曾丹，儲建林，陳燕茹，范代娣

（1 西北大學(xué)化工學(xué)院，陜西省可降解生物醫(yī)用材料重點實驗室，陜西省生物材料與發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，陜西 西安 710069；2 南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210000）

王義翹教授是國際生物工程和生物技術(shù)領(lǐng)域的奠基人，一生致力于生物工程技術(shù)研究和產(chǎn)業(yè)開發(fā)，研究方向包括重組蛋白生產(chǎn)和純化工藝研究，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和制劑技術(shù)研究，生物反應(yīng)器控制理論研究，酶技術(shù)和酶工程，生物高分子生產(chǎn)，食品科學(xué)和生物能源研究等，榮獲了美國化學(xué)學(xué)會M.J.Johnson Award 亞太地區(qū)杰出生物化工獎，新加坡公共服務(wù)獎?wù)潞婉R里蘭大學(xué)杰出工程技術(shù)獎等生物技術(shù)領(lǐng)域的重要獎項。

王教授一直以來心系中國生物技術(shù)的發(fā)展，是我國5所大學(xué)的名譽(yù)教授，經(jīng)常參加國內(nèi)的權(quán)威會議和學(xué)術(shù)講座，為我國的生物工程和生物技術(shù)領(lǐng)域的學(xué)者提供了很多的指導(dǎo)和幫助。2013 年，在王教授78 歲高齡的時候，仍然作為大會榮譽(yù)主席參加了第18 屆國際生物化學(xué)和分子工程大會。王教授不僅是科技創(chuàng)新者，而且是教育家，為生物工程和技術(shù)領(lǐng)域培養(yǎng)了眾多高級技術(shù)和管理人才，學(xué)生遍布世界各地，推動著整個生物化工領(lǐng)域的發(fā)展。

謹(jǐn)以此文沉痛悼念王義翹教授，我輩將銘記王教授為生物工程領(lǐng)域做出的突出貢獻(xiàn)，為生物工程和生物技術(shù)的發(fā)展繼續(xù)努力奮斗，砥礪前行。

合成生物學(xué)（synthetic biology）是在現(xiàn)代生物學(xué)和系統(tǒng)科學(xué)以及合成科學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展起來、融入工程學(xué)思想和策略的新興交叉學(xué)科，通過將自然界存在的生物元件標(biāo)準(zhǔn)化、去耦合和模塊化來設(shè)計新的生物系統(tǒng)或改造已有的生物系統(tǒng)［1］。合成生物學(xué)的研究策略涵蓋了多種學(xué)科的綜合應(yīng)用，包括基因工程、代謝工程、蛋白質(zhì)工程、化學(xué)工程、電子信息工程等，側(cè)重于“自下而上”（bottom-up）的理念，從元件、模塊到系統(tǒng)，應(yīng)用不同學(xué)科的知識實現(xiàn)新的細(xì)胞行為，合成工程學(xué)所設(shè)計的生物學(xué)目標(biāo)，具有廣泛的應(yīng)用潛力［2-3］。

蛋白質(zhì)功能材料具有良好的生物相容性和多功能性，在醫(yī)藥、軍事和紡織等領(lǐng)域應(yīng)用價值巨大［4-8］。國際上對蛛絲蛋白、蠶絲蛋白、貽貝蛋白和膠原蛋白等蛋白質(zhì)功能材料的人工合成方面開展了大量研究，構(gòu)建了包括大腸桿菌、酵母和家蠶細(xì)胞等多種人工表達(dá)體系［9-15］。然而，蛋白質(zhì)材料存在分子量大、特定氨基酸含量高、翻譯后修飾特殊、結(jié)構(gòu)性能不佳等問題，導(dǎo)致其產(chǎn)量和性能尚不能滿足應(yīng)用需求。合成生物學(xué)和化學(xué)生物學(xué)的進(jìn)展促進(jìn)了新的蛋白質(zhì)融合和新的功能基團(tuán)的整合，使蛋白質(zhì)功能材料成為具有新興特性的生物材料［16］。新的研究策略具有加工過程和性能易于控制、材料穩(wěn)定性高、降解產(chǎn)物可控、副產(chǎn)物少、可規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)勢，解決了天然蛋白提取困難的問題，成為人造蛋白合成的新趨勢。

隨著結(jié)構(gòu)解析、計算模擬和設(shè)計改造等技術(shù)的快速發(fā)展，蛋白質(zhì)功能材料的精準(zhǔn)設(shè)計成為可能［17-18］。冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展快速彌補(bǔ)了蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)上的不足；分子動力學(xué)模擬和量子化學(xué)計算等理論計算已成為蛋白質(zhì)動態(tài)模擬的重要方法。美國科學(xué)院院士Baker 等通過催化反應(yīng)路徑的量子化學(xué)計算和蛋白質(zhì)折疊預(yù)測，成功創(chuàng)造了全新的可催化雙分子Diels-Alder 反應(yīng)的人工酶［19］，UCLA 的Todd O.Yeates 等［20］設(shè)計的多面體蛋白單體可自組裝成具有特殊功能的蛋白材料。Buehler 實驗室［21］通過計算模型輔助理性設(shè)計實現(xiàn)了絲素蛋白復(fù)雜有序結(jié)構(gòu)的預(yù)測和構(gòu)建表達(dá)。清華大學(xué)劉凱課題組［22］通過計算機(jī)模擬對膠原蛋白和貽貝蛋白等力學(xué)蛋白進(jìn)行理性設(shè)計并優(yōu)化，成功構(gòu)建并表達(dá)了多物種融合力學(xué)蛋白。Scheibel 課題組［23］詳細(xì)闡述了不同蛛絲的構(gòu)成并且推測了蛛絲結(jié)構(gòu)模型。然而，研究者只解析出蛛絲蛋白的C 末端（2K3P，2KHM）和N 末端（2LPI）的三維結(jié)構(gòu)，對于中間區(qū)域的結(jié)構(gòu)尚未解析［24］。

