崔磊，陳鵬，張文濤，謝小肖，李偉，江長青

（1.安徽醫(yī)科大學北京大學深圳醫(yī)院臨床學院，廣東 深圳 518036；2.北京大學深圳醫(yī)院 運動醫(yī)學科）

肌腱-骨骼連接處的損傷在運動和工作中很常見，每年全世界有3 000多萬人深受其影響[1]。肌腱-骨愈合的特點是修復后在原損傷處形成瘢痕組織界面，但是腱骨界面的再撕裂率很高[2]。在上肢損傷中，肩袖損傷較為常見。對于保守治療無效的肩袖損傷，通常進行關(guān)節(jié)鏡手術(shù)治療。但肩袖撕裂，尤其是巨大肩袖撕裂，術(shù)后再撕裂率較高[3-4]。針對目前較高的手術(shù)失敗率，需要探究新的治療措施來改善肌腱-骨骼連接處損傷修復后的腱骨愈合效果。

近年來，骨髓間充質(zhì)干細胞（BM-MSCs）因其具有的多能性和出色的自我更新能力，成為了細胞組織工程的理想選擇[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白12（BMP-12）可在體外和體內(nèi)促進肌腱修復和肌腱樣組織的形成[7-8]。此外，BMP-12還可促進BM-MSCs的腱向分化[9]。因此，BMP-12過表達的BM-MSCs可能是用于肌腱修復的較理想的工具。

聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）具有出色的生物相容性和生物可降解性，在醫(yī)藥和生物材料的應用時基本不會產(chǎn)生毒副作用，因此其在醫(yī)藥及生物材料的應用中越來越受重視。修復復雜的組織缺損通常需要定制支架，因此，具有精準定制特性的3 D打印技術(shù)與組織工程完美契合，可以個性化制作具有復雜幾何結(jié)構(gòu)的三維支架。最近，有研究表明3 D打印支架已成功應用于骨的形成和愈合[10-13]。然而，目前3 D打印支架在肌腱組織修復再生中的應用仍是非常有限的。

在本研究中，我們制備了3 D打印PLGA支架，并將BMP-12過表達的兔BM-MSCs植入支架上。通過體外實驗研究3 D打印PLGA支架上BMP-12過表達BM-MSCs的增殖和分化特性。為進一步研究攜帶過表達BMP-12的BM-MSCs的3 D打印PLGA支架在肌腱損傷修復中的應用提供支持。

1 材料與方法

1.1 3 D打印PLGA支架制備

Peng等[14]研究人員已經(jīng)報道了3 D打印PLGA支架的制備過程。以下為簡要步驟。

⑴應用Mimics 15.0重建需要打印的組織，應用CAD軟件設計所需要的肩袖形態(tài)及內(nèi)部的顯微走向，編譯驅(qū)動對應的打印程序。

⑵將PLGA粉末（Sigma，美國）在135℃離心室中熔化，在溫度范圍125℃～150℃環(huán)境中以100 g的轉(zhuǎn)速離心10 min。

⑶將融化的PLGA在135℃的溫度下，使用27號金屬針噴出。制作而成的長棒狀結(jié)構(gòu)為20μm寬，1 800μm長。它們的方向代表著肩袖中膠原纖維的走向，其中長棒狀結(jié)構(gòu)間距為100μm，保證在細胞種植時能順利通過并附著。最終制備出高度為1 mm，直徑為15 mm并相互交織的結(jié)構(gòu)。

⑷使用掃描電鏡（TESCAN，捷克）觀察3 D打印PLGA支架的超微結(jié)構(gòu)，并測量其中每一個微孔的直徑，使用圖形計算軟件（SMILE view，日本）計算這些微孔的平均直徑。

1.2 3 D打印PLGA支架的降解性能檢測

將3 D打印PLGA支架切成30 mg的小塊，然后將支架碎片放置在pH=7.2的PBS溶液中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中浸泡12周，每4周更換一次PBS溶液，分別在第4、8和12周時，將支架材料從PBS溶液中取出，用蒸餾水徹底沖洗并風干后，使用微量天平（Columbus，美國）測量支架材料的重量。質(zhì)量的損失通過公式 L=（mo-mt）/mo×100%計算，其中 mo是降解前的質(zhì)量，mt是經(jīng)過不同時間降解后的質(zhì)量。

