謝良志

（1 北京市蛋白和抗體研發(fā)及制備工程技術(shù)研究中心，北京神州細(xì)胞生物技術(shù)集團(tuán)股份公司，北京 100176；2 單克隆抗體上游研發(fā)技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京義翹神州科技股份有限公司，北京 100176）

引言：生物藥產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展的50年

生物技術(shù)自20 世紀(jì)70 年代開(kāi)始萌芽，經(jīng)歷了從采用微生物（如大腸桿菌）表達(dá)生產(chǎn)分子量較小、且無(wú)需翻譯后修飾的蛋白質(zhì)藥物（如生長(zhǎng)因子、白介素2 等），到采用真核細(xì)胞表達(dá)生產(chǎn)分子量大、具有糖基化等翻譯后修飾、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)藥物（如重組八因子蛋白、單克隆抗體藥物等）的發(fā)展和進(jìn)步歷程。工程技術(shù)化一直是推動(dòng)和制約生物藥產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的關(guān)鍵。大規(guī)模中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO 細(xì)胞）培養(yǎng)已經(jīng)成為生物制藥行業(yè)最廣泛使用的生產(chǎn)工藝技術(shù)。然而，在生物藥發(fā)展的早期階段，采用對(duì)剪切力敏感、需要添加動(dòng)物血清而且需要貼壁才能生長(zhǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)年產(chǎn)量成噸級(jí)抗體藥物規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)是不敢想象的。

王義翹教授以其敏銳的前瞻性和戰(zhàn)略性眼光，敢于挑戰(zhàn)科學(xué)和工程領(lǐng)域最尖端的技術(shù)，自20 世紀(jì)60 年代率先進(jìn)入微生物發(fā)酵和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)等工程技術(shù)領(lǐng)域，他的研究除本文重點(diǎn)介紹的研究方向外，還涉及生物反應(yīng)器的自動(dòng)化在線監(jiān)測(cè)和控制、蛋白質(zhì)復(fù)性技術(shù)、分離純化技術(shù)等，系統(tǒng)全面地涵蓋了生物藥產(chǎn)業(yè)化各個(gè)方面的關(guān)鍵技術(shù)，為當(dāng)代生物藥大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，做出了開(kāi)創(chuàng)性的杰出貢獻(xiàn)，被譽(yù)為“生物化工領(lǐng)域奠基人”（the founding fathers of the field of biochemical engineering）［1］，“生物化工的驅(qū)動(dòng)力”（the driving force in biochemical engineering）［2］；“過(guò)去40 年生物技術(shù)工業(yè)有影響力的領(lǐng)導(dǎo)者”（influential leader of the biotechnology industry over the past four decades）［3］，“生物化工領(lǐng)域的締造者和權(quán)威”（an architect of the field of biochemical engineering，a luminary in the field of biochemical engineering）［4］，“生物化工之父”（father of biochemical engineer）［5］，“生物技術(shù)之父”（father of biotechnology）［6］和“現(xiàn)代生物技術(shù)之父”（the father of modern biotechnology）［7］。

20 世紀(jì)80 年代，哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)開(kāi)始用于需要糖基化等翻譯后修飾的蛋白質(zhì)藥物的生產(chǎn)。早期的生物藥品種主要為臨床劑量較低的因子類蛋白藥物，如重組八因子（factor Ⅷ），紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO），組織型纖溶酶原激活劑（tissue plasminogen activator，tPA）等。受限于當(dāng)時(shí)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞代謝和培養(yǎng)的了解以及極為有限的工藝開(kāi)發(fā)能力和工藝放大經(jīng)驗(yàn)，EPO的生產(chǎn)工藝為添加牛血清的轉(zhuǎn)瓶（roller bottle）貼壁培養(yǎng)［8］，GMP 無(wú)菌操作是在一個(gè)封閉的、由自動(dòng)化機(jī)器手操作的無(wú)人車間完成的，無(wú)菌保障和規(guī)模放大都極具挑戰(zhàn)性。由于表達(dá)量低，產(chǎn)品穩(wěn)定性差等因素，八因子蛋白則是采用連續(xù)灌注（perfusion）或重復(fù)批次培養(yǎng)（repeated-batch）實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)［9］。

20 世紀(jì)80 年代末，單克隆抗體藥物研發(fā)開(kāi)始起步。由于抗體的臨床劑量通常達(dá)到幾百毫克，比因子類產(chǎn)品微克級(jí)的劑量高幾個(gè)數(shù)量級(jí)，因此，需要開(kāi)發(fā)操作簡(jiǎn)單、容易放大、產(chǎn)量高的細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)工藝技術(shù)。優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)工藝需要突破一系列的認(rèn)知和技術(shù)瓶頸，如將CHO 細(xì)胞從貼壁生長(zhǎng)馴化成懸浮生長(zhǎng)，從含血清培養(yǎng)馴化成無(wú)血清培養(yǎng)，控制葡萄糖和氨基酸代謝的抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的副產(chǎn)物（如乳酸和氨），控制細(xì)胞生長(zhǎng)所需數(shù)十種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在反應(yīng)器中的濃度等。

此后30 年，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的生物技術(shù)產(chǎn)品商業(yè)化進(jìn)入快速增長(zhǎng)階段，截至2020 年底，美國(guó)FDA 已批準(zhǔn)101 個(gè)單克隆抗體藥物上市，其中2010 年后批準(zhǔn)上市的品種占72 個(gè)，抗體藥物研發(fā)和商業(yè)化呈快速增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)。2015～2020 年，全球銷售排名前十的藥品中生物藥品種穩(wěn)住6～8 席。排名第一的阿達(dá)木單抗（TNF-α抗體，治療自身免疫性疾病）自2002 年底獲批上市以來(lái)，年銷售額快速增長(zhǎng)，2018 年達(dá)到200 億美元（圖1）。截至2020 年，阿達(dá)木單抗累計(jì)銷售額已達(dá)到1720 億美元，成為歷史上最成功的藥品。阿達(dá)木單抗的快速增長(zhǎng)是生物藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個(gè)縮影，從一個(gè)側(cè)面體現(xiàn)了生物藥過(guò)去三十年的蓬勃發(fā)展歷程。單克隆抗體等生物藥商業(yè)化取得的巨大成功，催生的大規(guī)模GMP 生產(chǎn)需求的實(shí)現(xiàn)，得益于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝技術(shù)的不斷優(yōu)化以及生產(chǎn)規(guī)模的不斷擴(kuò)大。王義翹教授領(lǐng)導(dǎo)建立的MIT 生物技術(shù)和工程中心（MIT-BPEC）在90年代開(kāi)展的針對(duì)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、代謝、控制、工藝放大以及蛋白質(zhì)質(zhì)量控制等開(kāi)拓性研究奠定了國(guó)際生物藥工業(yè)化生產(chǎn)的基礎(chǔ)。王義翹教授帶領(lǐng)學(xué)生從動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、生產(chǎn)工藝的各個(gè)方面進(jìn)行了系統(tǒng)性的研究，本文僅對(duì)其部分研究工作和成就進(jìn)行簡(jiǎn)單概述和總結(jié)。王義翹教授在其他生物工程領(lǐng)域的貢獻(xiàn)和成績(jī)已在其他文章中進(jìn)行了總結(jié)［10］。