考慮到合理設(shè)計方法受限于相對稀缺且難于得到的可分辨3D蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，哈佛大學(xué)Wyss生物啟發(fā)工程研究所和哈佛醫(yī)學(xué)院George Church 研究團(tuán)隊［25］創(chuàng)建了利用深度學(xué)習(xí)直接從蛋白質(zhì)的氨基酸序列中提取蛋白質(zhì)的基本特征的工程化蛋白質(zhì)設(shè)計方法。該方法無需其他信息，可穩(wěn)健地預(yù)測天然蛋白質(zhì)和從頭設(shè)計（de novo）蛋白質(zhì)功能，還使蛋白質(zhì)工程任務(wù)的效率提高了兩個數(shù)量級，實現(xiàn)了蛋白質(zhì)的功能定制，在治療、診斷、生物制造和生物催化等領(lǐng)域都將有很大的應(yīng)用空間。美國Arnold 研究團(tuán)隊［26］闡述了利用機(jī)器學(xué)習(xí)進(jìn)化蛋白質(zhì)的方法，其中機(jī)器學(xué)習(xí)可以指導(dǎo)進(jìn)行蛋白質(zhì)工程的定向進(jìn)化，優(yōu)化蛋白質(zhì)功能，而無需詳細(xì)的基礎(chǔ)物理或生物學(xué)途徑模型，這為按需開發(fā)優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)元件提供了全新的思路。美國David Baker 研究團(tuán)隊選擇了能夠在廣泛動態(tài)范圍內(nèi)調(diào)整“籠子-門閂”和“籠子-鑰匙”相互作用密切關(guān)系的結(jié)構(gòu)特征——螺旋結(jié)構(gòu)，從頭設(shè)計出自然界不存在的生物活性蛋白質(zhì)開關(guān)LOCKR［18］和生物反饋網(wǎng)絡(luò)degronLOCK［27］，可在體內(nèi)降解目標(biāo)蛋白，通過即插即用的特性來實現(xiàn)對內(nèi)源性信號通路和合成基因電路的反饋控制。這是蛋白質(zhì)從頭設(shè)計領(lǐng)域的又一里程碑，為合成生物學(xué)提供了全新的調(diào)控工具。這些工作為全新的功能蛋白的設(shè)計奠定了基礎(chǔ)，為蛋白質(zhì)功能材料的精準(zhǔn)設(shè)計提供了可鑒技術(shù)手段。

通過精準(zhǔn)設(shè)計策略，根據(jù)易表達(dá)和高性能的應(yīng)用要求，通過二級結(jié)構(gòu)重排、酶切位點氨基酸優(yōu)化改造、非鍵作用力平衡網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)以及整體（局部）自由能增強(qiáng)等策略，優(yōu)化或從頭設(shè)計新型蛋白分子［28-29］。從而建立起蛋白質(zhì)功能材料從“分子結(jié)構(gòu)確定、功能機(jī)制解析到全新設(shè)計”的研究理念。

本文針對蛛絲蛋白、蠶絲蛋白、類人膠原蛋白（human-like collagen，HLC）和貽貝蛋白等人造蛋白功能材料目前在生物合成以及實際應(yīng)用中遇到的瓶頸問題，同時從生物學(xué)和材料學(xué)兩個不同角度，利用合成生物學(xué)技術(shù)手段，以高效合成及功能需求為導(dǎo)向，主要從人造蛋白細(xì)胞工廠的構(gòu)建、適配調(diào)控和多種蛋白材料相關(guān)產(chǎn)品的應(yīng)用展開介紹，為人造蛋白功能材料的高效合成和應(yīng)用提供可借鑒的研究思路。

1 人造蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建

蛛絲蛋白和蠶絲蛋白材料的透水性、透氣性、生物相容性和可降解性是化學(xué)纖維不可匹敵的。蜘蛛絲有“生物鋼材”之稱，是已知生物材料中強(qiáng)度最高的天然蛋白纖維，其強(qiáng)度甚至高于制作防彈衣的凱夫拉纖維［24］。蛛絲蛋白材料可用于制備外科手術(shù)縫線、防彈衣及降落傘等材料，在生物醫(yī)學(xué)、材料、紡織、航空航天、信息存儲等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛［30-31］。雖然蛛絲蛋白材料具有質(zhì)量輕、強(qiáng)度高、彈性好、抗張力強(qiáng)等顯著特性，但大量獲取蛛絲蛋白非常困難。