1.3 兔BM-MSCs的分離培養(yǎng)

用含100μg/mL鏈霉素、100 u/mL青霉素和1%胎牛血清（FBS；Sigma）的PBS沖洗無菌分離出的新西蘭大白兔股骨和脛骨的髓腔，獲得骨髓組織中的細胞。洗滌重懸后400 g離心30 min，收集細胞，獲得的細胞在添加了10% FBS的DMEM（Sigma，美國）培養(yǎng)基中于37℃的條件下培養(yǎng)過夜，第2天沖洗漂浮的細胞，余下的細胞繼續(xù)培養(yǎng)[19]。

1.4 流式細胞鑒定

獲取第3代的BM-MSCs，經(jīng)胰蛋白酶消化后，制成細胞懸液，1 000 rpm離心10 min，PBS溶液洗2遍。重懸后分裝至EP管（1μL/管），然后加入異硫氰酸熒光素（ FITC）共軛的 CD 90、CD 45、CD 29和β-2 微 球 蛋 白 （β-2 microglobulin，β2 m）（Abcam，英國）。4℃避光孵育30 min，PBS溶液洗滌后重懸。陰性對照組通過使用一級抗體取代FITC共軛的免疫球蛋白。最后使用流式細胞儀（BD Biosciences，美國）檢測細胞表面標記物表達情況。

1.5 細胞轉(zhuǎn)染

攜帶BMP-12基因的腺病毒載體購自GenePharma（上海），獲取第3代BM-MSCs用于腺病毒轉(zhuǎn)染。使用脂質(zhì)體2000試劑（Invitrogen）將腺病毒載體（對照組）及含有BPM-12基因的腺病毒載體（ADBMP-12）分別轉(zhuǎn)染細胞。將轉(zhuǎn)染的細胞轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育。

1.6 細胞種植

PLGA支架放入超凈臺經(jīng)過紫外線照射30 min，然后在75%的乙醇溶液中浸泡12 h，無菌PBS溶液清洗3次。將合適尺寸的支架放入24孔板中，使用全細胞培養(yǎng)液浸泡7 d備用。取轉(zhuǎn)染BMP-12基因的第3代BM-MSCs，每塊支架接種1×106細胞，在各孔中加入3 mL的培養(yǎng)液將支架完全浸沒，然后放入37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中。陰性對照組則種植未轉(zhuǎn)染BMP-12基因的第3代BM-MSCs。

1.7 細胞黏附

在細胞種植于3 D打印PLGA支架后第1、3、5、7天，取部分種植有細胞的PLGA支架觀察細胞的黏附情況。用4%多聚甲醛將細胞固定15 min，隨后行苯基吲哚染色（Sigma，美國）。按照染色試劑盒說明書操作，在室溫下染色10 min后將支架置于熒光顯微鏡（Bio-Tek，美國）下進行觀察。計數(shù)5個隨機視野下的細胞數(shù)，計算其平均數(shù)。

1.8 細胞毒性檢測

此次試驗中使用LDH-細胞毒性檢測試劑盒（Cataloguenumber KA0785.Abnova，臺灣）進行細胞毒性試驗。在細胞接種后72 h進行該項測定。死亡對照組細胞使用非離子型表面活性劑乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）處理20 min，使細胞內(nèi)LDH完全釋放。LDH的濃度使用560 Labmax檢測儀（Labtest，美國）測量。

1.9 細胞增殖檢測

在BM-MSCs接種于3 D打印PLGA支架上培養(yǎng)的第1、3、5、7天，分別取部分培養(yǎng)孔檢測細胞的增殖活性。在每個時間點，使用DMEM培養(yǎng)基清洗支架。使用計數(shù)試劑盒8（CCK-8）溶液（Beyotime，北京），于37℃，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育2 h，然后用酶標儀（Bio-Tek）測量各孔在450 nm波長處的吸光度值（optical density，OD值）。

