吳 俊，林徐劍，施曉萍

（正大青春寶藥業(yè)有限公司 浙江 杭州 310023）

澤瀉湯標(biāo)準(zhǔn)顆粒處方來源于《金匱要略》（東漢張仲景）。主治水停心下，清陽(yáng)不升，濁陰上犯，頭目昏眩，現(xiàn)用于耳源性眩暈[1-3]。澤瀉湯標(biāo)準(zhǔn)顆粒由澤瀉和白術(shù)2味藥物組成，澤瀉中主要有三萜類、倍半萜類、二萜類化合物和其他成分，其中23-乙酰澤瀉醇B具有降脂、利尿的活性[4-5]。白術(shù)主要有苷類、多糖類、揮發(fā)性成分和氨基酸類等，其中白術(shù)內(nèi)酯類成分是白術(shù)的藥效成分，具有較好的降脂、抗炎活性。白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ是內(nèi)酯類成分的主要物質(zhì)之一，含量較高，性質(zhì)穩(wěn)定[6-7]。所以含量測(cè)定指標(biāo)為白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和23-乙酰澤瀉醇B。通過含量測(cè)定，為澤瀉湯標(biāo)準(zhǔn)顆粒質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1.儀器與材料

高效液相色譜儀（Agilent1260系列，DAD檢測(cè)器），色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；KQ-100DE超聲波清洗器（昆山超聲）；BS-224 S型電子分析天平（賽多利斯）。乙腈（色譜純，美國(guó)天地），其他為分析純，水為超純水，23-乙酰澤瀉醇B對(duì)照品（購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111846-201504，含量以99%計(jì)算），白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)照品（購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111978-201501，含量以99.9%計(jì)算）。

2.方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×150 mm, 5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水，梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；波長(zhǎng)：208 nm（檢測(cè)23-乙酰澤瀉醇B）、222 nm（檢測(cè)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ），見表1。

表1 流動(dòng)相梯度表

2.2 樣品溶液制備方法

2.2.1對(duì)照品溶液的制備 分別取適量的白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)照品、23-乙酰澤瀉醇B對(duì)照品，精密稱定，加入60%甲醇制備，即得。

2.2.2供試品溶液的制備 取澤瀉湯顆粒（規(guī)格：4 g/袋）適量，研細(xì)，混合均勻，精密稱取2 g，置具塞錐形瓶中，加入60%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率45 KHz）30 min，放至室溫，再稱定重量，用60%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察[3,8]

2.3.1線性 取配置好的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣不同體積的量，進(jìn)樣檢測(cè)，以對(duì)照品峰面積（X）為橫坐標(biāo)，對(duì)照品進(jìn)樣量（Y）為縱坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，見表2。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.3.2專屬性 將澤瀉湯標(biāo)準(zhǔn)顆粒處方中澤瀉去除，即只有白術(shù)，按澤瀉湯的制備方法制備成顆粒，配制成缺澤瀉的空白陰性對(duì)照溶液。相同方法制備成缺白術(shù)的空白陰性對(duì)照溶液。將上述空白陰性對(duì)照溶液進(jìn)樣檢測(cè)。結(jié)果：各空白陰性對(duì)照溶液色譜圖中，在含量測(cè)定成分的色譜峰保留時(shí)間處無(wú)其他色譜峰出現(xiàn)，專屬性良好。見圖1～2。

圖1 23-乙酰澤瀉醇B陰性對(duì)照色譜圖

圖2 白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ陰性對(duì)照色譜圖

2.3.3精密度（包括重復(fù)性和中間精密度）

2.3.3.1重復(fù)性 按供試品處理方法平行處理6份，進(jìn)樣10 μL測(cè)定，根據(jù)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、23-乙酰澤瀉醇B峰面積和對(duì)照品線性方程，計(jì)算白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、23-乙酰澤瀉醇B含量和RSD。白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量平均值為0.597 mg/袋，RSD為1.23%；23-乙酰澤瀉醇B含量平均值為1.671 mg/袋，RSD為1.54%。

2.3.3.2中間精密度 3人處理樣品，使用同一設(shè)備測(cè)定含量，操作方法同重復(fù)性試驗(yàn)，考察不同人員所測(cè)得各成分含量和RSD。白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量平均值分別為0.597 mg/袋、0.593 mg/袋、0.593 mg/袋，RSD為0.39%；23-乙酰澤瀉醇B含量平均值分別為1.671 mg/袋、1.651 mg/袋、1.613 mg/袋，RSD為1.79%。

2.3.4準(zhǔn)確度（回收率實(shí)驗(yàn)）

取已知含量的澤瀉湯標(biāo)準(zhǔn)顆粒樣品6份，取樣量為1 g，加入定量的對(duì)照品溶液，按供試品處理方法制備，測(cè)定含量，計(jì)算回收率。白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ回收率試驗(yàn)平均回收率結(jié)果為102.18%，RSD為0.67%；23-乙酰澤瀉醇B回收率試驗(yàn)平均回收率結(jié)果為100.35%，RSD為1.73%。數(shù)據(jù)列于表3～表4。

