謝良志

（1 北京市蛋白和抗體研發(fā)及制備工程技術(shù)研究中心，北京神州細胞生物技術(shù)集團股份公司，北京 100176；2 單克隆抗體上游研發(fā)技術(shù)北京市重點實驗室，北京義翹神州科技股份有限公司，北京 100176）

引言：生物藥產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展的50年

生物技術(shù)自20 世紀70 年代開始萌芽，經(jīng)歷了從采用微生物（如大腸桿菌）表達生產(chǎn)分子量較小、且無需翻譯后修飾的蛋白質(zhì)藥物（如生長因子、白介素2 等），到采用真核細胞表達生產(chǎn)分子量大、具有糖基化等翻譯后修飾、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)藥物（如重組八因子蛋白、單克隆抗體藥物等）的發(fā)展和進步歷程。工程技術(shù)化一直是推動和制約生物藥產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的關(guān)鍵。大規(guī)模中國倉鼠卵巢細胞（CHO 細胞）培養(yǎng)已經(jīng)成為生物制藥行業(yè)最廣泛使用的生產(chǎn)工藝技術(shù)。然而，在生物藥發(fā)展的早期階段，采用對剪切力敏感、需要添加動物血清而且需要貼壁才能生長的哺乳動物細胞來實現(xiàn)年產(chǎn)量成噸級抗體藥物規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)是不敢想象的。

王義翹教授以其敏銳的前瞻性和戰(zhàn)略性眼光，敢于挑戰(zhàn)科學(xué)和工程領(lǐng)域最尖端的技術(shù)，自20 世紀60 年代率先進入微生物發(fā)酵和動物細胞培養(yǎng)等工程技術(shù)領(lǐng)域，他的研究除本文重點介紹的研究方向外，還涉及生物反應(yīng)器的自動化在線監(jiān)測和控制、蛋白質(zhì)復(fù)性技術(shù)、分離純化技術(shù)等，系統(tǒng)全面地涵蓋了生物藥產(chǎn)業(yè)化各個方面的關(guān)鍵技術(shù)，為當(dāng)代生物藥大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定了堅實的基礎(chǔ)，做出了開創(chuàng)性的杰出貢獻，被譽為“生物化工領(lǐng)域奠基人”（the founding fathers of the field of biochemical engineering）［1］，“生物化工的驅(qū)動力”（the driving force in biochemical engineering）［2］；“過去40 年生物技術(shù)工業(yè)有影響力的領(lǐng)導(dǎo)者”（influential leader of the biotechnology industry over the past four decades）［3］，“生物化工領(lǐng)域的締造者和權(quán)威”（an architect of the field of biochemical engineering，a luminary in the field of biochemical engineering）［4］，“生物化工之父”（father of biochemical engineer）［5］，“生物技術(shù)之父”（father of biotechnology）［6］和“現(xiàn)代生物技術(shù)之父”（the father of modern biotechnology）［7］。

20 世紀80 年代，哺乳動物細胞培養(yǎng)開始用于需要糖基化等翻譯后修飾的蛋白質(zhì)藥物的生產(chǎn)。早期的生物藥品種主要為臨床劑量較低的因子類蛋白藥物，如重組八因子（factor Ⅷ），紅細胞生成素（erythropoietin，EPO），組織型纖溶酶原激活劑（tissue plasminogen activator，tPA）等。受限于當(dāng)時對哺乳動物細胞代謝和培養(yǎng)的了解以及極為有限的工藝開發(fā)能力和工藝放大經(jīng)驗，EPO的生產(chǎn)工藝為添加牛血清的轉(zhuǎn)瓶（roller bottle）貼壁培養(yǎng)［8］，GMP 無菌操作是在一個封閉的、由自動化機器手操作的無人車間完成的，無菌保障和規(guī)模放大都極具挑戰(zhàn)性。由于表達量低，產(chǎn)品穩(wěn)定性差等因素，八因子蛋白則是采用連續(xù)灌注（perfusion）或重復(fù)批次培養(yǎng)（repeated-batch）實現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)［9］。

20 世紀80 年代末，單克隆抗體藥物研發(fā)開始起步。由于抗體的臨床劑量通常達到幾百毫克，比因子類產(chǎn)品微克級的劑量高幾個數(shù)量級，因此，需要開發(fā)操作簡單、容易放大、產(chǎn)量高的細胞培養(yǎng)生產(chǎn)工藝技術(shù)。優(yōu)化細胞培養(yǎng)生產(chǎn)工藝需要突破一系列的認知和技術(shù)瓶頸，如將CHO 細胞從貼壁生長馴化成懸浮生長，從含血清培養(yǎng)馴化成無血清培養(yǎng)，控制葡萄糖和氨基酸代謝的抑制細胞生長的副產(chǎn)物（如乳酸和氨），控制細胞生長所需數(shù)十種營養(yǎng)物質(zhì)在反應(yīng)器中的濃度等。