圖1 阿達(dá)木單抗年銷售額Fig.1 Annual sales of Adamuzumab

1 王義翹教授團(tuán)隊(duì)早期開(kāi)展的基礎(chǔ)性研究和開(kāi)發(fā)工作

早期的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)研究大多以通過(guò)培養(yǎng)皿（culture dish）和轉(zhuǎn)瓶（roller bottle）貼壁培養(yǎng)的原代細(xì)胞為主，很難實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。1967 年，van Wezel A L［11］首次提出采用陰離子微載體培養(yǎng)原代細(xì)胞的概念并成功實(shí)現(xiàn)多種原代細(xì)胞的貼壁懸浮培養(yǎng)，但由于細(xì)胞接種貼壁效率低，微載體對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)存在抑制性“毒性”等一系列問(wèn)題，此后10 年的反復(fù)研究并沒(méi)有取得實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展［12-15］。1977—1979 年，Levine D.W.和Giard D.J.在王義翹教授和Thilly W.G.的指導(dǎo)下，采用帶正電荷的葡聚糖微球（dextran microsphere）作為微載體進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，解決了細(xì)胞貼壁效率低、微載體對(duì)培養(yǎng)基中活性成分吸附造成的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制等關(guān)鍵問(wèn)題，才真正推動(dòng)微載體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)入工業(yè)化應(yīng)用階段［16-21］。此后，王義翹教授和他的學(xué)生Hu W.S.、Croughan M.、Hamel J-F［22-31］又對(duì)微載體培養(yǎng)的細(xì)胞接種密度、微球粒徑、細(xì)胞傳代、微載體密度、剪切力等關(guān)鍵工藝參數(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)研究和優(yōu)化。王義翹教授團(tuán)隊(duì)的早期研究奠定了此后數(shù)十年微載體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和工業(yè)化應(yīng)用不斷發(fā)展進(jìn)步的重要基礎(chǔ)，也為90 年代經(jīng)馴化后CHO 細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)工藝開(kāi)發(fā)和優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。

20世紀(jì)80年代末，王義翹教授團(tuán)隊(duì)還設(shè)計(jì)了一種開(kāi)創(chuàng)性的氣升式纖維固定床生物反應(yīng)器（air-lift fiber bed bioreactor）進(jìn)行貼壁細(xì)胞培養(yǎng)。Perry S.D.［32］在王教授指導(dǎo)下首先對(duì)氣升式玻璃纖維固定床生物反應(yīng)器進(jìn)行了概念設(shè)計(jì)和初步可行性驗(yàn)證。此后，王教授團(tuán)隊(duì)的Chiou T.W.（邱紫文）和Murakami S.［33-34］又連續(xù)發(fā)表了兩篇論文分析了規(guī)?；糯蟮目尚行裕翰捎蒙鲜龈拍顚?shí)現(xiàn)了氣升式玻璃纖維固定床生物反應(yīng)器66天的CHO細(xì)胞貼壁培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)到了6.8×107細(xì)胞/mL，實(shí)現(xiàn)了230倍的細(xì)胞擴(kuò)增；Murakami S.和Chiou T.W.［35］還對(duì)剪切力、營(yíng)養(yǎng)成分和氧氣傳輸和消耗進(jìn)行了模擬計(jì)算和理論放大研究，初步驗(yàn)證此類生物反應(yīng)器具備從10L放大到67 000L的潛力。

王義翹教授團(tuán)隊(duì)在微生物和酵母發(fā)酵生產(chǎn)工藝研究［36-42］、在線自動(dòng)檢測(cè)和控制［43-46］等方面的早期研發(fā)也為動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)工藝開(kāi)發(fā)、生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)和工藝放大起到了重要的借鑒作用［47］。

2 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中有毒副產(chǎn)物的代謝調(diào)控研究

氨和乳酸是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的兩個(gè)主要代謝副產(chǎn)物。20 世紀(jì)80 年代末至90 年代初，氨和乳酸對(duì)動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝和蛋白質(zhì)糖基化修飾的影響已進(jìn)行了全面、系統(tǒng)的研究［48-54］。在2～4 mmol/L 的氨濃度下，大多數(shù)細(xì)胞系的生長(zhǎng)速度和產(chǎn)品表達(dá)水平?jīng)]有顯著影響，但是更高濃度的氨可導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和細(xì)胞死亡。乳酸在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的積累同樣對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝不利，一方面會(huì)導(dǎo)致pH 的下降和滲透壓的升高，同時(shí)還可能抑制葡萄糖的能量代謝。因此，控制氨和乳酸的產(chǎn)生和積累是實(shí)現(xiàn)高密度細(xì)胞培養(yǎng)、提高蛋白質(zhì)生產(chǎn)的關(guān)鍵手段［55-56］。

王義翹教授實(shí)驗(yàn)室研究了多重創(chuàng)新策略進(jìn)行細(xì)胞代謝副產(chǎn)物的調(diào)控，他的博士生Chang D.Y.S.（張幼翔）利用氨和乳酸在培養(yǎng)環(huán)境中分別帶正電和負(fù)電荷的特性，創(chuàng)造性地采用電場(chǎng)移除氨和乳酸的策略，有效控制了氨和乳酸在細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器中的濃度，并通過(guò)在培養(yǎng)基中加入過(guò)量氨基酸和葡萄糖進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，將細(xì)胞密度從3.7×106細(xì)胞/mL 提高到9.1×106細(xì)胞/mL，抗體產(chǎn)量從170 mg/L提高到505 mg/L［57-58］。