表3 白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ回收率試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

表4 23-乙酰澤瀉醇B回收率試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.3.5耐用性

2.3.5.1溶液穩(wěn)定性。取同一供試品溶液分別于0～24 h進(jìn)樣，測(cè)定白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和23-乙酰澤瀉醇B的峰面積并計(jì)算RSD。結(jié)果：白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的RSD為0.43%，23-乙酰澤瀉醇B為0.77%。說明24 h內(nèi)溶液穩(wěn)定性良好。

2.3.5.2色譜柱柱溫的變化。實(shí)驗(yàn)方法按照含量測(cè)定的供試品溶液配置方法，保持其他色譜條件不變，改變柱溫±5℃（30±5℃），測(cè)定樣品含量，考察RSD。結(jié)果：柱溫25℃白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量平均值0.587 mg/袋，RSD為1.58%，23-乙酰澤瀉醇B含量平均值為1.849 mg/袋，RSD為1.01%；柱溫35℃白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量平均值0.597 mg/袋，RSD為1.46%，23-乙酰澤瀉醇B含量平均值為1.791 mg/袋，RSD為0.83%。說明在柱溫±5℃（30±5℃）的情況下，含量檢測(cè)結(jié)果不受影響。

2.3.5.3檢測(cè)波長(zhǎng)的變化。實(shí)驗(yàn)方法按照含量測(cè)定的供試品溶液配置方法，保持其他色譜條件不變，改變檢測(cè)波長(zhǎng)±5 nm[白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ為（222±5）nm，23-乙酰澤瀉醇B為（208±5）nm]，測(cè)定樣品含量，考察RSD。結(jié)果：白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ在波長(zhǎng)217 nm下含量平均值為0.593 mg/袋，RSD為1.43%，在波長(zhǎng)227 nm下含量平均值為0.596 mg/袋，RSD為1.44%；23-乙酰澤瀉醇B在波長(zhǎng)207 nm下含量平均值為2.003 mg/袋，RSD為0.52%，在波長(zhǎng)213 nm下含量平均值為1.935 mg/袋，RSD為0.45%。說明在檢測(cè)波長(zhǎng)±5 nm的情況下，含量檢測(cè)結(jié)果不受影響。

2.3.5.4流速的變化。實(shí)驗(yàn)方法 按照含量測(cè)定的供試品溶液配置方法，保持其他色譜條件不變，改變流速為（1.0±0.1）mL/min，測(cè)定樣品含量，考察RSD。結(jié)果：流速0.9 mL/min時(shí)，內(nèi)酯Ⅲ含量平均值0.589 mg/袋，RSD為1.30%，23-乙酰澤瀉醇B含量平均值為1.975 mg/袋，RSD為0.65%；流速1.1 mL/min時(shí)，內(nèi)酯Ⅲ含量平均值0.588 mg/袋，RSD為1.28%，23-乙酰澤瀉醇B含量平均值為1.972 mg/袋，RSD為0.70%。說明在流速為（1.0±0.1）mL/min的情況下，含量檢測(cè)結(jié)果不受影響。

2.4 樣品的含量測(cè)定

取4批樣品按正文中含量測(cè)定項(xiàng)下供試品溶液的制備與測(cè)定方法進(jìn)行制備與測(cè)定，測(cè)定結(jié)果，見表5。

表5 樣品的含量測(cè)定結(jié)果

3.討論

該含量測(cè)定方法在同一色譜條件下，利用流動(dòng)相梯度洗脫的方式和DAD檢測(cè)器同時(shí)開啟2個(gè)被測(cè)成分的檢測(cè)波長(zhǎng)，同時(shí)測(cè)定白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和23-乙酰澤瀉醇B的含量。該方法進(jìn)行了多種流動(dòng)相梯度洗脫條件的摸索。最終選擇乙腈-水為流動(dòng)相，以及最佳的梯度洗脫條件，并且研究了不同提取溶劑（20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、80%甲醇、甲醇）對(duì)供試品的超聲提取研究，從含測(cè)成分的色譜峰峰面積以及分離度等方面考慮，優(yōu)選60%甲醇。并且明確了色譜柱類型、流速、波長(zhǎng)、柱溫等參數(shù)。經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證，此含量測(cè)定方法有良好的精密度、準(zhǔn)確度、線性、范圍、耐用性，且專屬性無(wú)干擾完全符合要求。

綜上所述，一般中藥復(fù)方制劑對(duì)于檢測(cè)不同藥味中的不同成分，采用不同的色譜條件進(jìn)行檢測(cè)。本方法采用同一色譜條件同時(shí)測(cè)定澤瀉湯標(biāo)準(zhǔn)顆粒中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和23-乙酰澤瀉醇B含量，能夠簡(jiǎn)化供試品制備步驟、提高檢測(cè)效率、降低檢測(cè)成本。