科學(xué)家們一直致力于研究蛛絲的生產(chǎn)原理，并嘗試復(fù)制這一過程。已有報道植物表達(dá)系統(tǒng)［32］、哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)［33］、昆蟲表達(dá)系統(tǒng)［34］、酵母表達(dá)系統(tǒng)［35］、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)［36］等來表達(dá)蛛絲蛋白基因片段，往往獲得的重組蛛絲蛋白的分子量大小只有天然蛛絲蛋白的一半左右，表達(dá)量也較低，難以實現(xiàn)大量獲取。韓國科學(xué)院院士Lee Sang-Yup模擬自然界的蜘蛛絲蛋白表達(dá)調(diào)控過程，利用基序串聯(lián)拼接法構(gòu)建了蛛絲蛋白的多組重復(fù)序列，根據(jù)蛛絲蛋白基因的特點對大腸桿菌宿主的代謝途徑進(jìn)行改造，通過重構(gòu)代謝途徑提高相應(yīng)氨基酸在細(xì)胞內(nèi)的合成量，同時過表達(dá)相應(yīng)tRNA 并改造相應(yīng)氨酰-RNA 合成酶，提高細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)氨酰-RNA 的含量，加強(qiáng)了頻繁使用的甘氨酸和丙氨酸途徑的供給，實現(xiàn)在大腸桿菌中表達(dá)蛛絲蛋白MaSp1 的分子量達(dá)到285 kDa，然而隨著重復(fù)基序的單元數(shù)增加，蛛絲蛋白的表達(dá)量卻顯著下降［37］。

絲蛋白材料的生物合成對于其應(yīng)用將是一個巨大的飛躍，絲蛋白材料的人工設(shè)計和加工定制可以滿足不同領(lǐng)域應(yīng)用特性需求。通過復(fù)制蜘蛛絲的特性，科學(xué)家們設(shè)計開發(fā)出了一種新型人造蛛絲蛋白，在大腸桿菌中實現(xiàn)該新型人造蛛絲蛋白的可溶性表達(dá)，顯著提升新型人造蛛絲蛋白的表達(dá)水平。模擬蜘蛛天然成絲過程，設(shè)計了新型人造蛛絲蛋白組裝的紡絲裝置，成功紡織出性能優(yōu)異的新型蛛絲纖維［38］。據(jù)估算，僅利用1 L大腸桿菌培養(yǎng)液產(chǎn)生的大量新型人造蛛絲蛋白就能夠織出長度約1 km 的仿生纖維，該型人造蛛絲蛋白具有良好的生物相容性，在再生醫(yī)學(xué)研究中將發(fā)揮重要作用。

蛛絲蛋白的序列重復(fù)次數(shù)越多、蛋白質(zhì)分子量越大，所得的合成蛛絲性能也越強(qiáng)。然而，大腸桿菌難以高效表達(dá)很長片段的序列，是困擾人工合成天然蛛絲蛋白的一大難題。近期，科學(xué)家將蛛絲蛋白序列分割成小片段，利用大腸桿菌表達(dá)蛛絲蛋白片段，生物合成的蛛絲經(jīng)體外連接獲得大片段的蛛絲蛋白，獲得了556 kDa 的蛛絲蛋白，較普通天然絲蛋白的370 kDa 更長，幾乎是其他生物合成蛛絲蛋白（最大285 kDa左右）的2倍［39］。

家蠶絲蛋白質(zhì)含量高達(dá)98%，由70%～80%的絲素蛋白和20%～30%絲膠蛋白組成。家蠶絲蛋白的主要成分有絲素重鏈（FibH）、絲素輕鏈（FibL）、絲膠蛋白（Sericin）等，其中FibH 的分子量達(dá)350 kDa，約占全部絲蛋白含量的70%以上，也是決定蠶絲纖維機(jī)械性能的主要因素。線狀的絲素蛋白具有抗蛋白水解酶、抗紫外線，尤其是顯著的柔韌性、抗疲勞和與鋼材相似的張力強(qiáng)度，透氣吸濕性、彈性良好，無毒、無刺激，與人體相容性強(qiáng)等優(yōu)勢，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、化工、食品等領(lǐng)域［40］。新型功能化的絲素蛋白可在藥物載體、人造組織材料、骨骼與軟骨組織修復(fù)材料、神經(jīng)與血管移植、生物傳感器等生物醫(yī)學(xué)材料和環(huán)保新材料等領(lǐng)域得到更深、更廣的開發(fā)和應(yīng)用［41-43］。