此后30 年，哺乳動物細胞表達的生物技術(shù)產(chǎn)品商業(yè)化進入快速增長階段，截至2020 年底，美國FDA 已批準(zhǔn)101 個單克隆抗體藥物上市，其中2010 年后批準(zhǔn)上市的品種占72 個，抗體藥物研發(fā)和商業(yè)化呈快速增長態(tài)勢。2015～2020 年，全球銷售排名前十的藥品中生物藥品種穩(wěn)住6～8 席。排名第一的阿達木單抗（TNF-α抗體，治療自身免疫性疾?。┳?002 年底獲批上市以來，年銷售額快速增長，2018 年達到200 億美元（圖1）。截至2020 年，阿達木單抗累計銷售額已達到1720 億美元，成為歷史上最成功的藥品。阿達木單抗的快速增長是生物藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個縮影，從一個側(cè)面體現(xiàn)了生物藥過去三十年的蓬勃發(fā)展歷程。單克隆抗體等生物藥商業(yè)化取得的巨大成功，催生的大規(guī)模GMP 生產(chǎn)需求的實現(xiàn)，得益于哺乳動物細胞培養(yǎng)工藝技術(shù)的不斷優(yōu)化以及生產(chǎn)規(guī)模的不斷擴大。王義翹教授領(lǐng)導(dǎo)建立的MIT 生物技術(shù)和工程中心（MIT-BPEC）在90年代開展的針對動物細胞培養(yǎng)、代謝、控制、工藝放大以及蛋白質(zhì)質(zhì)量控制等開拓性研究奠定了國際生物藥工業(yè)化生產(chǎn)的基礎(chǔ)。王義翹教授帶領(lǐng)學(xué)生從動物細胞培養(yǎng)、生產(chǎn)工藝的各個方面進行了系統(tǒng)性的研究，本文僅對其部分研究工作和成就進行簡單概述和總結(jié)。王義翹教授在其他生物工程領(lǐng)域的貢獻和成績已在其他文章中進行了總結(jié)［10］。

圖1 阿達木單抗年銷售額Fig.1 Annual sales of Adamuzumab

1 王義翹教授團隊早期開展的基礎(chǔ)性研究和開發(fā)工作

早期的動物細胞培養(yǎng)研究大多以通過培養(yǎng)皿（culture dish）和轉(zhuǎn)瓶（roller bottle）貼壁培養(yǎng)的原代細胞為主，很難實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。1967 年，van Wezel A L［11］首次提出采用陰離子微載體培養(yǎng)原代細胞的概念并成功實現(xiàn)多種原代細胞的貼壁懸浮培養(yǎng)，但由于細胞接種貼壁效率低，微載體對細胞生長存在抑制性“毒性”等一系列問題，此后10 年的反復(fù)研究并沒有取得實質(zhì)性的進展［12-15］。1977—1979 年，Levine D.W.和Giard D.J.在王義翹教授和Thilly W.G.的指導(dǎo)下，采用帶正電荷的葡聚糖微球（dextran microsphere）作為微載體進行細胞培養(yǎng)，解決了細胞貼壁效率低、微載體對培養(yǎng)基中活性成分吸附造成的細胞生長抑制等關(guān)鍵問題，才真正推動微載體細胞培養(yǎng)技術(shù)進入工業(yè)化應(yīng)用階段［16-21］。此后，王義翹教授和他的學(xué)生Hu W.S.、Croughan M.、Hamel J-F［22-31］又對微載體培養(yǎng)的細胞接種密度、微球粒徑、細胞傳代、微載體密度、剪切力等關(guān)鍵工藝參數(shù)進行了系統(tǒng)研究和優(yōu)化。王義翹教授團隊的早期研究奠定了此后數(shù)十年微載體細胞培養(yǎng)技術(shù)和工業(yè)化應(yīng)用不斷發(fā)展進步的重要基礎(chǔ)，也為90 年代經(jīng)馴化后CHO 細胞的懸浮培養(yǎng)工藝開發(fā)和優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。

