邵艷宏 李天寧 黃倫輝 王文皓 魏琳納 袁玉華 劉運德

（天津醫(yī)科大學醫(yī)學檢驗學院，天津300203）

胃癌（gastric carcinoma,GC）是全球最常見的惡性腫瘤之一[1］。流行病學數(shù)據(jù)顯示，胃癌在全球癌癥死亡人數(shù)中排名第二[2］。早期胃癌術后五年生存率為90%。胃癌初期無明顯臨床癥狀和體征，因此檢出率很低。70%的患者首診時，已發(fā)展為晚期疾病，總體預后較差[3］。因此，胃癌的早期發(fā)現(xiàn)和治療至關重要。胃泌素是胃分泌的主要效應因子，主要以胃泌素17為主[4］。一些研究表明胃泌素17可作為胃癌的生物標志物?；颊哐褐形该谒?7含量異常預示其患胃癌的可能性增大。腫瘤消退則胃泌素17含量恢復正常[5-7］。因此迫切需要一種快速、靈敏且廉價的胃泌素檢測方法。

傳統(tǒng)的酶標記蛋白方法主要有戊二醛交聯(lián)法和改良過的碘酸鈉法[8］。他們的反應步驟較多，標記酶的狀態(tài)難以控制，反應過程不確定性大。生成的產(chǎn)物不單一，較難純化，質量評價難以進行[9］。蛋白標記率達不到百分之百，而且受人員技術影響，標記效果不穩(wěn)定。本研究針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種將抗體與標記酶的序列相連接的融合蛋白的方法，解決了現(xiàn)有標記方法中存在的上述問題。既簡化實驗步驟又監(jiān)控反應過程，降低操作的技術要求，減小反應的不確定性。

單鏈抗體（scFv）是一段氨基酸殘基構成的彈性短肽（linker），由抗體的重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）連接而成[10］。因為他們沒有傳統(tǒng)抗體的恒定區(qū)片段，免疫原性降低[11］。在雙抗體夾心法的ELISA中，應用scFv減少標本中異嗜性抗體對檢測結果造成的假陽性或者假陰性影響。單鏈抗體是能與抗原結合的最小抗體片段。由于其結構簡單、分子量小、無糖基化等特點，易于在大腸桿菌生產(chǎn)平臺上制備，生產(chǎn)成本低。使其比全長單克隆抗體具有優(yōu)勢[12-13］。更重要的是，它可以與堿性磷酸酶（AP）偶聯(lián)形成融合蛋白直接進行分析檢測。

本研究在分子生物學的角度上將單鏈抗體與堿性磷酸酶通過一段柔性短肽偶聯(lián)，利用原核表達系統(tǒng)表達出單鏈抗體融合蛋白。這是一種新型且靈敏度高，具有百分百標記率的自指示劑。無需再進行酶標抗體的制備，省去其繁瑣的純化過程[14］。

1 材料與方法

1.1 材料 抗G17單克隆抗體107和N33株和重組肽G17由本實驗室保存；質粒載體pET-32a（+）購自金斯瑞生物有限公司；Rosetta（DE3）和BL21（DE3）購自世紀康維有限公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ購自索萊寶科技有限公司；His-tag蛋白純化樹脂和HRP標記的抗His鼠源單克隆抗體購自賽默飛世爾科技公司。

1.2 方法

1.2.1 質粒的構建 本研究先前已經(jīng)通過分離患者外周血單個核細胞建立噬菌體抗體庫。利用酶聯(lián)免疫吸附試驗進行生物淘洗，獲得特異性抗體。通過進一步的測序確定抗體的VH和VL基因序列。堿性磷酸酶基因序列由GenBank獲得（登錄號NP_414917.2）?？贵w與標記酶之間用GSSSSGSSSSGSSSS這一柔性短肽連接。由金斯瑞生物有限公司合成該基因并構建質粒。

1.2.2 質粒的鑒定 將收到的質粒轉化到DH5α大腸桿菌中，通過擴大培養(yǎng)獲取大量含有質粒的大腸桿菌。根據(jù)質粒提取說明書，提取質粒。用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ對質粒進行雙酶切（20 μl體系，質粒6 μl，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ各2 μl，10×BSA 2 μl，10×NEB Buffer 2 μl，H2O 6 μl）。酶切效果用1%瓊脂糖凝膠電泳進行驗證，并使用Sanger法進行測序。

1.2.3 質粒的轉化及抗體融合蛋白的表達 將測序正確的重組質粒轉化到Rosetta（DE3）和BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，平板劃線挑取單克隆菌落。將挑取的菌落分別接種到含氨芐青霉素（工作濃度為50 μg/ml）的LB培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min培養(yǎng)。采集標本經(jīng)10%SDS-PAGE分析，用考馬斯亮藍R-250染色。