由于蠶絲蛋白和蛛絲蛋白在結(jié)構(gòu)上有一定的相似性，利用家蠶遺傳改造大量獲取類蛛絲纖維是一個可行性高的策略［44］。近年來，已有利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)實現(xiàn)了蛛絲蛋白在家蠶細(xì)胞中表達(dá)的報道，但由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)本身的限制以及內(nèi)源性蠶絲蛋白的表達(dá)干擾，蛛絲蛋白的產(chǎn)量一直難以得到提高。利用基因組編輯工具TALEN 完全敲除家蠶絲蛋白FibH編碼區(qū)，同時保留編碼區(qū)上下游完整的調(diào)控序列。在此基礎(chǔ)上定點整合含有部分蜘蛛絲基因和熒光標(biāo)記的DNA 片段，實現(xiàn)了完全去除內(nèi)源性絲蛋白FibH的表達(dá)和利用FibH的內(nèi)源性調(diào)控序列調(diào)控外源性蛛絲基因的表達(dá)。在轉(zhuǎn)化個體的絲腺和蠶繭中均可檢測到蛛絲蛋白的表達(dá)，其含量在個體繭層中可達(dá)35.2%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于已報道的轉(zhuǎn)基因方法（0.3%～3%）。由于轉(zhuǎn)入的蛛絲蛋白片段分子量較?。s70 kDa），獲得的嵌合型蜘蛛絲與對照品種蠶絲相比，在強(qiáng)度上有所下降，但在延展性上有了顯著提高，如圖1所示。該研究拓展了家蠶絲腺生物反應(yīng)器的應(yīng)用，為利用家蠶大量生產(chǎn)新型纖維材料及表達(dá)其他高附加值蛋白提供了新策略［45］。

圖1 利用基因組編輯家蠶大量表達(dá)蜘蛛絲基因［45］Fig.1 Massive expression of spider silk through the genome editing of silkworm

在家蠶“吐”蜘蛛絲方面，有研究報道基于CRISPR/Cas9 的轉(zhuǎn)座子等基因編輯技術(shù)改造家蠶腺細(xì)胞，將蜘蛛絲基因?qū)胱匀煌陆z的家蠶中，轉(zhuǎn)基因家蠶可產(chǎn)生機(jī)械強(qiáng)度接近天然蜘蛛絲的人造絲蛋白［46］，如圖2 所示。CRISPR/Cas9 技 術(shù)介導(dǎo)天然大小的蜘蛛絲基因插入絲素重鏈或輕鏈的內(nèi)含子（FibH或FibL）可精確控制序列突變，對絲蛋白產(chǎn)量沒有影響。但家蠶本身合成大量絲蛋白，占用了過多的氨基酸資源，使得外來基因所用氨基酸資源有限，產(chǎn)量嚴(yán)重受到影響，有待設(shè)計構(gòu)建新型的家蠶細(xì)胞工廠表達(dá)制備新型絲蛋白材料。

圖2 轉(zhuǎn)基因家蠶制成的蜘蛛絲狀纖維［46］（a）替換天然大小蜘蛛絲蛋白（MaSp1/MiSp1）對絲素重鏈的替換及其吐絲結(jié)繭；（b）蜘蛛絲蛋白MaSp1/MiSp1摻入絲素重鏈融合表達(dá)絲蛋白及其吐絲結(jié)繭Fig.2 Spider silk fiber made from transgenic silkworm[46](a)Replacement of the natural spider silk protein(MaSp1/MiSp1)through engineering silk fibroin heavy chain and cocooning;(b)Incorporation of the spider silk protein MaSp1/MiSp1 fibroin heavy chain for the fusion expression of silk protein and its cocooning

2 人造蛋白的適配調(diào)控和高效表達(dá)

利用原核微生物表達(dá)蛋白材料具有細(xì)胞生長快速、分子操作簡單和適合高密度發(fā)酵培養(yǎng)、成本低廉及易于自動控制等優(yōu)勢，然而在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌系統(tǒng)中表達(dá)的可溶性及分泌性能較低。外源絲蛋白在大腸桿菌等微生物系統(tǒng)中的表達(dá)調(diào)節(jié)因素多、系統(tǒng)復(fù)雜，表達(dá)元件設(shè)計與目的基因之間適配性、蛋白合成途徑調(diào)控有待研究。利用人工細(xì)胞高效表達(dá)是實現(xiàn)其人工生產(chǎn)和改性的重要途徑，已成為世界各國重點投入的競爭領(lǐng)域。

基因表達(dá)調(diào)控一直是生物學(xué)的主要研究領(lǐng)域，人工合成基因線路（synthetic gene circuit）則在其中發(fā)揮著重要的作用［47］。調(diào)節(jié)基因表達(dá)的萬能工具對于擴(kuò)大工程基因網(wǎng)絡(luò)的規(guī)模和增加定制反饋的復(fù)雜性是至關(guān)重要的。近年來，隨著合成生物學(xué)的高速發(fā)展，研究者們不斷追求設(shè)計大規(guī)模、復(fù)雜功能的人工合成基因線路，而其中實現(xiàn)基因表達(dá)的精確控制至關(guān)重要。近期，愛丁堡大學(xué)王寶軍［48］研究報道了一套針對合成基因線路設(shè)計的多功能基因調(diào)控工具建立了一種普遍存在的、來自自然界的間接基因調(diào)控機(jī)制，即利用誘餌蛋白結(jié)合DNA 位點（DNA 海綿）調(diào)控大腸桿菌靶點基因的表達(dá)。人工合成核酸海綿可系統(tǒng)地調(diào)節(jié)基因線路中的基因表達(dá)，從而精確改變該線路中的基因表達(dá)泄漏、輸出幅度和誘導(dǎo)倍數(shù)、對小分子的響應(yīng)靈敏度，并改善宿主細(xì)胞的生長速度。該基因調(diào)節(jié)方法簡單、有效，可廣泛用于多種應(yīng)用領(lǐng)域相關(guān)的人工合成基因線路設(shè)計，不僅可以簡單、有效地調(diào)節(jié)基因表達(dá)，還能降低因異質(zhì)蛋白過量表達(dá)而造成的細(xì)胞負(fù)荷。