20世紀80年代末，王義翹教授團隊還設(shè)計了一種開創(chuàng)性的氣升式纖維固定床生物反應(yīng)器（air-lift fiber bed bioreactor）進行貼壁細胞培養(yǎng)。Perry S.D.［32］在王教授指導(dǎo)下首先對氣升式玻璃纖維固定床生物反應(yīng)器進行了概念設(shè)計和初步可行性驗證。此后，王教授團隊的Chiou T.W.（邱紫文）和Murakami S.［33-34］又連續(xù)發(fā)表了兩篇論文分析了規(guī)模化放大的可行性：采用上述概念實現(xiàn)了氣升式玻璃纖維固定床生物反應(yīng)器66天的CHO細胞貼壁培養(yǎng)，細胞密度達到了6.8×107細胞/mL，實現(xiàn)了230倍的細胞擴增；Murakami S.和Chiou T.W.［35］還對剪切力、營養(yǎng)成分和氧氣傳輸和消耗進行了模擬計算和理論放大研究，初步驗證此類生物反應(yīng)器具備從10L放大到67 000L的潛力。

王義翹教授團隊在微生物和酵母發(fā)酵生產(chǎn)工藝研究［36-42］、在線自動檢測和控制［43-46］等方面的早期研發(fā)也為動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)工藝開發(fā)、生物反應(yīng)器設(shè)計和工藝放大起到了重要的借鑒作用［47］。

2 動物細胞培養(yǎng)過程中有毒副產(chǎn)物的代謝調(diào)控研究

氨和乳酸是動物細胞培養(yǎng)過程中的兩個主要代謝副產(chǎn)物。20 世紀80 年代末至90 年代初，氨和乳酸對動物細胞的生長、代謝和蛋白質(zhì)糖基化修飾的影響已進行了全面、系統(tǒng)的研究［48-54］。在2～4 mmol/L 的氨濃度下，大多數(shù)細胞系的生長速度和產(chǎn)品表達水平?jīng)]有顯著影響，但是更高濃度的氨可導(dǎo)致嚴重的細胞生長抑制和細胞死亡。乳酸在細胞培養(yǎng)過程的積累同樣對細胞生長和代謝不利，一方面會導(dǎo)致pH 的下降和滲透壓的升高，同時還可能抑制葡萄糖的能量代謝。因此，控制氨和乳酸的產(chǎn)生和積累是實現(xiàn)高密度細胞培養(yǎng)、提高蛋白質(zhì)生產(chǎn)的關(guān)鍵手段［55-56］。

王義翹教授實驗室研究了多重創(chuàng)新策略進行細胞代謝副產(chǎn)物的調(diào)控，他的博士生Chang D.Y.S.（張幼翔）利用氨和乳酸在培養(yǎng)環(huán)境中分別帶正電和負電荷的特性，創(chuàng)造性地采用電場移除氨和乳酸的策略，有效控制了氨和乳酸在細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中的濃度，并通過在培養(yǎng)基中加入過量氨基酸和葡萄糖進行細胞培養(yǎng)，將細胞密度從3.7×106細胞/mL 提高到9.1×106細胞/mL，抗體產(chǎn)量從170 mg/L提高到505 mg/L［57-58］。

細胞培養(yǎng)用商業(yè)化基礎(chǔ)培養(yǎng)基（如IMEM、DMEM）中氨基酸和葡萄糖濃度過高，細胞的新陳代謝效率較低并導(dǎo)致大量有毒副產(chǎn)物的產(chǎn)生和積累。研究表明，氨的產(chǎn)生主要來源于谷氨酰胺，其他氨基酸也能進入TCA 循環(huán)代謝并產(chǎn)生氨［59-66］。氨的產(chǎn)生速率與谷氨酰胺濃度相關(guān)性較高，當(dāng)谷氨酰胺濃度從商業(yè)化基礎(chǔ)培養(yǎng)基中4～6 mmol/L 的濃度下調(diào)到0.5 mmol/L 時，大多數(shù)細胞的生長速率并不會受到影響，但非必需的谷氨酰胺代謝和降解會大幅下降，氨的產(chǎn)生速率也因此會大幅下降［67-70］。同理，葡萄糖代謝是乳酸的主要來源，控制葡萄糖到一個不影響細胞生長速率的較低濃度（如2～5 mmol/L）可有效降低乳酸的產(chǎn)生［71-77］。一些早期研究采用經(jīng)典的補料技術(shù)或連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)控制谷氨酰胺或葡萄糖濃度和代謝，獲得了一些積極結(jié)果，為20 世紀90 年代的流加工藝研發(fā)奠定了概念驗證的基礎(chǔ)，但單變量控制的效果往往有限［52，55-56，67，73，75-77］，主要是因為氨基酸（不僅僅是谷氨酰胺）和葡萄糖的代謝網(wǎng)絡(luò)是交織在一起的，具有一定的互補性和替代性。因此，控制細胞生長所需的整個營養(yǎng)環(huán)境（包含數(shù)十種必需的關(guān)鍵成分），同時解決氨和乳酸積累導(dǎo)致的細胞生長抑制問題和營養(yǎng)成分消耗補充問題，才可能大幅度提高細胞密度和產(chǎn)品產(chǎn)量。