細(xì)胞培養(yǎng)用商業(yè)化基礎(chǔ)培養(yǎng)基（如IMEM、DMEM）中氨基酸和葡萄糖濃度過(guò)高，細(xì)胞的新陳代謝效率較低并導(dǎo)致大量有毒副產(chǎn)物的產(chǎn)生和積累。研究表明，氨的產(chǎn)生主要來(lái)源于谷氨酰胺，其他氨基酸也能進(jìn)入TCA 循環(huán)代謝并產(chǎn)生氨［59-66］。氨的產(chǎn)生速率與谷氨酰胺濃度相關(guān)性較高，當(dāng)谷氨酰胺濃度從商業(yè)化基礎(chǔ)培養(yǎng)基中4～6 mmol/L 的濃度下調(diào)到0.5 mmol/L 時(shí)，大多數(shù)細(xì)胞的生長(zhǎng)速率并不會(huì)受到影響，但非必需的谷氨酰胺代謝和降解會(huì)大幅下降，氨的產(chǎn)生速率也因此會(huì)大幅下降［67-70］。同理，葡萄糖代謝是乳酸的主要來(lái)源，控制葡萄糖到一個(gè)不影響細(xì)胞生長(zhǎng)速率的較低濃度（如2～5 mmol/L）可有效降低乳酸的產(chǎn)生［71-77］。一些早期研究采用經(jīng)典的補(bǔ)料技術(shù)或連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)控制谷氨酰胺或葡萄糖濃度和代謝，獲得了一些積極結(jié)果，為20 世紀(jì)90 年代的流加工藝研發(fā)奠定了概念驗(yàn)證的基礎(chǔ)，但單變量控制的效果往往有限［52，55-56，67，73，75-77］，主要是因?yàn)榘被幔ú粌H僅是谷氨酰胺）和葡萄糖的代謝網(wǎng)絡(luò)是交織在一起的，具有一定的互補(bǔ)性和替代性。因此，控制細(xì)胞生長(zhǎng)所需的整個(gè)營(yíng)養(yǎng)環(huán)境（包含數(shù)十種必需的關(guān)鍵成分），同時(shí)解決氨和乳酸積累導(dǎo)致的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制問(wèn)題和營(yíng)養(yǎng)成分消耗補(bǔ)充問(wèn)題，才可能大幅度提高細(xì)胞密度和產(chǎn)品產(chǎn)量。

本文作者在王教授的指導(dǎo)下，通過(guò)系統(tǒng)研究細(xì)胞新陳代謝網(wǎng)絡(luò)，解析出合成一個(gè)細(xì)胞所需各類營(yíng)養(yǎng)成分的最低值，采用化學(xué)計(jì)量平衡的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和加料液控制生物反應(yīng)器中各營(yíng)養(yǎng)成分（主要是氨基酸和葡萄糖）的濃度和細(xì)胞代謝，以達(dá)到調(diào)控和優(yōu)化細(xì)胞新陳代謝、降低氨和乳酸產(chǎn)生速率和積累、提高細(xì)胞密度、延長(zhǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間、優(yōu)化目標(biāo)蛋白和抗體產(chǎn)量的目的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與標(biāo)準(zhǔn)批次培養(yǎng)對(duì)比，通過(guò)化學(xué)計(jì)量平衡的加料，使細(xì)胞生長(zhǎng)所需的氨基酸和葡萄糖濃度在流加培養(yǎng)全過(guò)程中均控制在較低但相對(duì)穩(wěn)定的水平，在保證細(xì)胞生長(zhǎng)速率的前提下，乳酸的產(chǎn)生速率從批次培養(yǎng)0.3 pmole/（cell·h）降低到0.0036 pmole/（cell·h），氨的產(chǎn)生速率從0.016 pmole/（cell·h）降低到0.0028 pmole/（cell·h）［78-80］。

由于乳酸的產(chǎn)生是一個(gè)涉及LDH 酶的催化反應(yīng)，王教授實(shí)驗(yàn)室團(tuán)隊(duì)人員（陳克勤博士，劉謙研究員和筆者）在20 世紀(jì)90 年代初期開(kāi)創(chuàng)性地嘗試通過(guò)基因工程改造的技術(shù)建立一個(gè)LDH-A 基因敲除的細(xì)胞系，以達(dá)到降低或消除乳酸副產(chǎn)物的目的，但受限于當(dāng)時(shí)的技術(shù)，僅獲得了一個(gè)單拷貝LDH-A 基因敲除的細(xì)胞克隆。批次細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果顯示，單拷貝LDH-A 基因敲除細(xì)胞的乳酸產(chǎn)生速率比未改造的母細(xì)胞降低了50%，最高細(xì)胞密度提高了30%，抗體產(chǎn)量提高了3 倍［81］。該技術(shù)驗(yàn)證了通過(guò)基因工程改造的方式控制細(xì)胞新陳代謝、提高營(yíng)養(yǎng)成分的代謝效率，降低有毒副產(chǎn)物的新方法。由于劉謙研究員回國(guó)后忙于政務(wù)，研究結(jié)果直到2001年才最終發(fā)表［81］。

3 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中新陳代謝網(wǎng)絡(luò)分析研究和化學(xué)計(jì)量模型解析

由于細(xì)胞生長(zhǎng)需要消耗大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，盡管較低的氨基酸和葡萄糖濃度可以降低氨和乳酸的產(chǎn)生，但不足以支撐細(xì)胞的持續(xù)生長(zhǎng)。因此，需要在培養(yǎng)過(guò)程中持續(xù)添加細(xì)胞生長(zhǎng)所消耗的多種氨基酸、葡萄糖和維生素等營(yíng)養(yǎng)成分。數(shù)十種營(yíng)養(yǎng)成分的配比以及加料速率控制是開(kāi)發(fā)高密度培養(yǎng)和高產(chǎn)量生產(chǎn)工藝的關(guān)鍵，因?yàn)橹灰幸环N關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)成分添加量不足，就可能導(dǎo)致該營(yíng)養(yǎng)成分成為細(xì)胞生長(zhǎng)的限制因素，并引起其他營(yíng)養(yǎng)成分和有毒副產(chǎn)物在反應(yīng)器中積累。