1.10 實時定量PCR（qRT-PCR）

使用TRIZOL試劑（Invitrogen，美國）從細胞中提取總RNA。把提取的RNA反轉(zhuǎn)錄到cDNA中，然后使用SYBR預混料Ex Taq Ⅱ試劑盒（Takara，大連）進行實時PCR，最后在AB Ⅰ7900系統(tǒng)（Applied Biosystems，美國）上進行檢測，以Actin為內(nèi)對照，通過比較相對Ct值的方法進行檢測mRNA表達情況。

1.11 Western blot檢測種子細胞Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白、BMP-12、SCX、Tnmd、Tnc 的蛋白表達水平

制備全細胞裂解物的方法見文獻[15]。用以下主要抗體對膜進行Western blot，用以檢測相關(guān)的蛋白表達水平：抗Ⅰ型膠原多克隆抗體（Abcam，美國），抗Ⅲ型膠原多克隆抗體（Abcam，美國），anti-BMP-12多克隆抗體（Abcam，美國），anti-SCX多克隆抗體（Abcam，美國），anti-Tnmd多克隆抗體（Abcam，美國），anti-Tnc多克隆抗體（Abcam，美國）和anti-β-actin兔多克隆抗體（Abcam，美國）。用相應的二級抗體（Abcam，美國）和ECL試劑（Sigma）觀察蛋白條帶。

1.12 統(tǒng)計學方法

所有的統(tǒng)計數(shù)據(jù)均采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件（SPSS，Inc，美國）進行分析，采用非配對樣本t檢驗比較兩組間的差異；采用單因素方差分析比較兩組以上的差異，P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3D打印PLGA支架形態(tài)特征

計算機軟件模擬出的支架三維形態(tài)如圖1A所示，3 D打印的PLGA支架如圖1B所示，可看出支架表面粗糙，呈現(xiàn)出微孔，纖維絲分層分布，每層之間平行，層內(nèi)纖維絲平行排列，光滑均勻，相鄰層次的纖維絲相互垂直，呈現(xiàn)“井”字形。掃描電鏡（SEM）結(jié)果顯示，3 D打印PLGA支架具有連通均勻的多孔立體結(jié)構(gòu)，孔隙率為（79.3±5.4）%，其中大孔的平均尺寸為（256.3±17.6）μm（圖 1C、D）。

圖1 3 D打印PLGA支架的形態(tài)特征。（A）使用軟件對支架進行三維建模；（B）預制支架的形態(tài)；（C）多孔復合支架的掃描電鏡圖像；（D）多孔復合支架掃描電鏡的高放大率

2.2 兔BM-MSCs的免疫表型分析

流式細胞學檢測分離的細胞的表型特征如圖2所示，第3代的細胞CD90陽性率為98.3%，CD29陽性率為97.5%，CD45陽性率則為0.6%，β2m陽性率為0.4%。幾乎全部第3代的細胞免疫表型CD 45及β2 m均為陰性（圖2）。此結(jié)果表明：分離培養(yǎng)的細胞具有BM-MSCs的特性，可證明為BM-MSCs。

圖2 離體兔BM-MSCs的免疫表型

2.3 3D打印PLGA支架的降解特性及PLGA支架材料對細胞的毒性和增殖活性的影響

3 D打印PLGA支架的降解通過質(zhì)量損失法來檢測，如圖3A中所示，3 D打印PLGA支架材料經(jīng)PBS孵育4、8和12周后的質(zhì)量損失率分別為25%、43.3%和75.7%。細胞毒性檢測結(jié)果顯示，PLGA組細胞上清液中LDH含量與陰性對照組無明顯差異，兩組均明顯小于死亡對照組，說明PLGA對兔BM-MSCs無明顯毒性（圖3B）。用CCK-8法檢測PLGA支架對細胞增殖的影響，如圖3 C中所示，PLGA組的OD值與陰性對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。另外，同時比較了在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的兔BM-MSCs和用3 D打印PLGA支架培養(yǎng)的BM-MSCs的細胞增殖活性，陰性對照組和3 D打印的PLGA支架組之間沒有顯著差異（圖3D）。此部分實驗結(jié)果顯示：PLGA對兔BM-MSCs的增殖無明顯影響，且無明顯細胞毒性。