1.2.4 表達條件的優(yōu)化 本實驗共設置了18個分組，從不同的誘導溫度（25℃、37℃），IPTG的濃度（0.5 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L），誘導時間（2 h、4 h、6 h）3個方向，對蛋白的表達條件進行摸索。確定最佳表達條件使目的蛋白的可溶性產(chǎn)量最大化，方便后續(xù)實驗的進行。

1.2.5 蛋白純化 本實驗采用固定化金屬離子親和層析（IMAC）技術純化目標蛋白，用20 mmol/L咪唑、50 mmol/L磷酸 二氫鈉（NaH2PO4·H2O）、300 mmol/L氯化鈉（pH8.0）作為洗滌緩沖液，用250 mmol/L咪唑、50 mmol/L磷酸二氫鈉、300 mmol/L氯化鈉（pH8.0）作為洗脫緩沖液。非特異性結合蛋白用洗滌液洗滌。抗體與His-tag蛋白純化樹脂結合后用洗脫緩沖液洗脫。標記為洗脫物。采集的樣品經(jīng)10%SDS-PAGE分析，考馬斯亮藍R-250染色，用anti-his-hrp孵育PVDF膜，進行免疫印跡。

1.2.6 scFv-AP定量 采用BCA法測定目的蛋白濃度。將標準品倍比稀釋繪制標準曲線，洗脫液調(diào)零。按說明書推薦，A∶B=50∶1制成AB混合液。每個樣本兩個復孔，每孔加10 μl蛋白和200 μl AB混合液。37℃避光顯色30 min，使用synergy2多模微板閱讀器讀取562 nm處的光密度。根據(jù)標準曲線計算相應濃度。

1.2.7 scFv-AP活性測定 首先，將抗G17單克隆抗體N33包被在96孔酶聯(lián)測定板，4℃下孵育過夜。第二天，用0.05%PBST在自動洗板機上洗滌微孔板。用0.05%PBST溶解BSA制成5%BSA封閉緩沖液。每個孔中加入250 μl封閉緩沖液，37℃下孵育2 h。然后將抗原緩沖液G17加入清洗過的微板中。37℃孵育2 h后，洗滌3次。然后用0.05%PBST清潔每個孔。將樣品孔分為兩組，一組是傳統(tǒng)的ELISA夾心模式為對照組，另一組為用scFv-AP直接檢測的實驗組。對照組加入抗G17單克隆抗體107緩沖液，實驗組加入抗體融合蛋白（scFv-AP）。37℃孵育2 h，用0.05% PBST再次清洗每個孔。對照組加入酶標二抗，實驗組加入AP底物（p-NPP）。前者37℃孵育1 h，后者避光顯色30 min讀取405 nm處的光密度。1 h后加入HRP底物（TMB）進行顯色反應，最后讀取光密度值。

1.3 統(tǒng)計學處理 所有試驗至少重復3次。使用醫(yī)學統(tǒng)計軟件GraphPad Prism 7.0將實驗結果進行統(tǒng)計分析。統(tǒng)計結果以±s表示。

2 結果

2.1 質粒酶切與測序鑒定 圖1A是質粒示意圖，方框標出的為EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點。將質粒用EcoRⅠ和HindⅢ進行雙酶切，結果如圖1B所示。1%瓊脂糖凝膠電泳顯示片段大小為2200 bp，與預期值相符。經(jīng)Sanger法進行測序，測序結果與標準序列比對一致。表明質粒構建成功。

圖1 質粒酶切和鑒定Fig.1 Plasmid digestion and identification

2.2 質粒轉化與融合蛋白表達 為了能提高目的蛋白產(chǎn)量，選擇兩種不同感受態(tài)細胞Rosetta（DE3）和BL21（DE3）質粒轉化。先進行小量表達，確定目的蛋白表達情況。從圖2中可以明顯看出Rosetta（DE3）感受態(tài)細胞產(chǎn)量更高。目的蛋白在兩種感受態(tài)細胞中均以包涵體的形式存在。方框標記目的蛋白。