本文作者在王教授的指導(dǎo)下，通過系統(tǒng)研究細胞新陳代謝網(wǎng)絡(luò)，解析出合成一個細胞所需各類營養(yǎng)成分的最低值，采用化學(xué)計量平衡的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和加料液控制生物反應(yīng)器中各營養(yǎng)成分（主要是氨基酸和葡萄糖）的濃度和細胞代謝，以達到調(diào)控和優(yōu)化細胞新陳代謝、降低氨和乳酸產(chǎn)生速率和積累、提高細胞密度、延長細胞生長時間、優(yōu)化目標(biāo)蛋白和抗體產(chǎn)量的目的。實驗結(jié)果顯示，與標(biāo)準(zhǔn)批次培養(yǎng)對比，通過化學(xué)計量平衡的加料，使細胞生長所需的氨基酸和葡萄糖濃度在流加培養(yǎng)全過程中均控制在較低但相對穩(wěn)定的水平，在保證細胞生長速率的前提下，乳酸的產(chǎn)生速率從批次培養(yǎng)0.3 pmole/（cell·h）降低到0.0036 pmole/（cell·h），氨的產(chǎn)生速率從0.016 pmole/（cell·h）降低到0.0028 pmole/（cell·h）［78-80］。

由于乳酸的產(chǎn)生是一個涉及LDH 酶的催化反應(yīng)，王教授實驗室團隊人員（陳克勤博士，劉謙研究員和筆者）在20 世紀90 年代初期開創(chuàng)性地嘗試通過基因工程改造的技術(shù)建立一個LDH-A 基因敲除的細胞系，以達到降低或消除乳酸副產(chǎn)物的目的，但受限于當(dāng)時的技術(shù)，僅獲得了一個單拷貝LDH-A 基因敲除的細胞克隆。批次細胞培養(yǎng)試驗結(jié)果顯示，單拷貝LDH-A 基因敲除細胞的乳酸產(chǎn)生速率比未改造的母細胞降低了50%，最高細胞密度提高了30%，抗體產(chǎn)量提高了3 倍［81］。該技術(shù)驗證了通過基因工程改造的方式控制細胞新陳代謝、提高營養(yǎng)成分的代謝效率，降低有毒副產(chǎn)物的新方法。由于劉謙研究員回國后忙于政務(wù)，研究結(jié)果直到2001年才最終發(fā)表［81］。

3 動物細胞培養(yǎng)過程中新陳代謝網(wǎng)絡(luò)分析研究和化學(xué)計量模型解析

由于細胞生長需要消耗大量營養(yǎng)物質(zhì)，盡管較低的氨基酸和葡萄糖濃度可以降低氨和乳酸的產(chǎn)生，但不足以支撐細胞的持續(xù)生長。因此，需要在培養(yǎng)過程中持續(xù)添加細胞生長所消耗的多種氨基酸、葡萄糖和維生素等營養(yǎng)成分。數(shù)十種營養(yǎng)成分的配比以及加料速率控制是開發(fā)高密度培養(yǎng)和高產(chǎn)量生產(chǎn)工藝的關(guān)鍵，因為只要有一種關(guān)鍵營養(yǎng)成分添加量不足，就可能導(dǎo)致該營養(yǎng)成分成為細胞生長的限制因素，并引起其他營養(yǎng)成分和有毒副產(chǎn)物在反應(yīng)器中積累。

