羅志榮，龐揚(yáng)海，黃敏興*，曾秋霞，高裕鋒

(1廣東省科學(xué)院生物與醫(yī)學(xué)工程研究所，廣東廣州510316；2中國(guó)輕工業(yè)甘蔗制糖工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510316)

0 前言

甘蔗富含糖分，是我國(guó)最主要的制糖原料，也是人們喜愛(ài)食用的水果之一[1-4]。甘蔗的收成季節(jié)正值冬春季，尤其是在春季，雨水多，濕度大，甘蔗儲(chǔ)存不當(dāng)容易霉變，產(chǎn)生3-硝基丙酸(3-NPA)。3-硝基丙酸是一種神經(jīng)性毒素，可損害人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)，低劑量攝入人體后，即可致嘔吐、暈眩、抽搐、昏迷，甚至死亡[5-7]，因此對(duì)甘蔗中3-硝基丙酸的準(zhǔn)確測(cè)定要求較高。目前3-硝基丙酸的檢測(cè)方法有液相色譜法[8]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[9]，相對(duì)于色譜法，質(zhì)譜法靈敏度更好，準(zhǔn)確性更高。為檢查分析結(jié)果質(zhì)量、度量分析結(jié)果可信性，有必要對(duì)甘蔗中3-硝基丙酸進(jìn)行不確定度評(píng)定。通過(guò)不確定度評(píng)定，可以有效分析檢驗(yàn)過(guò)程中影響結(jié)果準(zhǔn)確性的因素，提出降低結(jié)果不確定性的方法[10]。

本文參照胡重怡等[11]建立的甘蔗中3-硝基丙酸的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，對(duì)甘蔗樣品中3-硝基丙酸進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)國(guó)家計(jì)量技術(shù)規(guī)范JJF 1059.1-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[12]的要求對(duì)測(cè)量結(jié)果的不確定度進(jìn)行評(píng)定，通過(guò)建立數(shù)學(xué)模型對(duì)各個(gè)不確定度分量進(jìn)行計(jì)算，找出影響甘蔗中3-硝基丙酸檢測(cè)準(zhǔn)確性的主要因素。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

主要儀器：AB 5500 Q-Trap超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)AB SCIEX公司)；Multi Reax多位渦旋振蕩器(德國(guó)Heidolph公司)；N-EVAP112氮吹儀(美國(guó)Organomation公司)；CL5R大容量冷凍離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；SB25-12 DTD超聲清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；UPC-I-60L型超純水機(jī)(成都超純科技有限公司)。

主要試劑：甲醇、乙腈、丙酮(色譜純，德國(guó)默克公司)；甲酸(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)；氨水、氯化鈉(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)；3-硝基丙酸(99.99%，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；PSA固相萃取柱(6 mL，500 mg，美國(guó)Waters公司)。

1.2 測(cè)定方法

稱(chēng)取2 g甘蔗試樣于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，渦旋混勻，超聲20 min，加入5 g氯化鈉，混合均勻后，超聲10 min，10000 r/min離心5 min，收集上清液；用6 mL乙腈活化PSA固相萃取柱，將10 mL上清液過(guò)柱，用10 mL 1%氨水甲醇洗脫，收集洗脫液，氮吹至近干，用0.5%甲酸水溶液定容至5.0 mL，過(guò)濾膜，用于UPLC-MS/MS分析。

2 建立數(shù)學(xué)模型

通過(guò)對(duì)一系列已知濃度的3-硝基丙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定，根據(jù)測(cè)定的一系列響應(yīng)峰面積，儀器自動(dòng)以最小二乘回歸法作出濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，見(jiàn)公式⑴和公式⑵。

式中：A-峰面積；c-濃度；b-斜率；a-截距。

式中：w-樣品中3-硝基丙酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，μg/kg；ci-待測(cè)溶液中3-硝基丙酸的質(zhì)量濃度，μg/L；V-樣品定容體積，mL；m-樣品質(zhì)量，g；n-重復(fù)測(cè)定次數(shù)。