圖2 質粒轉化與融合蛋白表達Fig.2 Plasmid transformation and fusion protein expres?sion

2.3 優(yōu)化表達條件 為了減少包涵體的形成，提高目的蛋白可溶性表達。通過摸索不同的誘導時間、誘導溫度、IPTG濃度，確定最佳表達條件。圖3A～C是25℃和37℃，TPTG濃 度0.5 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L，培養(yǎng)2 h、4 h、6 h的PAGE膠圖。方框標記目的蛋白。如圖3所示，誘導時間越長，目的蛋白產(chǎn)量越大。37℃的生產(chǎn)效率高于25℃，但也更易形成包涵體。這是因為胞質內(nèi)蛋白質生成速率過高，沒有充足的時間進行折疊，從而形成蛋白質的聚集體。包涵體的形成不利于后面實驗的進行。為了減少包涵體的形成，設置25℃進行低溫誘導，并適當延長誘導時間。最終確定最佳誘導條件為25℃、1 mmol/L IPTG、6 h。

圖3 表達條件的優(yōu)化Fig.3 Optimization of expression conditions

2.4 蛋白純化 根據(jù)最終確定的誘導方案表達蛋白，成功得到了可溶性的抗體融合蛋白。無需采用包涵體的變形復性方式純化，只需將上清液與Histag蛋白純化樹脂結合完全，離心棄去上清液。用洗滌緩沖液洗去雜蛋白。用含250 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液洗下目的蛋白。如圖4A為純化后的抗體融合蛋白的SDS-APGE圖?？梢?00 kD處有單一條帶?？笻is抗體的Western blot驗證為目的條帶（圖4B）。本研究共誘導500 ml的菌液，純化后得到8 ml。經(jīng)BCA法定量，濃度為600 μg/ml。即每升菌液可得9.6 mg抗體融合蛋白。

圖4 蛋白純化Fig.4 Protein purification

2.5 基于scFv-AP融合蛋白的ELISA與傳統(tǒng)ELI‐SA相比，抗G17的scFv-AP融合蛋白應用于ELISA可以縮短分析時間，避免使用化學偶聯(lián)的二抗，無需再次標記。先前實驗室已成功制備出3種人源化抗G17的單克隆抗體，并采用雙抗體夾心方式進行兩兩配對。最終結果為N33和107這一配對靈敏度最高。本研究將抗原G17緩沖液由31.25 ng/ml對倍稀釋至0.978 ng/ml。實驗分為4組。對照組、實驗組和他們的空白組，即不加抗原緩沖液G17組。對照組是傳統(tǒng)的ELISA夾心模式，實驗組用scFv-AP直接檢測。實驗重復3次。單克隆抗體具有兩個抗原結合位點，而單鏈抗體只有一個抗原結合位點。為控制變量，將實驗組與對照組scFv-AP與IgG摩爾濃度比例設置為2∶1。如圖5所示，未加抗原緩沖液的對照組和實驗組OD值均在0.1左右。對照組檢出限為3.910 ng/ml，實驗組最低檢出限在0.978 ng/ml，比對照組靈敏度高4倍。

圖5 scFv-AP的ELISA分析Fig.5 ELISA analysis of scFv-AP

3 討論

中國是胃癌高發(fā)國家，約占世界新發(fā)病例的一半。對高危人群進行胃蛋白酶原和胃泌素的血清學篩查可降低胃癌死亡率。血清學試劑盒多以單克隆抗體作為免疫分析工具。單克隆抗體往往存在生產(chǎn)周期長、成本高、批間差異大，需將酶與抗體通過化學共軛方式連接才能作為檢測試劑。

單鏈抗體可以避免基因丟失、基因突變和細胞系漂移等問題。因其生化和遺傳穩(wěn)定性好、在原核系統(tǒng)中表達成本低、生長快、產(chǎn)量大，可彌補單克隆抗體生產(chǎn)工藝的不足。1988年MOUSLI等[15］報道了scFv-AP的生產(chǎn)與表征。2010年LIU等[16］報道細菌堿性磷酸酶可以與單鏈抗體結合作為ELISA檢測的替代試劑。本研究結果驗證scFv-AP比單克隆抗體靈敏度高4倍。scFv-AP融合蛋白相較于單克隆抗體可以簡化檢測步驟，提高檢測G17的靈敏度。本研究推測單克隆抗體檢出限不高，可能是因為酶標記抗體的化學反應特異性差。隨機連接的化學反應使產(chǎn)物不單一，發(fā)生副反應破壞結合位點，從而降低單克隆抗體測定的靈敏度。

本研究成功表達抗G17的scFv-AP融合蛋白，通過優(yōu)化表達條件，避免包涵體形成。使用固定化金屬離子親和層析技術進行純化，每升菌液可收集9.6 mg的目的蛋白。為以后低成本、大批量生產(chǎn)scFv-AP提供了重要基礎。scFv-AP同時具有抗體特異性結合能力和堿性酶活性。這種雙功能蛋白的應用使單步免疫測定成為可能?？梢愿涌焖?、靈敏地檢測胃泌素17，為早期篩查胃癌提供可能。