韓瀟，畢鋇鋇，黃鮮菊，胡琳莉

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，鄭州 450052)

數(shù)十年來，盡管有數(shù)百萬夫妻從體外受精(IVF)中受益，但輔助生殖技術(shù)(ART)對不孕女性的安全性一直備受關(guān)注[1]。隨著ART領(lǐng)域的重大進步，每個周期可轉(zhuǎn)移的可用胚胎數(shù)量也在增加，導致大量多余的胚胎冷凍保存[2]，以備將來進行凍融胚胎移植(freeze-thaw embryo transfer，F(xiàn)ET)。既往的研究表明，F(xiàn)ET可降低中重度卵巢過度刺激綜合征(OHSS)的風險[3]，也可減少控制性卵巢過度刺激(COH)引起的其他副作用[4]，同時也可改善子宮內(nèi)膜的容受性[5]。通常，我們中心的冷凍周期中，一個冷凍管中保存的胚胎數(shù)量不超過兩個。多胎妊娠是輔助生殖技術(shù)的一個嚴重并發(fā)癥，可引起妊娠期高血壓、貧血、胎膜早破、早產(chǎn)及產(chǎn)后出血等。而隨著我國計劃生育政策的變化，傾向于單胚胎移植的夫婦數(shù)量在增加，因此，需要再次冷凍保存于同一冷凍管內(nèi)的胚胎。如果患者的身體狀況在胚胎解凍后的移植日不適合進行移植，也需要將胚胎再次冷凍。此外，在胚胎植入前遺傳學檢測(preimplantation genetic testing，PGT)周期中再次活檢也可能導致胚胎再次冷凍保存?；谂咛ザ卫鋬龅陌l(fā)生率在逐漸增加，我們有必要評估反復(fù)凍融對妊娠結(jié)局及新生兒結(jié)局的影響。

目前，關(guān)于胚胎二次凍融對妊娠結(jié)局及新生兒結(jié)局的影響研究較少。以往的研究表明，二次凍融胚胎的發(fā)育潛能及其對孕產(chǎn)結(jié)局的影響仍存在爭議[5]。本研究旨在分析二次玻璃化凍融胚胎對凍融單囊胚移植妊娠和新生兒結(jié)局的影響，以便為臨床醫(yī)生和患者選擇二次玻璃化凍融胚胎提供參考。

資料和方法

一、研究對象

回顧性分析2017年1月至2020年4月在鄭州大學第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學中心行FET的患者病例資料。納入標準：(1)年齡≤40歲；(2)BMI≤30 kg/m2；(3)行單囊胚移植；(4)輸卵管或男方因素不孕癥女性；(5)抗苗勒管激素(AMH)>1.1 ng/ml。排除標準：(1)女方供卵、胚胎植入前遺傳學診斷(preimplantation genetic diagnosis，PGD)、染色體異常、單基因病；(2)子宮畸形(單角子宮、縱膈子宮、殘角子宮、鞍狀子宮等)及子宮器質(zhì)性疾病如宮腔粘連、子宮內(nèi)膜增生、子宮內(nèi)膜息肉、≥4 cm的子宮肌瘤、Ⅲ期或IV期子宮內(nèi)膜異位癥；(3)卵巢相關(guān)異常如多囊卵巢綜合征、卵巢功能不全、卵巢早衰等；(4)任何可能與不良妊娠結(jié)局相關(guān)的嚴重合并癥，如糖尿病、先天性心臟病、垂體瘤、甲狀腺疾病等。行二次凍融及單次凍融囊胚移植的患者均簽訂了知情同意書。

二、研究方法

1.分組：共納入1 201例行單囊胚凍融周期移植的患者，根據(jù)胚胎經(jīng)歷的冷凍次數(shù)，分為雙凍組(49例)和單凍組(1 152例)。每個患者均只有一個周期被納入研究。通過傾向性評分匹配對兩組患者進行1∶3匹配，匹配變量包括年齡、基礎(chǔ)FSH、不孕類型、治療方案。匹配后產(chǎn)生雙凍組(n=49)和單凍組(n=147)。

2.囊胚培養(yǎng)及評分：取卵16～18 h后根據(jù)兩個原核的形成來確定受精方式(IVF/ICSI)。第3天將胚胎轉(zhuǎn)至囊胚培養(yǎng)液G2(Vitrolife)中進行囊胚培養(yǎng)。第5天，至少有兩名胚胎學工作人員根據(jù)Gardner評分系統(tǒng)[6]對囊胚進行評分，在本中心，細胞數(shù)為6～10、囊胚評分≥3BB的視為優(yōu)質(zhì)囊胚。