隨著基因工程技術(shù)的大規(guī)模應(yīng)用，基因工程重組膠原利用模式化表達(dá)宿主，以外源蛋白表達(dá)的形式成功克服了膠原蛋白大規(guī)模制備的瓶頸。羥脯氨酸是膠原蛋白所獨有的非天然氨基酸，其表達(dá)對膠原蛋白的螺旋域形成及結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定具有重要作用，是重組膠原與天然膠原結(jié)構(gòu)的主要區(qū)別之一。本課題組通過將來源于孢囊菌RH1的脯氨酸羥化酶基因（TPH）與人源Ⅲ型膠原蛋白α1 鏈基因（COL3A1）共表達(dá)，成功地實現(xiàn)了重組膠原的羥化［49］。經(jīng)該方法制備的重組膠原與天然膠原在氨基酸組成及空間結(jié)構(gòu)上更相近，活性更相似；并且該方法所提供的細(xì)菌來源脯氨酸羥化酶與現(xiàn)有的人源脯氨酸羥化酶相比結(jié)構(gòu)更簡單，更易于高通量表達(dá)，且制備容易，適宜進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。同時，利用代謝工程等技術(shù)解析了HLC異源表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點；通過對生物反應(yīng)過程中細(xì)胞代謝特性參數(shù)分析，結(jié)合計算機(jī)輔助建立相關(guān)分析模型，闡明了發(fā)酵過程各參數(shù)對人工細(xì)胞比生長速率、物質(zhì)代謝、能量和還原力的影響；結(jié)合過程工程技術(shù)，如乙酸調(diào)控等，實現(xiàn)了HLC 在大腸桿菌、酵母菌等中的高效合成［50-51］，合成過程如圖3所示［52］。

圖3 類人膠原蛋白的生產(chǎn)過程示意圖［52］Fig.3 Schematic diagram of the production process of HLC［52］

貽貝黏附蛋白由于具有超強(qiáng)吸附能力而備受關(guān)注，其蛋白結(jié)構(gòu)中的非天然氨基酸多巴含量是影響其功能的重要因素，因此，非天然氨基酸的摻入是貽貝黏附蛋白生物合成的主要挑戰(zhàn)之一。非天然氨基酸的摻入具體是指通過基因編碼插入非天然氨基酸（ncAAs）的方法與技術(shù)。新的正交氨酰-tRNA 合成酶/tRNA 對的發(fā)展可向遺傳密碼中添加多種非天然氨基酸，非天然氨基酸可展現(xiàn)出20 種天然氨基酸中不存在的結(jié)構(gòu)和功能，為蛋白質(zhì)功能的增強(qiáng)或產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)特性提供了可能。研究發(fā)現(xiàn)，多巴的氨基?；磻?yīng)，通過內(nèi)源性酪氨酰-tRNA 合成酶（TyrRS）可以定量取代殘留的酪氨酸，實現(xiàn)體內(nèi)特異性摻入非天然氨基酸多巴。為此，Yang 等［53］創(chuàng)建了Tyr 營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌宿主，實現(xiàn)了貽貝黏附蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)。該方法摻入的多巴含量非常高，摻入效率達(dá)90%，可使表達(dá)獲得的Mfp-3 和Mfp-5 非常接近天然貽貝黏附蛋白，重組多巴結(jié)合的貽貝黏附蛋白表現(xiàn)出優(yōu)異的表面附著力和在雙光子輔助下的耐水性；特別是重組Mfp3和Mfp5的水下粘接性能可與自然貽貝黏附蛋白相媲美，可作為生物膠或黏著水凝膠展現(xiàn)新的應(yīng)用前景，如圖4所示。

圖4 Tyr營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌宿主構(gòu)建及其表達(dá)貽貝黏附蛋白Mfp-3和Mfp-5［53］Fig.4 Construction of Tyr auxotrophic E.coli host for the expression of mussel adhesion proteins Mfp-3 and Mfp-5[53]

