蘇岳峰，鄭其向，馬 曉，李家慶，伍寶朵，胡麗松，范 睿*

(1.海南大學(xué)，海南 ?？?570000；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所，海南 萬寧 571533; 3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南 普洱 665000)

【研究意義】胡椒(PipernigrumL.)是胡椒科(Piperaceae)胡椒屬(Piper)多年生常綠藤本植物，原產(chǎn)于印度，素有“香料之王”、“黑色黃金”的美譽(yù)，在人類歷史文明進(jìn)程中占有獨(dú)特地位[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界胡椒種植面積達(dá)5.53×105hm2，總產(chǎn)量達(dá)4.33×105t，目前中國胡椒種植面積近4×105hm2,年總產(chǎn)量近4×104t，主要分布在云南、海南、廣東、福建和廣西等省(區(qū))，其中海南主產(chǎn)區(qū)，年均產(chǎn)值高達(dá)20多億元、已發(fā)展成為百萬人口經(jīng)濟(jì)來源的支柱產(chǎn)業(yè)[2]。然而，在胡椒產(chǎn)業(yè)中，胡椒瘟病作為一種季節(jié)性土傳性病害，常引發(fā)植株木質(zhì)部褐化，導(dǎo)管變黑腐爛等病狀。病情嚴(yán)重時(shí)致?lián)p高達(dá)90%及以上，甚至全園毀滅、顆粒無收[3]，嚴(yán)重制約著中國胡椒產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】針對(duì)胡椒瘟病病害，張開明[4]等研究表明，辣椒疫霉(Phytophthoracapsic)是中國胡椒瘟病的主要病原菌，寄主范圍廣，氣候依賴性強(qiáng)，可侵染可可、山龍眼等熱帶水果和飲料植物以及辣椒、黃瓜等茄科和葫蘆科作物[5]，已成為熱區(qū)植物的災(zāi)害性病菌。國內(nèi)外在辣椒作物上用化學(xué)殺菌劑、生物拮抗菌開展了較為系統(tǒng)的防治研究，分離出附生細(xì)菌金屬芽孢桿菌、洋蔥芽孢桿菌等生防菌，但殺菌劑的副作用和拮抗菌的寄生性對(duì)寄主的危害依然存在較多的爭(zhēng)論[6]。近年來，植物外源誘導(dǎo)劑——茉莉酸(jasmonic acid, JA)、水楊酸(salicylic acid, SA)等作為誘導(dǎo)抗性信號(hào)的基本組分，使植物產(chǎn)生抗病性，介導(dǎo)抗性信號(hào)激活[7]，形成精巧的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和偶聯(lián)網(wǎng)絡(luò)、精密地控制各激素的整體水平，成為近年來抗病研究的一大熱點(diǎn)[8]。Zhu等研究發(fā)現(xiàn)葉面噴施水楊酸處理后能夠增強(qiáng)本氏煙對(duì)煙草花葉病毒的系統(tǒng)性抗病性[9]。SA信號(hào)誘導(dǎo)通過增強(qiáng)組織細(xì)胞的活性氧(pathogenesis-related protein，PRs)清除能力和滲透調(diào)節(jié)能力，可以明顯降低白菜根腫病和冬瓜枯萎病的發(fā)病率，提高了系統(tǒng)酶活性和抗病性效果[10]。水楊酸處理還提高種胚抗氧化物質(zhì)還原型谷胱甘肽和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸(PRO)等的含量[11]。外源JA處理能夠減輕受水稻稻瘟病病發(fā)癥狀[12]，還可以有效誘導(dǎo)辣椒對(duì)青枯病產(chǎn)生抗性，抗病效應(yīng)與體內(nèi)丙二醛(malonic dialdehyde, MDA)以及抗氧化酶活性有關(guān)[13]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前人研究表明，SA、JA信號(hào)通過激發(fā)植物體防御機(jī)制的建立來參與植物生長發(fā)育調(diào)控和對(duì)外界刺激的響應(yīng)[14]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過間接、連續(xù)和混合方式噴施5 mmol·L-1濃度的 SA、1 mmol·L-1的 JA處理“熱引1號(hào)”胡椒試驗(yàn)苗，在自然條件下接種辣椒疫霉菌后，通過表型鑒定、次生代謝物質(zhì)、內(nèi)源激素動(dòng)態(tài)變化以及各相關(guān)防御酶活性的變化研究，闡述JA、SA在胡椒抗瘟病中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試苗：“以熱引1號(hào)(P.nigrumc.v.Reyin-1)”胡椒扦插苗作為材料，按照“胡椒優(yōu)良種苗培育技術(shù)規(guī)程(DB46/T 262012)”進(jìn)行育苗，于沙床上培育生根后轉(zhuǎn)移至育苗盆中，每盆2棵苗，培育3～5個(gè)月。