圖3 3D打印PLGA支架的降解特性及PLGA對細胞毒性和細胞增殖的影響。（A）受試支架在PBS中降解的質(zhì)量損失；（B）兔BMMSCs上清液中的乳酸釋放量測定PLGA細胞性；（C）CCK-8法評價PLGA對兔BM-MSCs增殖的影響；（D）CCK-8法測定兔BM-MSCs在3D打印PLGA上的增殖

2.4 BMP-12促進兔BM-MSCs中肌腱細胞分化的相關(guān)生物標志物的表達情況

采用qRT-PCR和Western blot方法檢測BMP-12過表達對兔BM-MSCs腱向分化的影響。如圖4A所示，與陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染了BMP-12的BM-MSCs中BMP-12的mRNA表達量增加了約30倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。qRT-PCR結(jié)果進一步提示，與陰性對照組相比，兔BM-MSCs中BMP-12的過表達顯著增加了Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、SCX、Tnmd和Tnc的mRNA表達（圖4B-F）。另外，Western blot結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，AD-BMP-12組BMP-12、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、SCX、Tnmd 和 Tnc 的蛋白水平顯著升高（圖4 G）。這些結(jié)果表明BMP-12的過表達促進了與肌腱分化相關(guān)生物標志物的表達。

圖4 BMP-12對兔BM-MSCs成骨分化的影響。用qRT-PCR測定（A）BMP-12；（B）SCX；（C）Tnmd；（D）Tnc；（E）Ⅰ型膠原和（F）Ⅲ型膠原在BMP-12過表達兔BM-MSCs或?qū)φ胀?BM-MSCs的 mRNA 表達；（G）BMP-12、SCX、Tnmd、Tnc、Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原在兩種方案中的蛋白質(zhì)印跡分析

2.5 BMP-12促進兔BM-MSCs在3 D打印PLGA支架上的增殖、黏附和腱性分化

采用CCK-8法檢測BMP-12過表達對用3D打印PLGA支架共培養(yǎng)的兔BM-MSCs增殖的影響。對照組和AD-BMP-12組的兔BM-MSCs種植在3 D打印PLGA支架上以后，分別于第1、3、5和7天進行CCK-8檢測，發(fā)現(xiàn)對照組和AD-BMP-12組的兔BM-MSCs的OD值差異無統(tǒng)計學意義，而且隨著時間延長兩組細胞的OD值均逐漸增大（圖5A）。另外，對照組和AD-BMP-12組的兔BM-MSCs在種植于3D打印PLGA支架后的第1、3、5和7天，兩組的黏附細胞數(shù)量逐漸增加，且對照組和AD-BMP-12組之間的細胞黏附數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義（圖5B）。qRT-PCR結(jié)果顯示，BMP-12的過表達顯著促進了3D打印PLGA支架植入后Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、SCX、Tnmd和Tnc的mRNA表達（圖5 C-G）。Western blot分析結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，AD-BMP-12組兔BM-MSCs在3 D打印PLGA支架上種植后第1、3、5和7天，其Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、SCX、Tnmd和Tnc的蛋白水平出現(xiàn)了顯著升高（圖5 H）。

