng)溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速150 r/min、裝液量90 mL/250 mL、培養(yǎng)時(shí)間72 h、初始pH 值7.0。詹藝舒等[27]從空氣中分離出抑菌效果良好的甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌Z21，經(jīng)對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化后，確定的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖20.0 g/L，硝酸鈉20.0 g/L，硫酸鎂6 g/L，最適發(fā)酵條件：發(fā)酵溫度35 ℃，發(fā)酵時(shí)間48 h。菌株來(lái)源不同或宿主所處的生存環(huán)境不同，都可能會(huì)造成最適發(fā)酵條件不同，其根本原因仍需今后深入探討。對(duì)于發(fā)酵條件的優(yōu)化和改進(jìn)以及通過(guò)發(fā)酵罐放大試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證發(fā)酵參數(shù)和發(fā)酵條件等[28]，正在進(jìn)一步研究中。

在不同溫度、pH、紫外線(xiàn)照射、自然光照射、室溫和冷藏貯存處理后，菌株MY1 抑菌活性物質(zhì)仍可保持良好的抑菌活性，說(shuō)明MY1 產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)理化性質(zhì)穩(wěn)定。目前，甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌代謝產(chǎn)物多樣，主要有抗菌蛋白、抗菌肽、纖維素酶、β-1，3- 葡聚糖酶、嗜鐵素等，但菌株MY1 抑菌成分還需進(jìn)一步驗(yàn)證[20]。本研究通過(guò)對(duì)菌株MY1 發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化并對(duì)其抑菌物質(zhì)的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，結(jié)果有利于增加菌株MY1 抗菌活性物質(zhì)的產(chǎn)量，可為下一步活性物質(zhì)的分離提取和結(jié)構(gòu)鑒定以及生防菌劑的制備提供理論依據(jù)，為微生物農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)和田間推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。