供試菌種：辣椒疫霉菌，采用PDA培養(yǎng)基，于全氣候箱中恒溫(26～28 ℃)培養(yǎng)5～7 d，多次轉(zhuǎn)接純化培養(yǎng)，以保證菌種活性。供試苗和供試菌種均由海南香料飲料研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料處理 選取健康、長勢(shì)一致的胡椒苗，按照處理方式分為JA1、JA2、SA1、SA2、JA/SA1、JA/SA2、CK1、CK2 組，每組至少3株苗。CK1、CK2組為對(duì)照，用蒸餾水噴施，具體處理如下。SA1組：使用濃度為5 mmol·L-1SA處理，連續(xù)處理15 d；SA2組：間隔2 d 噴施5 mmol·L-1的SA；JA1組：單獨(dú)噴施1 mmol·L-1的JA，連續(xù)處理15 d；JA2組：間隔2 d 噴施1 mmol·L-1的JA；JA/SA1組：5 mmol·L-1的SA和1 mmol·L-1的JA混合后，連續(xù)處理15 d；JA/SA2組：5 mmol·L-1的SA和1 mmol·L-1的JA混合后，間隔2 d噴施；CK1組：連續(xù)噴蒸餾水15 d；CK2組：間隔2 d噴施蒸餾水。

觀察JA、SA噴施處理胡椒苗的生長發(fā)育狀態(tài)以及室內(nèi)接種病原菌后的變化情況，通過表型鑒定，對(duì)抗病效果顯著的處理進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。距離采樣時(shí)間第0、12、24、72和144小時(shí)等5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，于早上8：00時(shí)接種處理，用浸濕的棉花包裹，以保證病原菌的存活和侵染。用液氮存儲(chǔ)，采集 5個(gè)接種時(shí)間點(diǎn)試驗(yàn)樣品，包括根、莖和葉片，用樣品袋分裝、標(biāo)記編號(hào)、處理方式及接種時(shí)間，置于-80 ℃超低溫冰箱，同時(shí)每個(gè)處理隨機(jī)采取葉齡相似的5～10片葉片，趁鮮取回處理，用于測(cè)定電導(dǎo)率。剩余葉片分組置于烘箱，57 ℃恒溫烘干至恒重打粉。

1.2.2 表型鑒定 采樣：每組各采集5～10片葉，用樣品袋分裝好，并做好標(biāo)記。接種：將取回來的葉片整齊擺放到消毒滅菌盤子里，葉片正面朝上，用一次性注射器針頭在葉片中央(避開葉脈)刺3個(gè)小孔，用打孔器在培養(yǎng)基上取菌絲塊，用接種針將生長有菌絲的一面覆蓋住小孔，接種在針刺孔處。盤子按照采樣標(biāo)記寫上編號(hào)，于4個(gè)對(duì)角分別放上用蒸餾水浸濕的棉花團(tuán)，用大號(hào)采樣袋套住，封口，保證濕度。觀察：接種第1天起開始觀察，每隔1 d觀察1次，記錄好觀察情況，并用卡尺測(cè)量葉面壞死區(qū)病斑直徑大小，按照相關(guān)胡椒瘟病抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)各個(gè)處理病斑進(jìn)行級(jí)劃分[8]。

1.2.3 生理生化指標(biāo)測(cè)定 內(nèi)源激素測(cè)定(雙抗體夾心法測(cè)定)：制備SA、JA、JA/SA和CK噴施前、噴施后(接種前)和接種后3個(gè)時(shí)間段的葉片樣品，按照試劑盒方法進(jìn)行樣品稀釋及保存，并多功能用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm波長下各個(gè)處理組葉片組織樣品OD值，并描點(diǎn)繪制曲線計(jì)算樣品中植物茉莉酸(JA)的濃度。水楊酸(SA)和植物乙烯(ETH)的測(cè)定方法與上述相同、相關(guān)試劑盒由上海泛柯實(shí)業(yè)有限公司提供。