圖5 BMP-12對在3D打印PLGA支架上培養(yǎng)的兔BM-MSCs增殖、黏附和成骨分化的影響。（A）CCK-8檢測種植在PLGA支架上的過表達BMP-12的兔BM-MSCs和對照組兔 BM-MSCs在種植后第 1、3、5、7 天的細胞增殖活性；（B）種植在PLGA支架上的過表達BMP-12的兔BM-MSCs和對照組兔BM-MSCs在種植后第1、3、5、7天的細胞黏附情況；（C-G）qRT-PCR檢測的種植在PLGA支架上的過表達BMP-12的兔BM-MSCs和對照組兔BM-MSCs在種植后第 1、3、5、7 天后，SCX、Tnmd、Tnc、I型膠原及 III型膠原的mRNA表達情況；（H）Western blot檢測的種植在PLGA支架上的過表達BMP-12的兔BM-MSCs和對照組兔BMMSCs在種植后第 1、3、5、7 天后，SCX、Tnmd、Tnc、I型膠原及III型膠原的表達情況

3 討論

肌腱損傷修復手術(shù)的成功與否取決于腱-骨結(jié)合處的愈合情況。經(jīng)手術(shù)修復后，腱骨交界處形成一層纖維血管組織。但是，這種纖維血管組織是脆弱的，因此使得外科修復容易失敗[20]。針對目前傳統(tǒng)手術(shù)治療方法的難點及其較高的手術(shù)失敗率，研究人員開發(fā)、測試出許多生物材料并應用于臨床，目的在于促進肌腱損傷組織的愈合，提高手術(shù)治療的成功率，最終改善患者的術(shù)后功能[16]。

在前人的基礎上，有學者進行了深入的研究，并提出進行肩袖損傷修補術(shù)時可采用相應的肩袖補片進行加強修補，這尤其適用于較大范圍肩袖損傷及慢性肩袖損傷并伴有岡上肌萎縮的患者。此外，在手術(shù)治療大面積肩袖損傷時應用肩袖補片，可以有效地緩解患者的疼痛、提高肌力和增加肩關(guān)節(jié)的活動度[17-18]。

人工合成的可降解醫(yī)用高分子材料中相關(guān)研究最多、應用范圍最廣的是脂肪族聚酯，特別是PLGA及其共聚物。在美國，PLGA是通過FDA認證的、并被正式作為藥用輔料收錄進美國藥典的材料。聚乳酸-羥基乙酸是通過水解的方式進行降解的，聚乳酸-羥基乙酸本身是與水不相溶的固體，經(jīng)過溶蝕作用，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，轉(zhuǎn)變?yōu)樗苄晕镔|(zhì)，體積與原來相比減小，溶解的小分子物質(zhì)，將在人體內(nèi)的三羧酸循環(huán)中發(fā)揮重要作用，最終的產(chǎn)物是二氧化碳與有機酸。聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)是由兩種單體乳酸和羥基乙酸經(jīng)隨機聚合而成，其具有出色的生物相容性和生物可降解性。并且PLGA的降解產(chǎn)物是乳酸和羥基乙酸，這是人正常代謝途徑的副產(chǎn)物，因此它在醫(yī)藥和生物材料中應用時基本不會產(chǎn)生毒副作用。

3 D打印技術(shù)是上個世紀80年代末興起的技術(shù)。原理有兩方面，一方面是分層加工，另一方面是迭加成型[19]。3 D打印技術(shù)從傳統(tǒng)的打印方式延伸而來，也就是普通噴墨打印。普通噴墨是平面的，也就是僅僅能在平面上移動，經(jīng)過了在垂直上移動的創(chuàng)新之后，出現(xiàn)了3 D打印技術(shù)。再之后將3 D打印技術(shù)應用到了生物工程中，進行組織或是器官的打印。

BM-MSCs是多能干細胞，能夠分化為多種間充質(zhì)組織。多項研究表明，BM-MSCs具有向軟骨細胞、成骨細胞、肝細胞等多種類型細胞分化的潛能[20-21]。有研究表明，BM-MSCs移植到撕裂的跟腱處經(jīng)自然愈合后，跟腱具有更高的強度和更自然的組織[22]。一項研究表明，BM-MSCs在大面積肩袖撕裂修復中，可以明顯改善肩袖的功能[23]。然而，來自Gulotta等[24]研究表明，在大鼠肩袖損傷修復模型中，應用BM-MSCs未能促進肌腱-骨結(jié)合處的愈合，這可能是由于缺乏促進BM-MSCs腱向分化的誘導因子所致。大量的動物實驗表明，BM-MSCs能夠促進骨、關(guān)節(jié)軟骨和肌腱的局部修復和再生[25-27]。Ouyang等[28]研究者在兔模型中，將骨髓基質(zhì)細胞引入骨隧道，通過在肌腱和骨之間形成纖維軟骨附著物來改善其愈合情況。Lim等[29]研究者在兔前交叉韌帶損傷重建模型中，用間充質(zhì)干細胞覆蓋肌腱移植物增強了肌腱移植物與骨的結(jié)合。