3.囊胚的凍融：囊胚的冷凍及解凍分別采用玻璃化快速冷凍、解凍方法。在玻璃化冷凍前，用激光脈沖(OCTAX laser shot，MTG)人工收縮囊胚腔。根據(jù)Vit試劑盒(Kitazato公司，日本)的說明，按照傳統(tǒng)方法[7]進行玻璃化冷凍和加溫。復(fù)蘇后的囊胚在囊胚培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h，如果一半以上的細胞完整，囊胚腔再次擴張，則視為囊胚存活。

4.內(nèi)膜準備及囊胚移植：(1)自然周期：對于月經(jīng)周期和排卵規(guī)律的患者采用自然周期方案。在月經(jīng)周期的第8～11天，使用經(jīng)陰道超聲監(jiān)測卵泡發(fā)育及子宮內(nèi)膜情況。當優(yōu)勢卵泡直徑>14 mm時，測定尿LH水平，當出現(xiàn)尿LH峰值時，測定血清E2、LH和孕酮(P)水平，以確定排卵時間。若優(yōu)勢卵泡直徑在18～20 mm之間，但未出現(xiàn)LH激增，則于當日上午給予人絨毛膜促性腺激素(HCG，珠海麗珠)10 000 U肌肉注射誘導排卵。排卵后，口服達芙通(蘇威制藥，荷蘭)，10 mg/次，每天2次及肌肉注射黃體酮(浙江仙琚)40 mg，于第6天在B超引導下進行單個優(yōu)質(zhì)囊胚移植，移植后繼續(xù)按原劑量進行黃體支持。(2)人工周期：在月經(jīng)期或黃體酮撤退性出血的第2～3天開始給予補佳樂(拜耳，德國)2～4 mg/d，通過超聲監(jiān)測子宮內(nèi)膜厚度，根據(jù)血清雌激素水平和子宮內(nèi)膜情況調(diào)整補佳樂的用量，當子宮內(nèi)膜厚度≥8 mm時，促排卵用藥同自然周期，于第6天在B超引導下進行單個優(yōu)質(zhì)囊胚移植，移植后繼續(xù)按原劑量進行黃體支持。

5.妊娠判斷：移植術(shù)后4～6周，行陰道超聲檢測見孕囊及胎心搏動，為臨床妊娠；若β-HCG陽性(血清β-HCG>5 U/L)而子宮內(nèi)未見孕囊，但宮腔外可見孕囊者為異位妊娠。

6.分析指標：著床率=孕囊數(shù)/胚胎種植數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；異位妊娠率=異位妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；活產(chǎn)率=活產(chǎn)周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；多胎妊娠率=多胎妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%。小于37周分娩為早產(chǎn)，出生體重低于2 500 g為低出生體重兒。

三、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、雙凍胚胎基本情況

雙凍組共解凍50枚囊胚，其中1枚未存活，故其解凍存活率為98.0%。在雙凍組的49個移植周期中，其中43個周期為之前的移植周期中同時解凍了同一凍存管內(nèi)共同保存的兩枚胚胎，因患者為瘢痕子宮選擇單囊胚移植，二次冷凍剩余囊胚，本次為二次凍融單囊胚移植；5個周期為之前的移植周期中同時解凍了同一凍存管內(nèi)共同保存的兩枚胚胎，因患者宮頸機能不全選擇單囊胚移植，二次冷凍剩余囊胚，本次為二次凍融單囊胚移植；1個周期為之前的移植周期中因患者個人原因，術(shù)前臨時要求取消移植，二次冷凍囊胚，本周期為二次凍融單囊胚移植。

二、兩組患者的基本資料

兩組患者的年齡、不孕年限、BMI、基礎(chǔ)FSH水平、AMH水平、不孕類型、內(nèi)膜準備方案、移植日子宮內(nèi)膜厚度均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者一般資料及內(nèi)膜情況比較

三、兩組患者的妊娠結(jié)局

統(tǒng)計結(jié)果顯示，雙凍組與單凍組之間的著床率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率、異位妊娠率以及活產(chǎn)率均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表2)。

表2 兩組患者臨床妊娠結(jié)局比較[%]