在20 世紀(jì)90 年代初期，大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)剛剛被嘗試應(yīng)用于生物藥的商業(yè)化生產(chǎn)。由于細(xì)胞新陳代謝涉及成千上萬(wàn)的生物化學(xué)反應(yīng)，涉及數(shù)十種營(yíng)養(yǎng)成分和成千上萬(wàn)的生物學(xué)物質(zhì)，如構(gòu)成細(xì)胞的各種蛋白質(zhì)（膜蛋白、酶、結(jié)構(gòu)蛋白等）、脂肪、碳水化合物、DNA、RNA等，以及各種各樣的中間產(chǎn)物和副產(chǎn)物。因此，細(xì)胞新陳代謝網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性和多樣性導(dǎo)致理論上存在無(wú)數(shù)種可能的代謝方式和結(jié)果，即細(xì)胞的生長(zhǎng)方式不是唯一的，而是多變的。舉例來(lái)說(shuō)，細(xì)胞既可以將葡萄糖代謝成乳酸，產(chǎn)生2個(gè)ATP，也可以在TCA循環(huán)中氧化成CO2和水，產(chǎn)生30～38 個(gè)ATP。在每次細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，轉(zhuǎn)化成乳酸和進(jìn)入TCA 循環(huán)的葡萄糖比例并不是固定的。很顯然，細(xì)胞的新陳代謝效率也是動(dòng)態(tài)變化的。因此，在90 年代初期以前，細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程被認(rèn)為是一個(gè)不可解的“黑箱”。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化主要憑經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)檢測(cè)主要營(yíng)養(yǎng)成分消耗情況、細(xì)胞生長(zhǎng)情況和蛋白質(zhì)產(chǎn)品表達(dá)量，得出一些經(jīng)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行試錯(cuò)式的迭代優(yōu)化。加料液的配比也通常是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基（如DMEM、IMEM 等）的基礎(chǔ)上進(jìn)行濃縮。采用濃縮加料液的流加工藝可以有效解決關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)成分在批次培養(yǎng)后期被耗盡所導(dǎo)致的細(xì)胞生長(zhǎng)停滯和死亡的問(wèn)題，取得了比批次培養(yǎng)更好的結(jié)果，但單克隆抗體產(chǎn)量仍一直處于幾十毫克/升至幾百毫克/升的水平［58，82-88］。

本文作者試圖通過(guò)系統(tǒng)分析復(fù)雜的細(xì)胞新陳代謝反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，梳理出營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)成分與細(xì)胞構(gòu)成成分以及能量代謝的對(duì)應(yīng)關(guān)系，進(jìn)而建立主導(dǎo)細(xì)胞合成的化學(xué)計(jì)量反應(yīng)方程式［89］。這是一項(xiàng)前所未有的高挑戰(zhàn)性任務(wù)。并結(jié)合自身的生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、化學(xué)工程，系統(tǒng)工程和計(jì)算機(jī)編程等方面的知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)，對(duì)新陳代謝反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)涉及的生化反應(yīng)按細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)類別進(jìn)行歸類和簡(jiǎn)化。例如，無(wú)論涉及的生化反應(yīng)如何復(fù)雜和多樣，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)總量及其氨基酸成分是基本穩(wěn)定的，而且可以準(zhǔn)確測(cè)定，因此，根據(jù)物質(zhì)守恒的原理，合成細(xì)胞內(nèi)所有蛋白質(zhì)所需的各類氨基酸是可以確定的。相對(duì)而言，細(xì)胞的能量代謝則更為復(fù)雜，一方面是細(xì)胞生長(zhǎng)所需的能量既包括合成細(xì)胞所需的能量，還包括細(xì)胞生長(zhǎng)停滯狀況下的基本消耗，即維持需求；另一方面，涉及細(xì)胞能量代謝的化學(xué)成分既包括葡萄糖，還包括多種氨基酸，而且這些營(yíng)養(yǎng)成分在一定程度上具有相互替代功能［61，66，90-92］。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)葡萄糖濃度太低時(shí)，谷氨酰胺和其他氨基酸的消耗速率會(huì)大幅提升，成為葡萄糖能量代謝的主要代償。

盡管細(xì)胞生長(zhǎng)的化學(xué)計(jì)量模型沒(méi)有唯一解，但理論上只有一個(gè)最優(yōu)解，即當(dāng)所有的細(xì)胞新陳代謝反應(yīng)均以最高效率和最佳方案進(jìn)行時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)所消耗的各種營(yíng)養(yǎng)成分達(dá)到最低、產(chǎn)生的氨和乳酸副產(chǎn)物達(dá)到最低。根據(jù)物質(zhì)守恒和能量守恒的原理，即可以解析出一個(gè)最佳的理想化的細(xì)胞生長(zhǎng)化學(xué)計(jì)量模型。在實(shí)際應(yīng)用中，理想化的化學(xué)計(jì)量關(guān)系是無(wú)法實(shí)現(xiàn)的，因?yàn)榧?xì)胞的能量代謝無(wú)法達(dá)到最優(yōu)，因此，需要對(duì)限制條件進(jìn)行適度放寬，即允許細(xì)胞在代謝過(guò)程中采用一些非最佳的替代方式，如產(chǎn)生一定量的乳酸和氨，從而使化學(xué)計(jì)量模型變得可行和具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值［78-80］。

4 化學(xué)計(jì)量平衡控制的動(dòng)物細(xì)胞高密度流加培養(yǎng)工藝開(kāi)發(fā)

根據(jù)已建立的動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)化學(xué)計(jì)量模型中解析出的各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的化學(xué)計(jì)量系數(shù)比，就可以參照一個(gè)普通化學(xué)反應(yīng)的控制原理設(shè)計(jì)并配制出化學(xué)計(jì)量平衡的細(xì)胞培養(yǎng)基和加料液。理論上，如果化學(xué)計(jì)量模型準(zhǔn)確預(yù)測(cè)了細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中的新陳代謝，則各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗速率是均衡的，即不會(huì)出現(xiàn)某些營(yíng)養(yǎng)成分被消耗盡而另一些成分大量積累的問(wèn)題，也就是說(shuō)可以通過(guò)一個(gè)包含幾十種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的加料液來(lái)控制細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器中所有關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)成分的濃度使其維持在一個(gè)最優(yōu)水平。這是以前不敢想象的目標(biāo)。