次生代謝物質(zhì)：測(cè)定胡椒葉片(干重)粉末中總黃酮、總多酚及多糖含量變化，按鄒文靜等植物總黃酮、多酚及多糖的含量測(cè)定方法[15]、采用75%乙醇溶劑浸提，建立樣品與吸光度值A(chǔ)之間標(biāo)準(zhǔn)線性關(guān)系、測(cè)定含量。

防御酶PAL和PPO活性：PAL和PPO催化產(chǎn)物在290和420 nm處有特征吸收光值，分別測(cè)定290和420 nm處的吸光值變化，計(jì)算相對(duì)酶活。相關(guān)試劑盒由南京建成生物科技、上海泛柯實(shí)業(yè)有限公司提供。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用立體顯微鏡Stemi 2000-C、相機(jī)Canon EOS 5D Mark IV觀察和采集實(shí)驗(yàn)圖片，SPSS 2017軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析，采用Duncan新復(fù)極差法，比較差異及顯著性，OriginPro 2017軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源JA、SA連續(xù)處理20 d胡椒苗的變化

由圖1可知，5 mmol·L-1SA、1 mmol·L-1JA和JA/SA混合噴施，連續(xù)處理20 d，噴施5 mmol·L-1SA和JA/SA幼嫩的莖葉均出現(xiàn)不同程度受損。

2.2 接種病原菌前后表型變化

2.2.1 JA、SA接種病原菌發(fā)病前后的葉片變化 從圖2可以看出，對(duì)照組CK1、CK2最先在48 h發(fā)病，SA1、SA2和JA1在72 h出現(xiàn)病斑、JA2發(fā)病時(shí)間最晚，96 h出現(xiàn)病斑。96 h，所有處理組葉片均表現(xiàn)出瘟病病斑(表1)。

表1 接種胡椒瘟病病原菌的葉片情況

120 h時(shí)，CK1組和CK2組病菌沿著葉脈蔓延至葉緣，整個(gè)葉片出現(xiàn)黑色水質(zhì)狀病斑，顯微鏡下可在氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中央看到白色菌絲附著；與接種后96 h比較，SA1組、JA1組水質(zhì)狀病斑面積不斷擴(kuò)大，所有葉片顏色逐漸變暗，失去綠色光澤(圖2)。

2.2.2 接種病原菌后發(fā)病情況 由表2可知，JA/SA2組、JA2組病斑相對(duì)面積分別為12.50%和15.13%，病情級(jí)數(shù)均為1級(jí)；SA2組、JA/SA1組、SA1組和 JA1組病斑相對(duì)面積分別為26.27%、32.18%、33.11%、35.60%，病情級(jí)數(shù)均為2級(jí)。而CK1和CK2則達(dá)到了4級(jí)病情，病斑相對(duì)面積分別為78.34%、76.60%，顯著高于各處理組。綜合表型、發(fā)病情況以及經(jīng)濟(jì)效益，JA組、SA組和JA/SA組間隔2 d為比較優(yōu)良的處理方式，SA2組、SA2組和JA/SA2組為最優(yōu)處理。

表2 JA、SA接種病原菌后96 h、120 h病斑變化

2.3 JA、SA間隔處理前后內(nèi)源JA、SA和ETH含量變化

JA2、SA2處理前后胡椒葉片內(nèi)源JA、SA和ETH含量都發(fā)生了不同趨勢(shì)的變化。內(nèi)源JA含量變化：由圖3-A可知，JA2組、SA2組和JA/SA2組外源劑處理前，葉片內(nèi)源JA含量維持在1600 pmol·L-1水平；處理后(即接種前)CK2組無明顯變化，JA2組、SA2組和JA/SA2組處理均使內(nèi)源JA有所增加；接種病原菌后，JA2組內(nèi)源JA含量達(dá)到了最高水平，SA2組含量次之，JA/SA2組與接種前相比無明顯變化，接種后CK2組內(nèi)源激素也出現(xiàn)少量增加。