四、兩組患者的新生兒結(jié)局

本研究入組患者共有82例活產(chǎn)單胎，其中64例來自單凍組、18例來自雙凍組。對比兩組活產(chǎn)單胎的新生兒結(jié)局，新生兒的男女比例、早產(chǎn)率、出生體重、低出生體重率、新生兒疾病發(fā)生率均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；與單凍組相比，雙凍組的孕周顯著減少(P<0.05)，剖宮產(chǎn)率顯著升高(P<0.05)(表3)。另外，單凍組內(nèi)有一例新生兒疝氣患者，兩組均無死產(chǎn)或新生兒死亡的報道。

表3 兩組患者活產(chǎn)單胎的新生兒結(jié)局

討 論

由于ART的巨大進步，胚胎冷凍保存已成為IVF臨床治療中廣泛使用的有效方法，成功的胚胎冷凍保存方法將增加單個卵巢刺激周期中的累積妊娠率。為了減少多胎妊娠的發(fā)生率，臨床醫(yī)生及患者對單囊胚移植的選擇增加。在本研究中，我們評估了二次玻璃化凍融胚胎對凍融單囊胚移植妊娠和新生兒結(jié)局的影響，結(jié)果顯示：二次玻璃化冷凍組(雙凍組)與單次玻璃化冷凍組(單凍組)之間的著床率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率、異位妊娠率、多胎妊娠無統(tǒng)計學差異，兩組間新生兒的性別比例、早產(chǎn)率、新生兒出生體重、低出生體重率、新生兒疾病發(fā)生率也無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；雙凍組的剖宮產(chǎn)率顯著高于單凍組，雙凍組的孕周顯著低于單凍組(P<0.05)。

胚胎的質(zhì)量被認為是影響胚胎發(fā)育潛力的重要因素，并且在胚胎著床中起著至關(guān)重要的作用[8]。早期對于胚胎重復(fù)冷凍影響的評估主要集中于小鼠胚胎。Fathi等[9]發(fā)現(xiàn)，小鼠胚胎的重新玻璃化冷凍不影響胚胎的存活率和囊胚形成率，但會顯著減少內(nèi)細胞團細胞數(shù)量和囊胚直徑。Vitale等[10]的結(jié)果顯示，小鼠胚胎經(jīng)歷三次凍融后的細胞數(shù)量顯著少于未經(jīng)冷凍的胚胎，但凍融胚胎仍能存活三個連續(xù)的凍融周期，并且可以在體外發(fā)育。Ling等[11]認為，胚胎細胞數(shù)目的減少并不意味著隨后胚胎體外或體內(nèi)發(fā)育能力的下降。同樣地，Sheehan等[12]的研究也表明，再次玻璃化冷凍對小鼠胚胎著床前發(fā)育及著床潛能影響不大。

隨后的一些研究評估了人類胚胎經(jīng)歷二次冷凍后對于胚胎發(fā)育潛能及妊娠結(jié)局的影響。Murakami等[13]和Zheng等[14]比較了重新玻璃化冷凍胚胎移植與初次凍融胚胎移植的臨床結(jié)局，結(jié)果表明，兩次冷凍保存組的流產(chǎn)率顯著高于對照組。而Kumasako等[15]的研究指出，重復(fù)玻璃化冷凍組和對照組孕婦的著床率、臨床妊娠率及流產(chǎn)率均無統(tǒng)計學差異；Cobo等[16]的研究也發(fā)現(xiàn)，二次玻璃化冷凍胚胎移植周期的胚胎存活率、著床率和臨床妊娠率與新鮮周期相當；Check等[17]的研究也表明，使用二次冷凍的胚胎不會降低植入率，我們的結(jié)果與其研究一致。我們發(fā)現(xiàn)，Murakami等[13]和Zheng等[14]的研究均使用了兩種冷凍保存方法，即緩慢冷凍然后玻璃化冷凍，而Kumasako等[15]和Cobo等[16]及我們的研究的兩次冷凍方法均為玻璃化冷凍。不同的冷凍保存方法可能是造成結(jié)果之間差異的原因。學者柏海燕等[18]發(fā)表的一篇關(guān)于中途胚胎植入前遺傳學診斷/篩查(Midway PGD/PGS)病例報道中報道了一名因行Midway PGD/PGS而接受二次凍融囊胚移植患者的妊娠結(jié)局，該患者獲臨床妊娠，孕39周剖宮產(chǎn)一男嬰，體重3 000 g，發(fā)育正常。2018年中華醫(yī)學會制定的關(guān)于冷凍胚胎保存時限的中國專家共識指出[19]，胚胎冷凍保存對FET妊娠率以及子代出生缺陷率沒有顯著影響。Nagy等[20]的研究表明，與慢速冷凍相比，玻璃化冷凍對胚胎的損傷更小，可以顯著地提高胚胎的存活率，從而提高累積妊娠率及輔助生殖的安全性，并且玻璃化冷凍技術(shù)的實施，也促進了患者對選擇性單囊胚移植的接受。