1992 年，本文作者對(duì)前文描述的化學(xué)計(jì)量模型進(jìn)行了解析，采用可收集的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)細(xì)胞的主要成分進(jìn)行了估算：細(xì)胞干重為0.36 ng/細(xì)胞，其中各主要成分占比分別為：蛋白質(zhì)37.5%，DNA 2.5%，RNA 6.9%，脂類20%，碳水化合物25%。此外，利用文獻(xiàn)報(bào)道的207 個(gè)蛋白質(zhì)氨基酸組成，計(jì)算出一個(gè)平均的氨基酸摩爾分?jǐn)?shù)用于化學(xué)計(jì)量模型的解析。具體為：Ala 9.0%；Arg 4.7%；Asn 4.4%；Asp 5.5%；Cys 2.8%；Glu 6.2%；Gln 3.9%；Gly 7.5%；His 2.1%；Ile 4.6%；Leu 7.5%；Lys 7.0%；Met 1.7%；Phe 3.5%；Pro 4.6%；Ser 7.1%；Thr 6.0%；Trp 1.1%；Tyr 3.5%；Val 6.9%。根據(jù)解析出的各營(yíng)養(yǎng)成分的化學(xué)計(jì)量系數(shù)，設(shè)計(jì)了第一代的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和加料液配方，并在T 形培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)進(jìn)行了兩輪流加培養(yǎng)試驗(yàn)驗(yàn)證。批次培養(yǎng)中，各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)隨著細(xì)胞生長(zhǎng)而快速被消耗，其濃度不斷下降；而在化學(xué)計(jì)量控制的流加培養(yǎng)中，葡萄糖和氨基酸的起始濃度就處于一個(gè)較低但足以維持細(xì)胞生長(zhǎng)的濃度，培養(yǎng)過(guò)程加入的加料液對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中所消耗的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行了有效的補(bǔ)充，因此大多數(shù)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度維持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平，部分成分的濃度還有一定的升高［93］。與批次培養(yǎng)對(duì)比，氨和乳酸的產(chǎn)生速率得到了大幅度（26倍和50倍）的降低。由于氨和乳酸的積累得到非常有效的控制，階段性的加料確保了關(guān)鍵必需營(yíng)養(yǎng)成分的補(bǔ)充和維持在細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的最低濃度以上，細(xì)胞密度得到了大幅度的提升，而且培養(yǎng)時(shí)間從批次培養(yǎng)的150 h 延長(zhǎng)到了流加培養(yǎng)的300 h 以上。因此，抗體的產(chǎn)量從50 mg/L 首次提高到了550 mg/L。該研究結(jié)果于1994 年初在生物工程權(quán)威刊物Biotechnology &Bioengineering上發(fā)表［93］。細(xì)胞生長(zhǎng)的化學(xué)計(jì)量模型在流加培養(yǎng)中實(shí)現(xiàn)跨越式突破的應(yīng)用價(jià)值首次得到了初步認(rèn)可。

此后，根據(jù)首次試驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)和經(jīng)驗(yàn)對(duì)化學(xué)計(jì)量模型進(jìn)行了校正和優(yōu)化，并對(duì)細(xì)胞的主要成分進(jìn)行了實(shí)測(cè)。結(jié)果顯示，細(xì)胞干重為0.25 ng/細(xì)胞，其中各主要成分占比分別為，蛋白質(zhì)72.9%，DNA 1.4%，RNA 3.8%，脂類13.5%，碳水化合物3.5%，與首次計(jì)算采用的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)偏差較大。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的氨基酸摩爾分?jǐn)?shù)實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)為：Ala 8.25%；Arg 5.93%；Asn 4.4%；Asp 4.69%；Cys 2.8%；Gln 6.2%；Glu 4.96%；Gly 8.54%；His 2.16%；Ile 4.22%；Leu 8.11%；Lys 6.79%；Met 2.17%；Phe 3.19%；Pro 5.26%；Ser 6.89%；Thr 5.73%；Trp 1.1%；Tyr 2.59%；Val 6.02%。實(shí)測(cè)的氨基酸比例與首次采用的平均值也有一些偏差，但整體符合性較好，對(duì)模型計(jì)算結(jié)果的影響不大。

根據(jù)優(yōu)化的模型和細(xì)胞株的實(shí)測(cè)組成數(shù)據(jù)解析出的化學(xué)計(jì)量系數(shù)進(jìn)行了第二輪的培養(yǎng)基設(shè)計(jì)，并在自動(dòng)控制的2L 生物反應(yīng)器中進(jìn)行了第二輪驗(yàn)證和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。在本輪實(shí)驗(yàn)中，加料液的添加是由計(jì)算機(jī)控制自動(dòng)連續(xù)進(jìn)行的，因此避免了間歇式手動(dòng)加料造成的瞬時(shí)濃度刺突式的增加。溶氧和pH 值也得到了控制并維持穩(wěn)定，從而避免了首輪試驗(yàn)中T 形培養(yǎng)瓶中溶氧限制和pH 下降產(chǎn)生的局限性。

結(jié)果顯示，乳酸的產(chǎn)生速率比批次培養(yǎng)降低了62 倍，比首輪采用化學(xué)計(jì)量模型控制的T 形培養(yǎng)瓶流加培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步降低了8倍；抗體產(chǎn)量比批次培養(yǎng)提高了17 倍，達(dá)到900 mg/L，此為當(dāng)時(shí)文獻(xiàn)報(bào)道最高水平。在350 h 以上的培養(yǎng)中，總細(xì)胞密度達(dá)到了2.2×107細(xì)胞/mL，最高活細(xì)胞密度達(dá)到了6.3×106細(xì)胞/mL，而乳酸的峰值濃度僅為11 mmol/L，氨的峰值濃度僅為6 mmol/L 左右。葡萄糖和谷氨酰胺的濃度在培養(yǎng)全過(guò)程中均得到了良好控制［94］，再次驗(yàn)證了化學(xué)計(jì)量模型對(duì)動(dòng)物細(xì)胞流加培養(yǎng)工藝優(yōu)化和控制的巨大價(jià)值。

通過(guò)化學(xué)計(jì)量模型解決了關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)成分在培養(yǎng)過(guò)程中被耗盡或大量積累的問(wèn)題，同時(shí)還大幅度降低了有毒副產(chǎn)物乳酸和氨的產(chǎn)生速率，避免了氨和乳酸積累到抑制細(xì)胞生長(zhǎng)或?qū)е录?xì)胞死亡的濃度。然而，在嚴(yán)格控制的細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器中，當(dāng)活細(xì)胞密度達(dá)到（5～10）×106細(xì)胞/mL 水平時(shí)，盡管總細(xì)胞密度繼續(xù)增加，但活細(xì)胞密度不再增加，導(dǎo)致培養(yǎng)后期的細(xì)胞活率下降，很可能是還有一些細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)未能通過(guò)化學(xué)計(jì)量模型得到有效控制。