由圖3-B可知，JA2、SA2、CK2和JA/SA2外源處理前，葉片內(nèi)水楊酸含量維持在2700 pmol·L-1水平；處理后(即接種前)，CK2組和SA2組葉片內(nèi)源水楊酸含量與處理前變化程度小，無明顯差異，JA/SA2組、JA2組內(nèi)源水楊酸含量與處理前相比升高。接種后SA2組葉片內(nèi)源水楊酸含量達(dá)最高水平，JA2組次之，CK2組變化幅度相對(duì)較小。內(nèi)源乙烯ETH含量變化：由圖3-C可知，JA2、SA2、CK2和JA/SA2外源處理前，葉片內(nèi)源ETH含量維持在42 ng·L-1水平。JA2組、JA/SA2組的內(nèi)源乙烯ETH含量達(dá)到了84和104 ng·L-1水平，SA2組和CK2組與處理前無太大變化；接種后JA2組、JA/SA2組內(nèi)源乙烯ETH含量達(dá)最高水平為150和160 ng·L-1，SA2組與CK2組內(nèi)源乙烯ETH含量達(dá)70和90 ng·L-1。

2.4 接種病菌后總黃酮、總多酚和多糖含量變化

從圖4-A可看出，接種后JA2、SA2、CK2和JA/SA2處理總黃酮含量呈現(xiàn)升高后降低變化，CK接種后第12小時(shí)總黃酮含量最高，24、72和144 h出現(xiàn)降低趨勢(shì)，并且降低較快；JA2、SA2和JA/SA2處理總黃酮含量在24 h達(dá)到最高，在72、144 h總黃酮含量均出現(xiàn)降低趨勢(shì)。

由圖4-B可知，JA2、SA2、CK2和JA/SA2處理后接種胡椒瘟病病菌，隨著接種時(shí)間延長，5個(gè)接種時(shí)間點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的葉片多酚含量均出現(xiàn)下降情況；CK2組的總多酚含量下降幅度較為明顯，各時(shí)間點(diǎn)均低于JA2組、SA2組和JA/SA2組的，并于144 h達(dá)到最低；JA2組、SA2組變化趨勢(shì)一致，各接種時(shí)間點(diǎn)多酚含量均高于CK2組和JA/SA2組。

由圖4-C中可知，接種病菌，各處理胡椒組織葉片多糖含量均出現(xiàn)先升高后降低，在24 h多糖含量為最高，而24 h后多糖含量出現(xiàn)下降趨勢(shì)；CK2組在第12～144小時(shí)均呈降低趨勢(shì)。各接種時(shí)間點(diǎn)多糖含量以JA2組最高，SA2組次之，CK2組最低。

2.5 接種病原菌后PAL、PPO活性以及膜質(zhì)過氧化程度

接種后，JA2、JA/SA2、SA2以及CK2組外源處理胡椒葉片組織內(nèi)PAL活性變化總體先升高后降低趨勢(shì)(圖5-A)，24 h胡椒葉片組織內(nèi)PAL活力CK2組最高，且其活力變化程度較小，JA2組、SA2組變化趨勢(shì)相當(dāng)，是CK2組的1.85倍，JA/SA2組活力是CK2組的1.42倍；在第24～144小時(shí)后，各處理活力均出現(xiàn)下降。

由圖5-B可知，胡椒葉片組織內(nèi) PPO活性在SA2、JA2和JA/SA2中保持較高活性，接種病原菌后，出現(xiàn)先升高趨勢(shì)；SA2組、JA2組和JA/SA2組變化趨勢(shì)一致，在72 h SA2組達(dá)到最高，是CK2組的1.31倍，JA2組是CK2組的1.2倍，JA/SA2組是CK2組的1.1倍，72 h后降低。而CK2組在24 h的PPO活性達(dá)到最高，隨后降低。

3 討 論

水楊酸和茉莉酸在病原菌入侵過程中扮演著不可或缺的角色[16]，研究結(jié)果表明，噴施5 mmol·L-1SA、1 mmol·L-1JA和JA/SA 混合處理“熱引1號(hào)胡椒”后，可以有效抑制胡椒瘟病病斑面積擴(kuò)大，同時(shí)不同的處理時(shí)間會(huì)有不同的效果，具體來說間隔處理方式比連續(xù)處理方式對(duì)辣椒疫霉菌的抑制力更強(qiáng)。鄒志燕等[17]在水稻，金夏紅等[18-19]在小麥、煙草上的研究也有相同結(jié)果。推測(cè)可能是外源JA、SA激活胡椒植株體內(nèi)產(chǎn)生抗病信號(hào)，這些抗性信號(hào)提高防御酶活性，從而使得胡椒產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性。

