賀海斌 張智勇 趙偉

胃腺癌（gastric adenocarcinoma,GAC）是常見的惡性腫瘤之一[1]，目前最有效的治療方法是手術(shù)治療，但部分患者在診斷時(shí)已處于晚期，失去最佳手術(shù)治療時(shí)機(jī)，且預(yù)后較差[2]。因此，探索GAC發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，尋找新的早期診斷及治療靶點(diǎn)是目前GAC研究的重點(diǎn)[3-4]。長(zhǎng)期以來，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一種不編碼蛋白質(zhì)、長(zhǎng)度＞200個(gè)核苷酸的RNA，廣泛分布在基因組中。目前認(rèn)為lncRNA是基因組調(diào)節(jié)機(jī)制的重要組成部分[5]。也有證據(jù)表明，某些lncRNA在癌癥中失調(diào)，并在表觀遺傳調(diào)控、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及其他與腫瘤發(fā)生、侵襲有關(guān)的生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[6]。近年來，lncRNA在胃腸道癌癥發(fā)生、發(fā)展中的分子機(jī)制是研究熱點(diǎn)[7]。POT1-AS1是一種lncRNA，其在GAC中的表達(dá)譜和潛在機(jī)制目前尚未知曉。因此，本研究對(duì)POT1-AS1在GAC組織中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞增殖的影響作一探討，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 收集2016年6月至2018年12月在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院普通外科手術(shù)切除的80對(duì)GAC組織及其癌旁正常組織標(biāo)本，立即存于多聚甲醛溶液中；所有患者術(shù)前未接受過放、化療等輔助治療。所有入組患者簽署知情同意書。正常人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1和 GAC 細(xì)胞株 BGC-823、MGC-803、MKN45、SGC-7901均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院和寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將正常人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1和 GAC 細(xì)胞株 BGC-823、MGC-803、MKN45、SGC-7901置于 37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，用含 10% FBS的DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)：SH30022.01，美國(guó)HyClone公司）培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至約60%融合度時(shí)，按照Effectene Transfection Reagent（批號(hào)：301425，德國(guó) Qiagen 公司）說明書步驟將sh-POT1-AS1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SGC-7901細(xì)胞中，即POT1-AS1敲低。

1.3 組織及細(xì)胞中POT1-AS1 mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 采用RT-qPCR法。Trizol法提取GAC組織及其癌旁正常組織和 GAC細(xì)胞系 GES-1、BGC-823、MGC-803、MKN45、SGC-7901中的RNA，按照RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Thermo Scientific公司）說明書步驟將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照qPCR試劑盒（瑞士Roche公司）說明書步驟進(jìn)行PCR。PCR條件：95℃10 min預(yù)變性，95℃ 5 s變性，60℃ 30 s退火，72℃ 30 s延伸循環(huán)40次；引物序列正義為GGCCATTACCCCTCCACTTG，反義為 TGTTGGGTATGCACCTCCAC。采用2-ΔΔCt法計(jì)算 POT1-AS1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4 GAC細(xì)胞增殖能力檢測(cè) （1）采用CCK-8試驗(yàn)。將SGC-7901細(xì)胞（包括POT1-AS1敲低組、未敲低組）以2 000個(gè)/孔的密度接種在96孔板中，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 0、24、48、72 h，然后每孔加入 10 μl CCK-8 試劑（批號(hào)：CX001M，上海雅酶生物科技有限公司），37℃孵育1 h，使用酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司）檢測(cè)450 nm處的吸光度（OD450）。（2）采用平板克隆試驗(yàn)。將SGC-7901細(xì)胞（包括POT1-AS1敲低組、未敲低組）以1 000個(gè)/孔的密度接種在6孔板中，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，然后用甲醛溶液固定，結(jié)晶紫染色，相機(jī)拍照并計(jì)數(shù)。

1.5 細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法。使用RIPA裂解液提取SGC-7901細(xì)胞（包括POT1-AS1敲低組、未敲低組）蛋白樣品，使用BCA定量試劑盒（批號(hào)：P0010，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）檢測(cè)蛋白樣品濃度。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（美國(guó)BIORAD公司）將蛋白樣品分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，10%脫脂牛奶封閉后用一抗和相應(yīng)的二抗孵育。最后用ECL發(fā)光液（批號(hào)：WBLUF0500，美國(guó)Millipore公司）顯影，應(yīng)用Image J軟件（美國(guó)NIH公司）進(jìn)行Western blot圖片條帶灰度值分析，蛋白相對(duì)表達(dá)量=（轉(zhuǎn)染組蛋白條帶灰度值/轉(zhuǎn)染組內(nèi)參條帶灰度值）/（未轉(zhuǎn)染組目的蛋白條帶灰度值/未轉(zhuǎn)染組內(nèi)參條帶灰度值）。細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（cyclin dependent kinase 4,CDK4）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子1A（cyclin dependent kinase inhibitor 1A,CDKI1A）等抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，批號(hào)分別為ab134175、ab108357、ab109520；β-actin 抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司，批號(hào)為66009-1-Ig。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GAC組織與癌旁正常組織中POT1-AS1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 80例GAC患者CAC組織中POT1-AS1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖 1。

