蔡 睿 王維鐵

（吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，長春130021）

2017年中國疾病負(fù)擔(dān)研究報(bào)告顯示缺血性心臟病是我國排名第二位的導(dǎo)致人群壽命損失的疾病，死亡率大約為123.9/10萬，占總死亡人數(shù)的16.7%[1］。目前經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入（percutaneous coronary intervention，PCI）是治療缺血性心臟病的一種主要手段，但是PCI術(shù)后支架內(nèi)再狹窄（instent restenosis，ISR）成為了影響遠(yuǎn)期生存率的一種主要并發(fā)癥[2］。有研究指出，新生內(nèi)膜增生是ISR發(fā)生的主要病理改變[3］，但針對(duì)支架內(nèi)新生內(nèi)膜增生治療并未達(dá)到預(yù)期的效果[4］。因此ISR分子發(fā)病機(jī)制及基因靶向治療需要繼續(xù)探索。本研究通過基因測序及高通量生物信息學(xué)分析的方法對(duì)PCI術(shù)后ISR的機(jī)制進(jìn)行研究，以期尋找到ISR發(fā)病的核心基因及分子通路，為后續(xù)的血清學(xué)診療標(biāo)志物及藥物治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 基因測序?qū)ο笈c分組 GEO數(shù)據(jù)庫搜索與PCI術(shù)后ISR相關(guān)的基因測序結(jié)果，選取GSE46560為研究對(duì)象（11例印度人樣本）。其中6例PCI術(shù)后ISR患者作為研究組，5例PCI術(shù)后支架內(nèi)未狹窄的患者作為對(duì)照組。其中研究組男性5例，女性1例，平均年齡為（60.33±16.10）歲。對(duì)照組男性4例，女性1例，平均年齡為（60.40±10.53）歲。Trizol法提取全部患者空腹外周血RNA，然后檢測RNA的質(zhì)量和純度，其中純度的檢測標(biāo)準(zhǔn)為1.8≤260/280≤2.1。將符合標(biāo)準(zhǔn)的RNA進(jìn)行基因測序，測序結(jié)果詳見GEO數(shù) 據(jù) 庫（GSE46560，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc=GSE46560）。

1.2 高通量生物信息分析方法 對(duì)基因測序的原始數(shù)據(jù)采用R語言及l(fā)imma數(shù)據(jù)包進(jìn)行均一化校準(zhǔn)，刪除差異表達(dá)量過大或者過小的基因。其后應(yīng)用GEO2R計(jì)算模塊篩選差異基因。對(duì)篩選的差異基因應(yīng)用GraphPad Prism 7繪制火山圖進(jìn)行可視化處理，其后應(yīng)用基因熱圖在TBtools軟件進(jìn)行聚類分析。將全部差異基因應(yīng)用DAVID在線軟件進(jìn)行基因符號(hào)轉(zhuǎn)換及KEGG信號(hào)通路的預(yù)測。全部差異表達(dá)基因符號(hào)輸入蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）在線分析軟件，進(jìn)行基因互作關(guān)系預(yù)測，并將預(yù)測結(jié)果輸入Cyto‐scape軟件進(jìn)行可視化處理。對(duì)全部差異基因間的互作關(guān)系進(jìn)一步生物信息學(xué)分析，應(yīng)用cytohubba軟件（Cytoscape內(nèi)置應(yīng)用）預(yù)測核心發(fā)病基因，對(duì)排名前10位的發(fā)病基因再次進(jìn)行聚類分析，根據(jù)Degree評(píng)分篩選出分?jǐn)?shù)最高的基因。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有原始數(shù)據(jù)用R語言軟件進(jìn)行分析。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)位差異倍數(shù)≥2以及P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。KEGG信號(hào)通路富集基因最少為2且P<0.05。PPI篩選標(biāo)準(zhǔn)為基因間聯(lián)系>0.4。

2 結(jié)果

2.1 基因測序原始數(shù)據(jù)矯正 對(duì)總共49395個(gè)編碼基因進(jìn)行檢測，原始數(shù)據(jù)結(jié)果均一性較差（圖1A）。隨后應(yīng)用R語言及l(fā)imma包進(jìn)行數(shù)據(jù)均一化處理，篩除離散度較大的數(shù)據(jù)，校準(zhǔn)后的數(shù)據(jù)均一性較好（圖1B）。

圖1 基因芯片原始數(shù)據(jù)分析Fig.1 Analysis of microarray raw data

2.2 GEO2R篩選均一化處理后的數(shù)據(jù) 其中差異上調(diào)表達(dá)的基因96個(gè)，差異下調(diào)表達(dá)的基因184個(gè)，對(duì)全部基因進(jìn)行可視化后的火山圖見圖2A。將差異表達(dá)的基因進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示差異基因數(shù)據(jù)源間具有相似性（圖2B）。