當(dāng)JA和SA同時(shí)噴施時(shí)，胡椒瘟病抗性生理生化效果明顯弱于單獨(dú)噴施JA或SA，與曹寧[20]結(jié)果相符，這表明SA、JA在介導(dǎo)胡椒抗胡椒瘟病的過程中可能也存在相互拮抗作用，但是SA與JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)往往不是孤立的，存在交叉轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑還存在著與濃度有關(guān)的協(xié)同或拮抗作用[21]；JA、SA和JA/SA處理后均使胡椒葉片內(nèi)源JA、SA有所增加，對(duì)照組無明顯變化，但接種病原菌后葉片內(nèi)源JA、SA、ETH含量達(dá)到了最高水平，胡椒苗葉片內(nèi)源JA、SA含量中單獨(dú)噴施JA或SA比JA/SA混合噴施的高，JA和JA/SA混合噴施處理后可以明顯提高胡椒葉片內(nèi)源ETH的含量。在甜瓜和水稻的研究中，魯秀梅、徐以華等[22]也發(fā)現(xiàn)接種病菌后植株體內(nèi)源激素JA、SA和ETH含量均顯著增加，可能是胡椒在遭到病原菌侵染和外源誘導(dǎo)劑刺激，使得苯丙氨酸解氨酶(PAL)、腺苷酸合成酶(ATP)等酶活性發(fā)生變化，解除了對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的抑制[23-24]，促進(jìn)胡椒內(nèi)源JA和SA大量合成。有研究表明內(nèi)源JA伴隨著乙烯(ETH)的變化而發(fā)生變化，ETH與JA存在協(xié)作交互作用，而SA含量與JA和ETH沒有緊密聯(lián)系[25]。此外，乙烯既是一種與茉莉酸具有協(xié)同作用的抗病信號(hào)分子，也可以作為毒力因子致使植物感病，茉莉酸與乙烯信號(hào)途徑共同調(diào)控植保素的合成[26]。

對(duì)各處理組接種胡椒瘟病病原菌后，胡椒葉片組織內(nèi)PAL活性變化情況總體表現(xiàn)為先升高后降低趨勢(shì)，PPO也先升高后又降低；而CK處理各接種時(shí)間點(diǎn)PAL活力明顯低于其它3個(gè)處理。這與紋枯病毒素侵染水稻和冬瓜枯萎病防治等研究中表現(xiàn)相似[27]。苯丙氨酸解氨酶(PAL)在植物抗病、生理代謝等過程中不可或缺，是水楊酸途徑中的限速酶，也是苯丙烷類代謝過程的關(guān)鍵酶，并參與黃酮、多酚等抗菌物質(zhì)的合成[28-29]；研究表明接種病原菌后，胡椒葉片組織內(nèi)PPO活性在SA、JA和JA/SA中依然保持較高活性，接種病原菌后，出現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，胡椒葉片組織多酚含量在0～144 h中均出現(xiàn)降低，CK下降速度較快，胡椒葉片內(nèi)多酚的降低與PPO多酚氧化酶關(guān)系密切，可能是PPO參與了胡椒葉片中多酚的催化氧化，產(chǎn)生對(duì)病原菌有毒害作用的醌類等物質(zhì)，并參與機(jī)體中木質(zhì)素的合成，增加細(xì)胞結(jié)構(gòu)木質(zhì)化程度，從而有效抑制病原物的擴(kuò)展[28]。

4 結(jié) 論

5 mmol·L-1SA、1 mmol·L-1JA和JA/SA 混合處理“熱引1號(hào)胡椒”后，可以抑制胡椒瘟病病斑面積擴(kuò)大。JA、SA抗病信號(hào)傳導(dǎo)是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，在眾多的高植物中表現(xiàn)出相似性，可能JA、SA在這些植物中存在相同的調(diào)節(jié)信號(hào)。而JA、SA信號(hào)中存在的拮抗或協(xié)同效果與其相對(duì)濃度有關(guān)，如果對(duì)拮抗點(diǎn)和協(xié)同點(diǎn)進(jìn)行人為調(diào)控，挖掘抗病相關(guān)基因，可為抗病機(jī)理、創(chuàng)新種質(zhì)資源及遺傳育種奠定基礎(chǔ)，研究作物中JA、SA的作用在農(nóng)業(yè)上具有重要意義。