圖1 GAC組織與癌旁正常組織中POT1-AS1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（GAC為胃腺癌）

2.2 GAC細(xì)胞系與正常人胃黏膜上皮細(xì)胞中POT1-AS1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 GAC細(xì)胞系BGC-823、MGC-803、MKN45、SGC-7901 中 POT1-AS1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量均明顯高于正常人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖2。

圖2 GAC細(xì)胞系與正常人胃黏膜上皮細(xì)胞中POT1-AS1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（GAC為胃腺癌；與GES-1比較，*P＜0.05）

2.4 sh-POT1-AS1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)SGC-7901細(xì)胞中POT1-AS1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響 sh-POT1-AS1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，SGC-7901細(xì)胞中POT1-AS1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于未轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 sh-POT1-AS1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)SGC-7901細(xì)胞中POT1-AS1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響（與未轉(zhuǎn)染組比較，*P＜0.05）

2.5 POT1-AS1敲低對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖能力的影響 CCK-8試驗(yàn)結(jié)果顯示，POT1-AS1敲低組SGC-7901細(xì)胞增殖能力明顯低于未敲低組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；采用平板克隆試驗(yàn)作進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果顯示POT1-AS1敲低組SGC-7901細(xì)胞克隆數(shù)明顯少于未敲低組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 POT1-AS1敲低對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖能力的影響（a：CCK-8試驗(yàn)結(jié)果；b：平板克隆試驗(yàn)結(jié)果；與未敲低組比較，*P＜0.05；OD450為450nm處的吸光度）

2.6 POT1-AS1敲低對(duì)SGC-7901細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響 POT1-AS1敲低后，SGC-7901細(xì)胞中Cyclin D1、CDK4蛋白相對(duì)表達(dá)量較未敲低組明顯降低，而CDKI1A蛋白相對(duì)表達(dá)量較未敲低組明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖5。提示POT1-AS1促進(jìn)GAC細(xì)胞周期進(jìn)展。

圖5 POT1-AS1敲低對(duì)SGC-7901細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響（Cyclin D1為細(xì)胞周期蛋白D1；CDK4為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4；CDKI1A為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子1A；β-actin為β-肌動(dòng)蛋白；與未敲低組比較，*P＜0.05）

3 討論

GAC是我國(guó)常見、多發(fā)的惡性腫瘤，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是其預(yù)后不良的重要原因。早期診斷并及時(shí)治療能有效改善GAC患者的預(yù)后，提高遠(yuǎn)期生存率。因此，進(jìn)一步探索GAC發(fā)病的分子機(jī)制、診斷和治療分子靶點(diǎn)是目前GAC研究的重點(diǎn)。lncRNA作為一種廣泛存在的非編碼RNA，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過程[8]。研究表明，lncRNA在GAC發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，如IGF2-AS通過吸附miR-503調(diào)節(jié)SHOX2，從而影響GAC轉(zhuǎn)移[9]；LIFR-AS1通過miR-29a-3p/COL1A2促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和侵襲[10]；LINC01667通過miR-138-5p/Cyclin E1影響胃癌增殖[11]；LINC00641通過miR-582-5p啟動(dòng)自噬，從而影響GAC細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的耐藥性[12]；RPLP0P2促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖[13]。目前關(guān)于POT1-AS1在GAC中的表達(dá)與功能尚無相關(guān)研究，故本研究作了相關(guān)探索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)POT1-AS1在GAC組織及細(xì)胞系中呈高表達(dá)。經(jīng)sh-POT1-AS1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染（即POT1-AS1敲低）后，SGC-7901細(xì)胞中POT1-AS1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于未轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然后經(jīng)CCK-8試驗(yàn)和平板克隆試驗(yàn)證實(shí)POT1-AS1可抑制GAC細(xì)胞增殖能力。進(jìn)一步探尋POT1-AS1抑制GAC細(xì)胞增殖能力的機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在GAC細(xì)胞中敲低POT1-AS1可抑制CDK4、Cyclin D1蛋白表達(dá)并促進(jìn)CDKI1A蛋白表達(dá)，進(jìn)而阻礙細(xì)胞周期進(jìn)展，抑制細(xì)胞增殖。

綜上所述，GAC組織及細(xì)胞系中POT1-AS1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯升高；在GAC細(xì)胞中敲低POT1-AS1可抑制CDK4、Cyclin D1蛋白表達(dá)并促進(jìn)CDKI1A蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。筆者認(rèn)為POT1-AS1可作為新的GAC分子標(biāo)志物或治療GAC潛在的分子靶點(diǎn)，具有重要的臨床意義。