3 測(cè)量甘蔗中3-硝基丙酸的不確定度來(lái)源分析

測(cè)量不確定度是與測(cè)量結(jié)果緊密關(guān)聯(lián)的參數(shù)，能夠合理地賦予被測(cè)值的分散性，而該分散性主要包括A類(lèi)不確定度、B類(lèi)不確定度和合成不確定度。根據(jù)數(shù)學(xué)模型和測(cè)量過(guò)程，甘蔗中3-硝基丙酸的不確定度來(lái)源包括(如圖1所示)：①稱(chēng)樣過(guò)程引入的不確定度urel(m1)，來(lái)源于電子天平的精度；②樣品定容過(guò)程引入的不確定度urel(V)，來(lái)源于定容容器的體積誤差和讀數(shù)誤差；③3-硝基丙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱(chēng)量引入的不確定度urel(m2)，來(lái)源于電子天平的精度；④3-硝基丙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度urel(c)；⑤標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度urel(b)，來(lái)源于稀釋過(guò)程溶液移取器皿和定容容器的體積誤差和讀數(shù)誤差； ⑥標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合的不確定度urel(l)；⑦測(cè)量甘蔗中3-硝基丙酸產(chǎn)生的不確定度urel(n)，來(lái)源于重復(fù)性測(cè)量引入的不確定度。

圖1 測(cè)定甘蔗中3-硝基丙酸含量的不確定度來(lái)源

4 不確定度分量評(píng)定

4.1 樣品稱(chēng)量的不確定度urel(m1)

樣品稱(chēng)量使用精度為0.01 g的電子天平，稱(chēng)樣量為2.00 g，查天平檢定證書(shū)，U=0.02，k=2，相對(duì)不確定度為urel(m1)=0.02/2.00/2=5.00×10-3。

4.2 樣品定容引入的不確定度urel(V)

按照J(rèn)JG 196-2006《常規(guī)玻璃量器檢定規(guī)程》[13]的規(guī)定，5 mL A級(jí)單標(biāo)線(xiàn)吸量管容量允差為±0.0015 mL，按照矩形分布，不確定度為0.0015/=8.66×10-3；定容時(shí)估讀誤差±0.005 mL，引起的不確定度0.005/=2.89×10-3，其相對(duì)不確定度為：

4.3 3-硝基丙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱(chēng)量引入的不確定度urel(m2)

3-硝基丙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱(chēng)量使用精度為0.00001 g的電子天平，稱(chēng)樣量為0.01000 g，查天平檢定證書(shū)，U=0.00003，k=2，其相對(duì)不確定度為urel(m2)=0.00003/2/0.01000=1.50×10-3。

4.4 3-硝基丙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度urel(c)

3-硝基丙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)中給出的純度為99.30%，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為±0.05%，k=2，因此相對(duì)不確定度為：urel(c)=0.05/2/99.30=2.52×10-4。

4.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液引入不確定度urel(b)

⑴配制3-硝基丙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液產(chǎn)生的不確定度：稱(chēng)量0.01000 g 3-硝基丙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇溶解，并用10 mL(V0)容量瓶定容，得到1000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

⑵配置標(biāo)準(zhǔn)使用液產(chǎn)生的不確定度：在本實(shí)驗(yàn)中，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)的濃度分別為20、10、5、1、0.5、0.1 μg/L。以10 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程為例：用1 mL移液管準(zhǔn)確吸取 3-硝基丙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1000 μg/mL)1 mL于10 mL容量瓶中，定容至刻度，得到100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液；再用1 mL移液管準(zhǔn)確吸取3-硝基丙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL)1 mL于10 mL容量瓶中，定容至刻度，得到10 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液；再用1 mL移液管準(zhǔn)確吸取3-硝基丙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 μg/mL)1 mL于10 mL容量瓶中，定容至刻度，得到1 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液；再用1 mL移液管準(zhǔn)確吸取3-硝基丙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 μg/mL)1 mL于10 mL容量瓶中，定容至刻度，得到100 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液；再用1 mL移液管準(zhǔn)確吸取3-硝基丙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/L)1 mL于10 mL容量瓶中，定容至刻度，得到10 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液。3-硝基丙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度計(jì)算公式如式⑷所示。