因此，又對(duì)流加培養(yǎng)工藝過(guò)程和控制進(jìn)行了進(jìn)一步的優(yōu)化：①通過(guò)離線細(xì)胞計(jì)數(shù)，每12 h 對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)速率和加料速率進(jìn)行校正；②通過(guò)分析認(rèn)為，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的磷將可能在培養(yǎng)后期被耗盡，進(jìn)而影響細(xì)胞的能量代謝和磷脂合成，因此，對(duì)磷的化學(xué)計(jì)量系數(shù)進(jìn)行了測(cè)算并應(yīng)用到加料液配方設(shè)計(jì)中；③在培養(yǎng)中期添加了血清和金屬離子（Li+，Zn2+，Cu2+等）。由于上述優(yōu)化改進(jìn)，流加培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)到550 h，最高活細(xì)胞密度達(dá)到1.7×107細(xì)胞/mL（圖2），總細(xì)胞密度達(dá)到5×107細(xì)胞/mL。細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器從外觀上觀察已成肉色。在未采取細(xì)胞截留措施的流加培養(yǎng)中能達(dá)到如此高的細(xì)胞密度是前所未有的，因此，抗體產(chǎn)量也達(dá)到了前所未有的2400 mg/L（圖3），比批次培養(yǎng)提高了45 倍［79］。上述結(jié)果是基于化學(xué)計(jì)量平衡的培養(yǎng)基設(shè)計(jì)和加料速率控制，關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)成分維持在一個(gè)較優(yōu)且基本恒定的水平而實(shí)現(xiàn)的。如圖4 和圖5 所示，與批次培養(yǎng)中葡萄糖和谷氨酰胺濃度由于細(xì)胞代謝的消耗而隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而快速下降不同，在化學(xué)計(jì)量平衡和控制的流加培養(yǎng)中，葡萄糖和谷氨酰胺濃度在全培養(yǎng)過(guò)程中均被控制在一個(gè)較低且相對(duì)穩(wěn)定的濃度范圍，既避免了濃度過(guò)高而導(dǎo)致的低效率代謝和有毒副產(chǎn)物的過(guò)度積累，又避免了因必要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的耗盡而導(dǎo)致的細(xì)胞生長(zhǎng)停滯和死亡。因此，由于細(xì)胞生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)環(huán)境得到了有效的控制，細(xì)胞的新陳代謝效率得到大幅度提升，副產(chǎn)物的產(chǎn)生速率大幅度下降（圖6）。僅有3.4%的葡萄糖被轉(zhuǎn)化為乳酸，其余均被用于細(xì)胞成分的合成和更高效的TCA 循環(huán)能量代謝，而在批次培養(yǎng)對(duì)照中，有67%的葡萄糖被轉(zhuǎn)化成乳酸，既導(dǎo)致葡萄糖的低效利用，又導(dǎo)致乳酸副產(chǎn)物的積累。

圖2 化學(xué)計(jì)量平衡和加料控制的流加培養(yǎng)工藝中活細(xì)胞密度與批次培養(yǎng)對(duì)比Fig.2 Comparison of the viable cell density in the perfusion culture developed on stoichiometric balance and feed control to that observed in the batch process

圖3 化學(xué)計(jì)量平衡和加料控制的流加培養(yǎng)工藝中抗體產(chǎn)量與批次培養(yǎng)對(duì)比Fig.3 Comparison of the antibody yield in the perfusion culture developed on stoichiometric balance and feed control with that of the batch process

圖4 化學(xué)計(jì)量平衡和加料控制的流加培養(yǎng)工藝中葡萄糖控制情況與批次培養(yǎng)對(duì)比Fig.4 Comparison of the glucose control index of the perfusion culture developed on stoichiometric balance and feed control with that of the batch process

圖5 化學(xué)計(jì)量平衡和加料控制的流加培養(yǎng)工藝中谷氨酰胺控制情況與批次培養(yǎng)對(duì)比Fig.5 Comparison of the glutamine control for the perfusion culture developed on stoichiometric balance and feed control with that of the batch process

圖6 化學(xué)計(jì)量平衡和加料控制的流加培養(yǎng)工藝中副產(chǎn)物乳酸和氨產(chǎn)生速率與批次培養(yǎng)對(duì)比Fig.6 Comparison of the byproduct lactic acid and ammonia production for the perfusion developed on stoichiometric balance and feed control with those of the batch process

為驗(yàn)證化學(xué)計(jì)量模型的通用性，還針對(duì)表達(dá)γ-干擾素蛋白的CHO 細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)流加工藝進(jìn)行了初步優(yōu)化。采用間歇式的手動(dòng)加料方式，在T 形培養(yǎng)瓶培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，化學(xué)計(jì)量平衡的培養(yǎng)基設(shè)計(jì)和加料同樣可以將葡萄糖和氨基酸濃度控制在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平。與批次對(duì)照培養(yǎng)比較，活細(xì)胞密度提高2 倍以上，γ-干擾素蛋白產(chǎn)量從7.6 mg/L 提高到30 mg/L 的水平［95］。

2000 年，王義翹教授的學(xué)生邱紫文博士畢業(yè)后回臺(tái)灣任教，將動(dòng)物細(xì)胞的化學(xué)計(jì)量模型完整地應(yīng)用到昆蟲(chóng)細(xì)胞流加培養(yǎng)中并得到了良好的結(jié)果［96］。與經(jīng)典的流加培養(yǎng)工藝對(duì)比，采用化學(xué)計(jì)量模型平衡和控制的昆蟲(chóng)細(xì)胞流加培養(yǎng)工藝，SF21 細(xì)胞密度提高了3 倍，達(dá)到1.7×107細(xì)胞/mL，白介素5 蛋白表達(dá)量也得到了大幅度提高。盡管昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)與哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)有較大的不同，然而物質(zhì)守恒和能量守恒的定律不變，細(xì)胞的新陳代謝化學(xué)反應(yīng)原理不變，因此動(dòng)物細(xì)胞的化學(xué)計(jì)量模型和昆蟲(chóng)細(xì)胞基本一致，只是細(xì)胞的成分有差別，細(xì)胞的副產(chǎn)物產(chǎn)生速率有差別，維持細(xì)胞生長(zhǎng)速率所需的各種關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)最佳濃度有差別。該研究進(jìn)一步驗(yàn)證了化學(xué)計(jì)量模型在優(yōu)化流加細(xì)胞培養(yǎng)工藝中的廣泛應(yīng)用價(jià)值。

根據(jù)多輪化學(xué)計(jì)量平衡和控制的流加細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)所測(cè)定的細(xì)胞生長(zhǎng)，各營(yíng)養(yǎng)成分的加入量、消耗量、副產(chǎn)物的產(chǎn)生以及目標(biāo)抗體的合成等實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用化學(xué)劑量模型中涉及的化學(xué)反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，本文作者對(duì)各種營(yíng)養(yǎng)成分的實(shí)際代謝路徑和效率進(jìn)行了系統(tǒng)分析［97］，還對(duì)細(xì)胞的整個(gè)能量代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了解析［98］。上述分析對(duì)動(dòng)物細(xì)胞探索在不同的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境下的新陳代謝規(guī)律提供了重要的數(shù)據(jù)，為后續(xù)進(jìn)一步修正和優(yōu)化化學(xué)計(jì)量模型以及流加工藝提供了很多重要的線索和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

在詳細(xì)發(fā)表上述模型、培養(yǎng)基配方、流加策略以及多輪實(shí)驗(yàn)結(jié)果后，該研究在學(xué)術(shù)界和工業(yè)界產(chǎn)生了強(qiáng)烈反響。應(yīng)工業(yè)界的要求，筆者在王教授實(shí)驗(yàn)室從事博士論文研究的最后一年，指導(dǎo)碩士研究生共同完成了動(dòng)物細(xì)胞化學(xué)計(jì)量模型通用軟件的開(kāi)發(fā)。此后，該軟件系統(tǒng)被廣泛免費(fèi)提供給加入MIT 生物技術(shù)工程中心生物制藥工業(yè)聯(lián)盟的制藥企業(yè)會(huì)員并被應(yīng)用于支持其商業(yè)化產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝開(kāi)發(fā)和優(yōu)化。