畢赤酵母是甲醇營養(yǎng)型酵母中一類能夠利用甲醇作為唯一碳源和能源的酵母菌，被人們認(rèn)為是最適用的重組蛋白異源表達(dá)系統(tǒng)之一［54］。許多蛋白藥物及工業(yè)酶都在畢赤酵母中實現(xiàn)了高效的重組表達(dá)。目前，人們研究的熱點集中在提高外源基因拷貝數(shù)以及共表達(dá)分子伴侶［55-56］。這兩種方案都需要向酵母基因組中整合新的質(zhì)粒片段，而這樣的基因操作是有次數(shù)限制的：宿主能接受多少種篩選壓力，類似的片段整合就能進(jìn)行多少次。雖然有人嘗試針對一種抗生素通過不斷提高其濃度反復(fù)進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，進(jìn)而篩選多拷貝宿主，但這種方法極易產(chǎn)生假陽性，篩選轉(zhuǎn)化子的工作量非常大。已開發(fā)的“Marker 回收系統(tǒng)”能夠?qū)崿F(xiàn)對畢赤酵母的基因敲除，將抗性基因整合到基因組又從基因組上消除［57］?？苫凇癕arker 回收系統(tǒng)”，通過添加lacO操縱基因，關(guān)閉AOX1 在大腸桿菌中的“泄漏表達(dá)”，進(jìn)而構(gòu)建可以進(jìn)行抗性自消除的畢赤酵母表達(dá)載體，以實現(xiàn)外源基因在畢赤酵母中的高效合成。

翻譯起始是蛋白質(zhì)合成的主要限速步驟，有研究表明，蛋白質(zhì)合成可能還受到與延伸階段有關(guān)的多重因素調(diào)控［58-59］。利用其構(gòu)建的蛋白庫，結(jié)合體內(nèi)與體外實驗，系統(tǒng)評估了早期延伸階段對大腸桿菌表達(dá)合成蛋白質(zhì)的影響，研究了編碼蛋白質(zhì)的基因的前10 個核苷酸堿基序列，該序列區(qū)域可能與通過翻譯起始或延伸來調(diào)控蛋白質(zhì)合成有關(guān)。位于N 端的氨基酸和核苷酸分別都會對蛋白質(zhì)合成效率造成影響，可能是由tRNA、mRNA、核糖體和新生多肽鏈一起參與的相互作用決定了蛋白質(zhì)合成的效率，并根據(jù)單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移實驗結(jié)果推測，該位置特定的核苷酸和氨基酸組成造成了核糖體停頓并導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的提前終止。此外，關(guān)于蛋白質(zhì)在翻譯和發(fā)酵過程中的表達(dá)優(yōu)化，本課題組利用伴侶蛋白GroEL 體系與GroES 協(xié)同使用，通過協(xié)助折疊HLC 和增加HLC 編碼基因的mRNA 水平來增加其產(chǎn)量［60］；同時，觸發(fā)因子也可以積極促進(jìn)HLC的表達(dá)［61］。

蛋白糖基化是最普遍的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一，它與所修飾蛋白的折疊、結(jié)構(gòu)、運輸、定位和生物活性的保持等關(guān)系密切。因此，在人造蛋白重組表達(dá)時，糖基化是重要的考慮因素之一［62］。由于不同表達(dá)系統(tǒng)的蛋白糖基化受到糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)水平、底物特異性等因素的影響，蛋白糖基化的準(zhǔn)確分析十分必要［63］。目前，多種不同的完整糖肽質(zhì)譜分析策略和相應(yīng)分析軟件不斷被開發(fā)出來，包括Byonic［64］、GPQuest［65］、pGlyco 2.0［66］、GPSeeker［67］和MSragger-Glyco［68］等。這些軟件可實現(xiàn)快速、高通量的完整糖肽分析，且在單次分析中可同時獲得糖基化的多肽序列和糖鏈信息，使得分析結(jié)果更為精細(xì)。

目前蛋白糖基化分析方法仍存在局限性，比如當(dāng)解析完整糖肽上的糖鏈信息時，上述軟件多數(shù)僅能獲得糖鏈的單糖組成信息，依然無法獲知糖鏈精細(xì)結(jié)構(gòu)信息。另外，上述軟件均采用了數(shù)據(jù)庫匹配打分的方式進(jìn)行糖鏈組成分析，僅能鑒定已知的糖鏈結(jié)構(gòu)，因此現(xiàn)有完整糖肽分析方法和軟件均難以直接應(yīng)用到含有大量特殊糖鏈結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的完整糖肽分析中。綜合以上分析，常用的糖組學(xué)和完整糖肽分析方法均無法完全滿足當(dāng)前的研究需要，亟待開發(fā)不依賴已知數(shù)據(jù)庫的糖鏈結(jié)構(gòu)從頭測序新軟件。新的糖肽軟件的開發(fā)可以為后期人造蛋白的糖基化分析提供堅實的技術(shù)基礎(chǔ)。

3 人造蛋白功能材料的應(yīng)用

針對當(dāng)前臨床產(chǎn)品存在的生物相容性差、功效不足等問題，人造蛋白功能材料可根據(jù)功能需求，進(jìn)行定向裝配加工，應(yīng)用于制備人工肌腱、人工皮膚、可降解止血材料、人工骨和高黏抗污涂層產(chǎn)品等新型蛋白材料醫(yī)學(xué)產(chǎn)品。