既往研究表明，體內(nèi)移植細胞的轉(zhuǎn)分化和存活率非常低[30-32]。而基于合成支架的組織工程技術(shù)為組織再生提供了一種很有潛力的替代方法。支架作為組織工程的重要組成部分，為細胞提供了固定的場所，增加了細胞的表面積，并為特定的結(jié)構(gòu)提供了支撐。

本研究使用3 D打印技術(shù)制備了PLGA支架，并研究其降解性能，結(jié)果表明，3 D打印PLGA支架材料經(jīng)PBS孵育12周后的質(zhì)量損失率為75.7%，完全超出了肩袖愈合所需要的時間，說明這種材料的降解性能符合肩袖修復的需要。此外，我們還將3D打印的PLGA支架與BM-MSC共培養(yǎng)，并探究支架的細胞毒性及對細胞增殖活性的影響。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與PLGA支架共培養(yǎng)的BMSCs和陰性對照組BMSCs，兩者細胞上清液中LDH含量差異無統(tǒng)計學意義，說明PLGA支架無明顯的細胞毒性。在CCK-8檢測細胞增殖活性的實驗中，兩組細胞連續(xù)培養(yǎng)7 d，PLGA支架組吸光度值與陰性對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。因此，我們有理由認為，PLGA支架對兔BMSCs的增殖活性沒有明顯影響。

BMP-12屬于TGF-β/BMP家族，在體內(nèi)外均能促進肌腱的分化和形成[8，33-34]。Lee等[35]研究者發(fā)現(xiàn)，在體外短時間內(nèi)刺激BMP-12足以誘導BM-MSCs分化為腱細胞，當處理過的種植BM-MSC的膠原支架植入實驗動物體內(nèi)手術(shù)產(chǎn)生的肌腱缺損處，21 d后觀察到開始形成了牢固的肌腱樣組織。在本研究中，我們制備了過表達BMP-12的兔BM-MSCs，發(fā)現(xiàn)BMP-12的過表達促進了兔BM-MSCs腱細胞分化相關(guān)標志物的表達，并有助于細胞在3D打印PLGA支架上的種植，這表明BMP-12的過表達促進了BM-MSCs的成腱分化。

本研究采用3D打印技術(shù)制備PLGA支架，3D打印PLGA支架具有良好的生物相容性及生物可降解性，對BM-MSCs無明顯細胞毒性作用，提示PLGA支架適用于體內(nèi)植入。以上結(jié)果表明，使用3D打印的PLGA支架加載過表達BMP-12的BM-MSCs所制備的補片可以作為一種很有前途的肌腱組織修復方法。

但是，本研究尚存在一些局限性。目前我們只在體外實驗中研究了種植于3D打印PLGA支架上的加載過表達BMP-12的BM-MSCs的增殖與分化特性，有待通過進一步的動物體內(nèi)實驗進行驗證。

綜上所述，在攜帶過表達BMP-12的BM-MSCs的3D打印PLGA支架上，BMP-12的過表達促進了BM-MSCs的腱向分化。攜帶過表達BMP-12的BM-MSCs的PLGA支架可以為肌腱組織修復提供一種新的治療方法。

致謝：本研究基于深圳市科技計劃項目（項目編號：20180214121124 778）及深圳市醫(yī)療衛(wèi)生三名工程（項目編號：SZSM201612078）的支持得以順利進展，值此表達誠摯感謝。