王義翹教授實(shí)驗(yàn)室自20 世紀(jì)70 年代開(kāi)始開(kāi)展的細(xì)菌發(fā)酵和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)研究工作，奠定了90 年代動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用于單克隆抗體和重組蛋白藥物商業(yè)化生產(chǎn)工藝的基礎(chǔ)。在抗體藥物產(chǎn)業(yè)化初始階段，王教授實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展的動(dòng)物細(xì)胞高密度培養(yǎng)系列研究對(duì)后續(xù)30 年抗體藥物大規(guī)模高效率流加生產(chǎn)工藝的廣泛商業(yè)化應(yīng)用和不斷發(fā)展起到了重要的支撐和推動(dòng)作用。

5 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中大分子蛋白的糖基化修飾多樣性分析和調(diào)控

王義翹教授實(shí)驗(yàn)室不僅在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)工藝開(kāi)發(fā)和優(yōu)化上做出奠基性貢獻(xiàn)，還在20 世紀(jì)90 年代初期就開(kāi)始對(duì)重組蛋白藥物的糖基化修飾多樣性進(jìn)行了比較系統(tǒng)的研究。單克隆抗體和γ-干擾素等蛋白質(zhì)藥物的糖基化存在2 個(gè)維度的多樣化：一是糖基化位點(diǎn)的糖基化修飾多樣化，即宏觀多樣性（macroheterogeneity），如有些位點(diǎn)的糖基化修飾比例很高，而有些位點(diǎn)的糖基化修飾比例可能較低，且隨培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時(shí)間動(dòng)態(tài)變化；二是蛋白上的糖鏈結(jié)構(gòu)存在多樣性，即微觀多樣性（microheterogeneity）。糖鏈結(jié)構(gòu)對(duì)蛋白質(zhì)的性質(zhì)、穩(wěn)定性、代謝、生物學(xué)功能都可能有重要意義。舉例來(lái)說(shuō)，抗體藥物的糖基化位點(diǎn)位于抗體的重鏈恒定區(qū)，糖鏈參與和影響抗體與免疫細(xì)胞上的Fc 受體（CD16a，CD16b，CD32a，CD32b，CD64）和FcRn分子的結(jié)合，對(duì)抗體的藥代動(dòng)力學(xué)、Fc功能（如ADCC、CDC、ADCP生物活性）均可能有重要影響［99-104］。

王教授的學(xué)生Harmon B.博士在20世紀(jì)90年代初期開(kāi)始探索基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI/TOF mass spectrometry）技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)糖基化多樣性的快速分析和監(jiān)測(cè)［105］，建立了高靈敏度2 h 快速分析蛋白質(zhì)各糖基化位點(diǎn)糖鏈結(jié)構(gòu)多樣性的技術(shù)，為實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)研究和檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境、過(guò)程參數(shù)對(duì)蛋白質(zhì)和抗體藥物糖基化多樣性變化，控制大分子生物藥糖基化關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)提供了重要的手段。在此基礎(chǔ)上，王教授的博士生顧學(xué)軍對(duì)CHO 細(xì)胞表達(dá)γ-干擾素蛋白糖基化及唾液酸修飾情況進(jìn)行了分析，研究了無(wú)血清培養(yǎng)過(guò)程中添加蛋白水解物對(duì)CHO 細(xì)胞代謝及γ-干擾素蛋白唾液酸修飾程度的影響，并成功通過(guò)添加N-乙酰基甘露糖胺（N-acetylmannosamine）對(duì)唾液酸修飾進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到提高唾液酸修飾比例的目的［106-110］。利用CHO 細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)態(tài)控制的特點(diǎn)，王教授的博士生Nyberg G.和Balcarcel R.與Harmon B.合作，系統(tǒng)研究了細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境和代謝中間產(chǎn)物對(duì)γ-干擾素蛋白糖基化修飾程度的影響［110-111］，為控制蛋白質(zhì)藥物糖基化特性提供了重要的線索。

6 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中剪切力對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和活率的影響研究

動(dòng)物細(xì)胞在攪拌式生物反應(yīng)器中高密度懸浮大規(guī)模培養(yǎng)已經(jīng)成為重組蛋白藥物、單克隆抗體藥物和基因工程疫苗類產(chǎn)品的主流生產(chǎn)技術(shù)。由于需要連續(xù)不斷地將空氣中的氧氣傳遞到液體培養(yǎng)基中的細(xì)胞，并將細(xì)胞新陳代謝產(chǎn)生的二氧化碳移除出生物反應(yīng)器，機(jī)械攪拌和空氣鼓泡是大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的必要手段，也是工藝放大的關(guān)鍵和難點(diǎn)。這是因?yàn)閯?dòng)物細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞壁的保護(hù)，細(xì)胞膜對(duì)剪切力很敏感，在細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器中無(wú)法耐受高速攪拌和鼓泡所產(chǎn)生的剪切力。

王義翹教授早在20 世紀(jì)60 年代末就開(kāi)始研究流體力學(xué)對(duì)動(dòng)物細(xì)胞死亡的影響。為了模擬細(xì)胞在攪拌式生物反應(yīng)器中所經(jīng)受的剪切力并能準(zhǔn)確計(jì)算剪切力，Augenstein D.C.設(shè)計(jì)了一個(gè)毛細(xì)管裝置讓動(dòng)物細(xì)胞在含10%牛血清的培養(yǎng)基懸浮液中多次通過(guò)毛細(xì)管并測(cè)定細(xì)胞死亡率，建立了細(xì)胞死亡速率與剪切力的關(guān)聯(lián)關(guān)系，為細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)、培養(yǎng)工藝放大以及生物反應(yīng)器的控制提供了基礎(chǔ)性的依據(jù)［112］。原代細(xì)胞的微載體貼壁培養(yǎng)所用的微載體直徑遠(yuǎn)大于單個(gè)動(dòng)物細(xì)胞的直徑，因此，貼附在微載體上的動(dòng)物細(xì)胞對(duì)攪拌所產(chǎn)生的剪切力更敏感，容易導(dǎo)致細(xì)胞脫落后死亡。王教授的博士生Croughan 在80 年代對(duì)FS-4 細(xì)胞微載體培養(yǎng)攪拌式生物反應(yīng)器中的流體力學(xué)和湍流所產(chǎn)生的剪切力進(jìn)行了系統(tǒng)模擬分析和計(jì)算，系統(tǒng)研究了攪拌速度對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和死亡速率的影響［27，113］，以及培養(yǎng)液黏度對(duì)減輕湍流所產(chǎn)生的剪切力和細(xì)胞損傷的影響［31］。90 年代，王教授的博士生Orton 和Meier 先后對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器中空氣鼓泡導(dǎo)致的損傷和死亡進(jìn)行了全面系統(tǒng)的研究［114-116］。Orton采用熒光示蹤法全程記錄了氣泡從液體中上升并浮出水面破裂過(guò)程中細(xì)胞死亡的情況，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞死亡主要發(fā)生在氣泡破裂的瞬間。模擬計(jì)算顯示，氣泡破裂時(shí)可產(chǎn)生巨大的剪切力并足以撕裂細(xì)胞。她還比較了不同濃度的多種表面活性劑，如PF68，對(duì)降低空氣鼓泡導(dǎo)致的細(xì)胞死亡作用的影響。Meier 在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了PF68 等高分子表面活性劑分別對(duì)氣泡在上升階段和破裂時(shí)細(xì)胞死亡的影響［115-116］。