其中：c1-3-硝基丙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(10 μg/L)；c-3-硝基丙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度(1000 μg/mL)；V移1-1 mL移液管的體積；V移2-1 mL移液管的體積；V移3-1 mL移液管的體積；V移4-1 mL移液管的體積；V移5-1 mL移液管的體積；V容1-10 mL容量瓶的體積；V容2-10 mL容量瓶的體積；V容3-10 mL容量瓶的體積；V容4-10 mL容量瓶的體積；V容5-10 mL容量瓶的體積；1 mL移液管和10 mL容量瓶的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V3)計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表1，其相對(duì)不確定度見(jiàn)式⑸。

表1 移液管、容量瓶的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量

4.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)最小二乘法擬合引入的不確定度urel(l)

制備3-硝基丙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，配制的6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)濃度，分別平行進(jìn)樣測(cè)定2次，峰面積見(jiàn)表2，擬合曲線(xiàn)方程為y=5954.1x+1898.6，因此a=1898.6，b=5954.1。發(fā)霉甘蔗樣品中3-硝基丙酸含量重復(fù)測(cè) 定數(shù)據(jù)見(jiàn)表3(n=10)。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)峰面積-濃度值

表3 某發(fā)霉甘蔗樣品中3-硝基丙酸含量測(cè)定結(jié)果(n=10)

樣品中3-硝基丙酸平均濃度c0,=30.44 μg/L，計(jì)算得到甘蔗中3-硝基丙酸含量為152.20 μg/kg。標(biāo)準(zhǔn)溶液平均濃度為ˉc=(1+5+10+20+50+100)/6=31.0 μg/kg。urel(l)的計(jì)算公式為式⑹，殘差標(biāo)準(zhǔn)差S計(jì)算公式為式⑺，x的離差平方和Sxx計(jì)算公式為式⑻。

其中：n-測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)溶液的次數(shù)，n=12；p-測(cè)試樣品的次數(shù)，p=10；c-各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的平均值，c=31.0 μg/kg；c0,-樣品濃度的平均值，c0,=30.44 μg/L；b-標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率，b=593.7；a-標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)截距，a=217.7；i-下標(biāo)，第幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液；j-下標(biāo)，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)量次數(shù)。代入數(shù)值計(jì)算得到urel(l)=4.59×10-3。

4.7 重復(fù)測(cè)量引入的不確定度urel(n)

單次測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

實(shí)際測(cè)量時(shí)在重復(fù)性試驗(yàn)條件下獨(dú)立測(cè)定樣品10次(2個(gè)平行)的平均值作為檢測(cè)結(jié)果，平均值為30.44 μg/L，因此測(cè)量重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

因此相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.8 計(jì)算合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

各個(gè)不確定度分量計(jì)算值見(jiàn)表4，樣品標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和重復(fù)性測(cè)定引入的不確定度是不確定度的主要來(lái)源。合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

表4 甘蔗中3-硝基丙酸測(cè)定相對(duì)不確定度分量評(píng)定結(jié)果

4.9 擴(kuò)展不確定度表示方法

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為uc=uc,rel×w=3.82×10-2×152.20=5.81 μg/kg。在95%置信水平下，包含因子取k=2，擴(kuò)展不確定度為U=k×uc=2×5.81=11.62 μg/kg。實(shí)際甘蔗樣品的測(cè)定結(jié)果可表示為(152.20±11.62) μg/kg，k=2。

5 結(jié)論

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定甘蔗中3-硝基丙酸含量的過(guò)程中，影響3-硝基丙酸測(cè)定結(jié)果的不確定度主要來(lái)源為標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)的配制和重復(fù)性測(cè)定。因此優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)配制的步驟和規(guī)范前處理減少重復(fù)誤差是減小不確定度的有效方法。