3.1 人工肌腱

生物材料構(gòu)建的人工肌腱具有機(jī)械強(qiáng)度高、組織相容性好、無明顯排斥反應(yīng)、銜接部牢固等優(yōu)點，但同時存在易于感染粘連、誘導(dǎo)腱化過程緩慢、生長的肌腱滑動性差等問題［69］?？梢越柚鞍追e木技術(shù)［70］，采用生物相容性優(yōu)異的蠶絲蛋白、蛛絲蛋白復(fù)合糖類等制備人工肌腱。研究發(fā)現(xiàn)，通過靜電紡絲蠶絲蛋白纖維板包裹能促進(jìn)移植軟組織的肌腱-骨愈合［71-72］。肌腱/韌帶-骨界面的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞外基質(zhì)組成是復(fù)雜的，且允許肌腱/韌帶和骨之間的漸進(jìn)機(jī)械應(yīng)力轉(zhuǎn)移。因此，模仿原生界面結(jié)構(gòu)特征的支架可以更好地支持功能性組織再生。慕尼黑工業(yè)大學(xué)Sònia Font Tellado 等人［73］制備了肌腱/韌帶側(cè)各向異性和骨側(cè)各向同性的雙相絲素蛋白支架，用以模擬膠原分子排列在界面上的梯度。此支架支持細(xì)胞附著，并根據(jù)孔隙排列影響細(xì)胞骨架組織。同時，肌腱/韌帶、植入物和軟骨標(biāo)記物的基因表達(dá)可隨支架各區(qū)域的孔隙排列而發(fā)生顯著變化。雙相支架在肌腱/韌帶-骨組織工程中具有良好的應(yīng)用前景。

3.2 人工皮膚

人工皮膚可穿戴貼片一般具備柔性、實時監(jiān)測、非侵入性、用后可丟棄、高集成度、高靈敏度、高穩(wěn)定性等獨特優(yōu)勢，選擇性能優(yōu)異的材料是人工皮膚可穿戴貼片制作的關(guān)鍵。蠶絲因其優(yōu)異的生物相容性、可降解性質(zhì)、易加工、優(yōu)良的力學(xué)機(jī)械性能，是可穿戴貼片最理想的選擇之一［74］。南京工業(yè)大學(xué)何冰芳團(tuán)隊［75］利用絲素蛋白設(shè)計了一種多功能高度集成化的人工皮膚貼片，在貼片上面集成光子晶體反蛋白石結(jié)構(gòu)、微流控通道以及柔性電路，使用Origami（折紙技術(shù)）實現(xiàn)三維復(fù)合貼片的制作，貼片具備藥物釋放、光學(xué)傳感和運動傳感的功能，有望在慢性傷口管理、個性化醫(yī)療、器官芯片等領(lǐng)域得到應(yīng)用。Kundu等［76］制備了絲素/羊膜三維雙層人造皮膚支架，由于絲素蛋白的加入，此支架具有良好的力學(xué)性能、細(xì)胞黏附和增殖性能，并能促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子的產(chǎn)生，可用于臨床皮膚再生。近期，Radacsi等［77］報道了一種高通量生產(chǎn)絲素蛋白基生物相容性復(fù)合纖維的方法，并以聚己內(nèi)酯、聚癸二酸甘油和再生絲素為原料，制備了可調(diào)節(jié)疏水性/親水性的纖維氈。此方法顯著提高了蛋白質(zhì)的產(chǎn)量；同時，該三元復(fù)合生物材料在體外具有良好的成纖維細(xì)胞附著和最佳生長，表明這種結(jié)構(gòu)有潛力發(fā)展成有助于傷口愈合和皮膚再生的人造皮膚平臺。

3.3 可降解止血材料及人工骨

人造蛋白功能材料中的HLC 以其良好的凝膠性、吸水性、生物相容性、可降解、無毒等諸多優(yōu)良特性，在傷口縫線、軟骨缺損填充、骨骼金屬植入物鍍膜等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，是一種非常重要的生物醫(yī)用材料［78-79］。本課題組基于HLC 材料，結(jié)合小分子殼聚糖制備了系列植入型止血材料［80-82］。與同類臨床產(chǎn)品相比，該材料止血迅速，并可以通過調(diào)節(jié)殼聚糖的比例獲得不同的降解速度，適用范圍更廣。另外，以HLC、羥基磷灰石和透明質(zhì)酸等為原料，制備了多種復(fù)合人工骨支架材料［83-88］。研究表明，添加HLC 的支架材料不僅能促進(jìn)細(xì)胞很好地黏附、生長和增殖，引導(dǎo)細(xì)胞向孔隙內(nèi)生長，并能維持細(xì)胞天然的圓形或多角形軟骨形態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)分泌，形成致密的細(xì)胞層，對骨軟骨缺損的修復(fù)重建在臨床應(yīng)用方面具有重要意義。吳斌團(tuán)隊開發(fā)了一種聚多巴胺（pDA）輔助的bmp-2 衍生肽（指定為P24）表面修飾策略，用以改善以納米羥基磷灰石/重組類人膠原/聚乳酸（nHA/RHLC/PLA）為材料制備的三維多孔支架的成骨［89］。結(jié)果表明，pDA 輔助表面修飾可以顯著提高nHA/RHLC/PLA 支架的成骨活性，新型nHA/RHLC/PLA-pDA-p24 支架是一種很有前途的骨組織再生支架生物材料。