有研究發(fā)現(xiàn)，相對于不分質(zhì)量的雙囊胚移植，移植單個優(yōu)質(zhì)囊胚可顯著改善種植率，并極大地降低多胎率[21]。在患者條件及胚胎質(zhì)量適合的情況下，單囊胚移植是一個更優(yōu)選擇。評估胚胎經(jīng)歷二次冷凍后進行單囊胚移植對臨床妊娠及孕產(chǎn)結(jié)局的影響，提供患者對先前儲存的胚胎進行再冷凍保存的選擇可能會鼓勵更多患者對移植的胚胎數(shù)量采取更謹慎的態(tài)度。此外，并非所有的二次冷凍胚胎均會被移植，在我們中心，從2017年1月到2020年4月，根據(jù)上述納入和排除標準進行選擇，共有189例患者進行了二次胚胎冷凍，其中135例患者(71.43%)的胚胎仍在保存中，僅有54例患者(28.57%)進行了二次冷凍胚胎移植。

胚胎二次凍融周期中新生兒的健康也是患者非常關(guān)心的問題。本研究的49例雙凍組患者，其不孕類型均為繼發(fā)不孕，且有43例因瘢痕子宮行單囊胚移植而二次冷凍了囊胚。研究顯示，瘢痕子宮再妊娠選擇剖宮產(chǎn)分娩方式的比例高于自然分娩[22]，這也解釋了本研究中雙凍組的剖宮產(chǎn)率顯著高于單凍組這一結(jié)果。與自然分娩的分娩時機的不確定性相比，剖宮產(chǎn)可由于母嬰因素及母親的個人選擇而人為地確定分娩時機，本研究的結(jié)果顯示，雙凍組的孕周顯著小于單凍組的孕周，但雙凍組均為剖宮產(chǎn)，故此結(jié)果并不能說明二次冷凍胚胎對孕周有不良影響。Murakami等[13]的研究分析了二次冷凍胚胎移植的圍產(chǎn)期結(jié)局，結(jié)果顯示，雙凍組的平均體重有下降趨勢，但其在分析中合并了單胎和雙胎。而本研究在分析圍產(chǎn)期結(jié)局時僅納入了活產(chǎn)單胎的數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，二次冷凍組與單次冷凍組相比，新生兒出生體重、性別比、先天性缺陷之間沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)，與Zheng等[14]的研究結(jié)果一致。

本研究所納入的周期均為單囊胚移植周期，并且對年齡、基礎(chǔ)FSH、不孕類型、內(nèi)膜準備方案進行匹配，兩組患者匹配后的一般資料均無統(tǒng)計學差異，這更有利于明確胚胎冷凍次數(shù)對于妊娠結(jié)局的影響。然而，當前的研究也有一些局限性：這是在單個中心進行的回顧性隊列研究，并且樣本量有限。但該研究仍在一定程度上顯示了二次冷凍保存胚胎的妊娠結(jié)局及新生兒結(jié)局的安全性，為臨床決策和患者咨詢提供了有價值的信息。

重新冷凍多余的胚胎可以避免患者面臨卵巢過度刺激和反復(fù)失敗的風險。但是，迄今為止，胚胎二次凍融的安全性尚未完全確定。我們的結(jié)果顯示，胚胎二次玻璃化凍融在一定程度上會縮短孕周，但對著床率、臨床妊娠率、新生兒出生體重沒有明顯的不利影響，并且不增加流產(chǎn)、異位妊娠、多胎妊娠、早產(chǎn)、低出生體重兒、新生兒疾病等不良孕產(chǎn)結(jié)局的發(fā)生幾率，對于因瘢痕子宮及宮頸機能不全而進行二次凍融囊胚移植的患者來講，是一種較為安全有效的選擇。在臨床中，要充分告知夫婦二次凍融胚胎的益處及風險，包括對未出生孩子健康的影響。未來研究需要納入更多的患者并進行長期隨訪，來確認二次玻璃化冷凍保存程序的安全性。