本文作者在默克公司工作期間帶領(lǐng)學(xué)生對(duì)不同表面活性劑PF68 濃度對(duì)細(xì)胞吸附、死亡的影響首次進(jìn)行了準(zhǔn)確測(cè)定［117］。結(jié)果顯示，在PF68低濃度情況下，細(xì)胞被大量富集到氣泡表面，氣泡層的細(xì)胞密度可以達(dá)到反應(yīng)器中細(xì)胞密度的10 倍。當(dāng)PF68濃度提高到1 g/L 時(shí)，氣泡層的細(xì)胞密度僅為反應(yīng)器中細(xì)胞密度的一半左右。因此，在無(wú)血清培養(yǎng)基中添加PF68 等高分子表面活性劑對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用主要是降低氣泡對(duì)細(xì)胞吸附并在氣泡層的富集作用。

7 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的未來(lái)方向和應(yīng)用前景

王義翹教授團(tuán)隊(duì)在20 世紀(jì)90 年代及以前針對(duì)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)開(kāi)展的奠基性研發(fā)，推動(dòng)了90 年代至今全球生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，高密度動(dòng)物細(xì)胞流加培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)成為單克隆抗體規(guī)?；a(chǎn)的主流技術(shù)。在此基礎(chǔ)上，過(guò)去30 年，生物藥產(chǎn)業(yè)化技術(shù)在三個(gè)方面取得了重要進(jìn)展：①分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步持續(xù)推動(dòng)目標(biāo)蛋白表達(dá)載體的不斷優(yōu)化，穩(wěn)定高產(chǎn)細(xì)胞株獲取成為可能；②高通量細(xì)胞克隆篩選技術(shù)（如流式細(xì)胞分選儀和ClonePix 細(xì)胞克隆系統(tǒng)）的推廣應(yīng)用，使細(xì)胞株的表達(dá)水平不斷提高；③通過(guò)對(duì)特定單克隆細(xì)胞株的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化，以流加培養(yǎng)方式，活細(xì)胞密度達(dá)到107細(xì)胞/mL 已成為常態(tài)，因此，單克隆抗體產(chǎn)量已普遍超過(guò)3 g/L。

由于單克隆抗體藥物的臨床應(yīng)用價(jià)值得到廣泛驗(yàn)證，臨床需求大的品種往往需要采用10 000 L 以上規(guī)模的生物反應(yīng)器進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)。國(guó)際主流生物制藥企業(yè)大多建成了12 000 L、15 000 L 細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)線。盡管理論上反應(yīng)器規(guī)?？梢赃M(jìn)一步提高，但隨著培養(yǎng)規(guī)模的擴(kuò)大，下游純化成本成為主要瓶頸，因此進(jìn)一步放大細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器的風(fēng)險(xiǎn)收益比不再具有吸引力。近年來(lái)，采用設(shè)備投資小、建設(shè)周期短、車間GMP 認(rèn)證快、不要對(duì)固定式生物反應(yīng)器進(jìn)行清洗和消毒的一次性生物反應(yīng)器（如2000 L）開(kāi)展產(chǎn)業(yè)化，得到了中小型生物技術(shù)企業(yè)的青睞，尤其是在我國(guó)得到了快速推廣和應(yīng)用，對(duì)我國(guó)生物制藥領(lǐng)域的高速發(fā)展起到了重要的推動(dòng)作用。

可以預(yù)見(jiàn)，隨著重組蛋白藥物、單克隆抗體藥物、雙特異性抗體藥物、抗體藥物偶聯(lián)物（ADC）、CAR-T 細(xì)胞治療、重組蛋白疫苗、病毒樣顆粒疫苗等生物藥的開(kāi)發(fā)和商業(yè)化，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（動(dòng)物細(xì)胞、T 細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)）將得到越來(lái)越多的應(yīng)用，推動(dòng)生物產(chǎn)品的不斷發(fā)展和進(jìn)步。王義翹教授團(tuán)隊(duì)數(shù)十年前奠定的基礎(chǔ)仍將不斷發(fā)揮重要作用。

8 總結(jié)

王義翹教授自20 世紀(jì)60 年代開(kāi)始，以其前瞻性的洞察力和深厚的工程學(xué)背景，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了數(shù)十年全面系統(tǒng)的研究和優(yōu)化，尤其是在80 年代中期，領(lǐng)導(dǎo)組建了美國(guó)唯一的生物工程技術(shù)中心（BPEC），匯集了MIT 化工系、生物系以及世界各地不同領(lǐng)域的教授專家進(jìn)行交叉學(xué)科的研究和探索，為90 年代開(kāi)始的全球重組蛋白、單克隆抗體和基因工程疫苗等生物技術(shù)產(chǎn)品的蓬勃發(fā)展奠定了堅(jiān)實(shí)的理論和工程基礎(chǔ)，做出了不可磨滅的偉大貢獻(xiàn)。本文限于作者自身的專業(yè)知識(shí)和在王義翹教授實(shí)驗(yàn)室的短暫經(jīng)歷，僅對(duì)王教授在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)及相關(guān)領(lǐng)域的奠基性工作進(jìn)行了粗淺的概述。王教授培養(yǎng)的學(xué)生遍布世界各國(guó)主流的生物制藥企業(yè)并成為推動(dòng)生物工程技術(shù)不斷發(fā)展的核心力量，將王義翹教授的思想和品德不斷傳承下去，推動(dòng)人類健康事業(yè)的不斷發(fā)展。王義翹教授永垂不朽！