圖2 差異基因聚類分析Fig.2 Cluster analysis of differential genes

2.3 差異表達(dá)基因信號(hào)通路分析 為了方便差異基因的生物信息學(xué)分析，使用DAVID在線數(shù)據(jù)庫將全部差異基因成功轉(zhuǎn)換為基因符號(hào)。將280個(gè)差異表達(dá)的基因符號(hào)進(jìn)行KEGG信號(hào)通路聚類分析，發(fā)現(xiàn)hsa04142：溶酶體為富集程度最高的信號(hào)通路（圖2C、表1）。

表1 KEGG信號(hào)通路聚類分析（±s，n=280）Tab.1 Clustering analysis of KEGG signaling pathway（±s，n=280）

表1 KEGG信號(hào)通路聚類分析（±s，n=280）Tab.1 Clustering analysis of KEGG signaling pathway（±s，n=280）

Term hsa04142：Lysosome hsa05152：Tuberculosis hsa04145：Phagosome hsa04380：Osteoclast differentiation hsa05322：Systemic lupus erythematosus hsa04650：Natural killer cell mediated cytotoxicity Count 9109887%0.0230.0250.0230.0200.0200.018P value 0.00360.01120.01260.01900.02100.0410 Genes LAMP2，CLTA，CTSZ，LAPTM4A，AP1G1，CTSC，ATP6V0D1，ATP6V0B，AP3B1 BID，LAMP2，IL10RB，TLR1，PPP3R1，HLA-DPB1，F(xiàn)CGR3A，ATP6V0D1，F(xiàn)CGR3B，ATP6V0B LAMP2，NCF2，TUBB2A，ATP6V1B2，HLA-DPB1，F(xiàn)CGR3A，ATP6V0D1，F(xiàn)CGR3B，ATP6V0B IL1R1，LILRA2，NCF2，LILRA5，PPP3R1，F(xiàn)CGR3A，SIRPA，F(xiàn)CGR3B HLA-DPB1，F(xiàn)CGR3A，HIST1H3F，F(xiàn)CGR3B，HIST1H3G，H2AFB3，H2AFB2，H2AFB1 BID，CD48，TNFRSF10B，PPP3R1，PAK1，F(xiàn)CGR3A，F(xiàn)CGR3B

2.4 核心發(fā)病基因預(yù)測 將280個(gè)差異表達(dá)的基因輸入STRING在線軟件進(jìn)行PPI互作網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果顯示共有262個(gè)基因之間具有相互聯(lián)系，聯(lián)系線為344條，平 均 評(píng) 分 為2.63，PPI富 集P值 為9.84e?05。將PPI互作關(guān)系信息應(yīng)用Cytoscape進(jìn)行可視化處理。進(jìn)一步計(jì)算全部PPI信息數(shù)據(jù)后，cy‐tohubba顯示排名前10為的發(fā)病基因?yàn)镠CK（14分）、STAT5A（11分）、CAT（11分）、CXCR1（10分）、ARRB2（10分）、CD300A（10分）、MCM2（9分）、OPRL1（9分）、TLR1（9分）、PINK1（8分），見圖3A。對(duì)10個(gè)發(fā)病基因進(jìn)行聚類分析后顯示差異基因數(shù)據(jù)源間具有相似性（圖3B）。綜上分析，HCK為PCI術(shù)后ISR發(fā)病核心基因。

圖3 核心發(fā)病基因預(yù)測Fig.3 Prediction of hub genes

3 討論

PCI已經(jīng)成為治療缺血性心臟病的一種主要手段[2］。臨床實(shí)踐證明藥物洗脫支架（DES）能夠明顯減少裸金屬支架的ISR發(fā)生率[5］，因此DES被迅速和廣泛地應(yīng)用于PCI治療。然而DES晚期ISR仍然是一個(gè)嚴(yán)重的問題，其發(fā)生率約為3%～20%[6］。ISR的發(fā)生與支架類型、位置、患者合并癥及病變復(fù)雜性（即病變長度、血管大小和分叉病變）等均相關(guān)[7］。其主要由侵襲性內(nèi)膜增生和新動(dòng)脈粥樣硬化形成引起[3］。有研究針對(duì)內(nèi)膜增生進(jìn)行干預(yù)，但結(jié)果不令人滿意。因此對(duì)于ISR形成的分子機(jī)制及相關(guān)信號(hào)通路仍需進(jìn)一步探索。