3.4 黏附抗污涂層

醫(yī)療器械的涂層材料存在濕性黏附力弱、生物污損和難以自修復(fù)三大難題［90］，開發(fā)一種能夠簡便快速黏附在醫(yī)療設(shè)備表面，且兼具抗污和良好生物相容性等多功能的涂層材料，是當(dāng)前醫(yī)學(xué)界急需解決的問題。貽貝黏附蛋白具有高強(qiáng)度、高韌性和防水性，以及極強(qiáng)的黏附基體的功能。貽貝黏附蛋白中特殊的分子結(jié)構(gòu)、多巴介導(dǎo)的鏈間交聯(lián)和與底材之間的相互作用方式形成了其獨特的生物學(xué)功能，還具有很好的生物相容性和可降解性。貽貝黏附蛋白Mfp-3、Mfp-5 主要分布在附著基與基底表面相互接觸的界面處，被認(rèn)為是貽貝附著基與外界固體表面形成黏合的主要黏附蛋白，是一類極具優(yōu)勢和潛力的生物膠黏劑，非常適用于醫(yī)用涂層的制備［91-92］。天津大學(xué)張雷和齊海山團(tuán)隊受貽貝黏附特性的啟發(fā)，通過生物合成法設(shè)計制備了貽貝融合蛋白MP-KE。MP-KE 涂層能抵抗95%以上細(xì)菌和細(xì)胞黏附，且抗菌性突出；在熱蒸汽環(huán)境下，將其涂覆于玻璃基板仍表現(xiàn)出高透光率，說明此涂層兼具優(yōu)異的防霧性能；同時該蛋白涂層生物相容性良好，體內(nèi)植入器件或傳感器等使用此涂層有望克服機(jī)體免疫排異反應(yīng)，在生物醫(yī)學(xué)和制藥領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景［93-95］。人造蛋白功能材料的主要應(yīng)用總結(jié)于表1。

表1 人造蛋白功能材料的應(yīng)用Tab.1 Applications of artificial protein functional materials

4 結(jié)論與展望

人造蛋白功能材料在醫(yī)藥、軍事和紡織等領(lǐng)域都顯示出越來越重要的應(yīng)用價值。然而，天然生物元件來源于自然進(jìn)化，在模塊化、組裝、集成等方面，難以符合特定工程需求。隨著人口老齡化時代的到來，對生物材料的要求將從簡單的多功能和高效，逐步發(fā)展為動態(tài)可調(diào)控以及仿生交互等方向。合成生物學(xué)通過合成生物功能元件、裝置和系統(tǒng)，對細(xì)胞或生命體進(jìn)行遺傳學(xué)設(shè)計、改造，利用合成基因線路研究轉(zhuǎn)錄、后轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)設(shè)計；具有良好協(xié)調(diào)行為、協(xié)同執(zhí)行功能的生物系統(tǒng)可為新型功能蛋白材料研究提供全新的解決方案。根據(jù)蛋白材料的不同特性，蛋白材料特性的結(jié)構(gòu)機(jī)制解析、基因工程原理設(shè)計并制備出滿足醫(yī)用材料、組織工程和藥物載體等特定需求的蛋白功能材料，極具開發(fā)價值和應(yīng)用前景。

近年來，人造蛋白功能材料的合成及應(yīng)用研究范圍得到了極大拓展，在合成生物學(xué)理念的指導(dǎo)下，建立了“精準(zhǔn)設(shè)計—系統(tǒng)構(gòu)建—調(diào)控表達(dá)—工程應(yīng)用”的研究策略。利用合成生物學(xué)的技術(shù)和原理，可以優(yōu)化人造蛋白功能材料的合成流程，提供新的合成路徑，提高制造效率；但合成生物學(xué)興起的時間不長，在發(fā)展過程中會遇到各種挑戰(zhàn)，目前還存在以下幾個方面的問題亟待解決：①現(xiàn)階段理論分析工具及模型較少，對功能蛋白的設(shè)計、預(yù)測和分析比較局限，需要建立更全面的蛋白數(shù)據(jù)庫；②在蛋白表達(dá)階段，不同細(xì)胞的系統(tǒng)構(gòu)建還需突破，蛋白的表達(dá)效率還需要進(jìn)一步提高；③在工程應(yīng)用方面，在不斷提升蛋白材料功能的同時，還需要綜合考慮材料的穩(wěn)定性以及生物安全性等方面。

從實際應(yīng)用需求來看，設(shè)計具有動態(tài)響應(yīng)特性的人造蛋白功能材料是未來發(fā)展的必然趨勢，這對人造蛋白功能材料系統(tǒng)的設(shè)計和工程控制提出了新的要求。自下而上的材料設(shè)計方法面臨的核心問題是如何忠實地將分子級的功能轉(zhuǎn)移到宏觀級的材料特性。因此，需要著重開發(fā)使工程蛋白質(zhì)分子組裝成功能性宏觀材料的研究方法?；诂F(xiàn)階段存在的問題，一些新技術(shù)的發(fā)展為得到具有全新結(jié)構(gòu)、功能的蛋白提供了可行的途徑，如借助定向進(jìn)化技術(shù)、人工智能和深度學(xué)習(xí)技術(shù)［96-98］、遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)［99］等，相信人造蛋白功能材料必將依賴于蛋白質(zhì)合成生物技術(shù)的突破而快速發(fā)展。