二代測序的迅猛發(fā)展使得基因測序變得廉價(jià)、便捷，但二代測序過程中也會(huì)產(chǎn)生許多離散度較大的數(shù)據(jù)，如何能夠識(shí)別無用的數(shù)據(jù)，迅速鎖定核心發(fā)病基因是目前測序后研究的重點(diǎn)[8-9］。而生物信息學(xué)通過計(jì)算機(jī)軟件分析及計(jì)算可以實(shí)現(xiàn)大數(shù)據(jù)矯正及核心發(fā)病基因、核心發(fā)病通路的鎖定。本研究通過對(duì)ISR患者及PCI術(shù)后支架內(nèi)未狹窄的患者進(jìn)行基因測序發(fā)現(xiàn)，原始數(shù)據(jù)離散度較大。分析原因可能與入組患者年齡偏大，機(jī)體各臟器衰老有關(guān)，因此會(huì)出現(xiàn)許多與冠心病及ISR不相關(guān)的基因數(shù)據(jù)。此種情況一方面可以從基因校準(zhǔn)前看出，另一方面，即使進(jìn)行了基因數(shù)據(jù)均一化處理，聚類出溶酶體相關(guān)信號(hào)通路可能是ISR發(fā)病過程中的關(guān)鍵信號(hào)通路，但仍然會(huì)出現(xiàn)一些與冠心病無明顯關(guān)聯(lián)的基因及信號(hào)通路的富集。因此在應(yīng)用R語言對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行矯正后，進(jìn)一步對(duì)全部差異表達(dá)的基因進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，再次剔除18個(gè)可能和ISR無關(guān)的差異表達(dá)的基因。應(yīng)用cytohubba從基因間的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、基因點(diǎn)間的互作關(guān)系、關(guān)系的密切聯(lián)系等多維度進(jìn)行計(jì)算后，最終鎖定HCK為ISR的核心發(fā)病基因。

HCK在調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng)、吞噬、細(xì)胞存活和增殖、細(xì)胞黏附和遷移方面發(fā)揮重要作用[10］。此外HCK也被描述為巨噬細(xì)胞吞噬功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[11］。雖然目前ISR具體的發(fā)病機(jī)制不明，但是HCK參與的免疫、吞噬、炎癥及細(xì)胞增殖和遷移似乎都能造成新生內(nèi)膜的形成。其中HCK已被證明是中性粒細(xì)胞趨化因子信號(hào)的負(fù)調(diào)節(jié)因子，其低表達(dá)可促進(jìn)局部炎癥反應(yīng)的形成，進(jìn)而激活內(nèi)皮細(xì)胞增殖信號(hào)，很有可能導(dǎo)致支架內(nèi)局部炎癥反應(yīng)的過度激活，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮增殖引起ISR[12］。而HCK的形成過程似乎也和溶酶體密切相關(guān)，從而參與細(xì)胞吞噬過程。在巨噬細(xì)胞吞噬體的成熟過程中，位于囊泡結(jié)構(gòu)上的HCK在晚期內(nèi)質(zhì)體蛋白Lamp-1的作用下被募集到吞噬體膜上，通過對(duì)包含HCK的囊泡進(jìn)行膜蛋白的檢測發(fā)現(xiàn)其陽性表達(dá)CD63而陰性表達(dá)M6PR，提示HCK存在于溶酶體囊泡中，并介導(dǎo)溶酶體的吞噬作用[13］。而溶酶體相關(guān)通路是本文通過KEGG篩選出的對(duì)差異表達(dá)基因富集最為明顯的信號(hào)通路，其在冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊的形成過程中起關(guān)鍵作用。既往研究指出冠心病和溶酶體酸脂酶活力低下有關(guān)，此酶是將膽固醇酯和甘油三酯水解成游離膽固醇、甘油和游離脂肪酸的關(guān)鍵溶酶體酶，可防止脂質(zhì)在各種組織和細(xì)胞中積聚[14］。而酶體酶又可通過降解IL-1、IL-8、TNF-α來調(diào)控炎癥以及免疫反應(yīng)[15］。

綜上，本文通過對(duì)ISR患者基因測序及生物信息學(xué)分析，鎖定HCK為PCI術(shù)后ISR發(fā)生的關(guān)鍵基因，而溶酶體介導(dǎo)的相關(guān)通路為ISR發(fā)病過程中關(guān)鍵的信號(hào)通路改變。這是首次通過生物信息學(xué)分析的方法推測出來的ISR核心發(fā)病基因和關(guān)鍵信號(hào)通路，針對(duì)HCK及溶酶體通路的干預(yù)可能成為未來ISR的基因靶向治療及血清學(xué)診斷標(biāo)志物。