在20 世紀90 年代初期，大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)剛剛被嘗試應(yīng)用于生物藥的商業(yè)化生產(chǎn)。由于細胞新陳代謝涉及成千上萬的生物化學(xué)反應(yīng)，涉及數(shù)十種營養(yǎng)成分和成千上萬的生物學(xué)物質(zhì)，如構(gòu)成細胞的各種蛋白質(zhì)（膜蛋白、酶、結(jié)構(gòu)蛋白等）、脂肪、碳水化合物、DNA、RNA等，以及各種各樣的中間產(chǎn)物和副產(chǎn)物。因此，細胞新陳代謝網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性和多樣性導(dǎo)致理論上存在無數(shù)種可能的代謝方式和結(jié)果，即細胞的生長方式不是唯一的，而是多變的。舉例來說，細胞既可以將葡萄糖代謝成乳酸，產(chǎn)生2個ATP，也可以在TCA循環(huán)中氧化成CO2和水，產(chǎn)生30～38 個ATP。在每次細胞培養(yǎng)過程中，轉(zhuǎn)化成乳酸和進入TCA 循環(huán)的葡萄糖比例并不是固定的。很顯然，細胞的新陳代謝效率也是動態(tài)變化的。因此，在90 年代初期以前，細胞培養(yǎng)過程被認為是一個不可解的“黑箱”。細胞培養(yǎng)實驗優(yōu)化主要憑經(jīng)驗，根據(jù)檢測主要營養(yǎng)成分消耗情況、細胞生長情況和蛋白質(zhì)產(chǎn)品表達量，得出一些經(jīng)驗結(jié)果進行試錯式的迭代優(yōu)化。加料液的配比也通常是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基（如DMEM、IMEM 等）的基礎(chǔ)上進行濃縮。采用濃縮加料液的流加工藝可以有效解決關(guān)鍵營養(yǎng)成分在批次培養(yǎng)后期被耗盡所導(dǎo)致的細胞生長停滯和死亡的問題，取得了比批次培養(yǎng)更好的結(jié)果，但單克隆抗體產(chǎn)量仍一直處于幾十毫克/升至幾百毫克/升的水平［58，82-88］。

本文作者試圖通過系統(tǒng)分析復(fù)雜的細胞新陳代謝反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，梳理出營養(yǎng)物質(zhì)成分與細胞構(gòu)成成分以及能量代謝的對應(yīng)關(guān)系，進而建立主導(dǎo)細胞合成的化學(xué)計量反應(yīng)方程式［89］。這是一項前所未有的高挑戰(zhàn)性任務(wù)。并結(jié)合自身的生物化學(xué)、細胞生物學(xué)、化學(xué)工程，系統(tǒng)工程和計算機編程等方面的知識和經(jīng)驗，對新陳代謝反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)涉及的生化反應(yīng)按細胞內(nèi)的物質(zhì)類別進行歸類和簡化。例如，無論涉及的生化反應(yīng)如何復(fù)雜和多樣，細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)總量及其氨基酸成分是基本穩(wěn)定的，而且可以準(zhǔn)確測定，因此，根據(jù)物質(zhì)守恒的原理，合成細胞內(nèi)所有蛋白質(zhì)所需的各類氨基酸是可以確定的。相對而言，細胞的能量代謝則更為復(fù)雜，一方面是細胞生長所需的能量既包括合成細胞所需的能量，還包括細胞生長停滯狀況下的基本消耗，即維持需求；另一方面，涉及細胞能量代謝的化學(xué)成分既包括葡萄糖，還包括多種氨基酸，而且這些營養(yǎng)成分在一定程度上具有相互替代功能［61，66，90-92］。舉例來說，當(dāng)葡萄糖濃度太低時，谷氨酰胺和其他氨基酸的消耗速率會大幅提升，成為葡萄糖能量代謝的主要代償。

盡管細胞生長的化學(xué)計量模型沒有唯一解，但理論上只有一個最優(yōu)解，即當(dāng)所有的細胞新陳代謝反應(yīng)均以最高效率和最佳方案進行時，細胞生長所消耗的各種營養(yǎng)成分達到最低、產(chǎn)生的氨和乳酸副產(chǎn)物達到最低。根據(jù)物質(zhì)守恒和能量守恒的原理，即可以解析出一個最佳的理想化的細胞生長化學(xué)計量模型。在實際應(yīng)用中，理想化的化學(xué)計量關(guān)系是無法實現(xiàn)的，因為細胞的能量代謝無法達到最優(yōu)，因此，需要對限制條件進行適度放寬，即允許細胞在代謝過程中采用一些非最佳的替代方式，如產(chǎn)生一定量的乳酸和氨，從而使化學(xué)計量模型變得可行和具有實際應(yīng)用價值［78-80］。

4 化學(xué)計量平衡控制的動物細胞高密度流加培養(yǎng)工藝開發(fā)

根據(jù)已建立的動物細胞生長化學(xué)計量模型中解析出的各營養(yǎng)物質(zhì)的化學(xué)計量系數(shù)比，就可以參照一個普通化學(xué)反應(yīng)的控制原理設(shè)計并配制出化學(xué)計量平衡的細胞培養(yǎng)基和加料液。理論上，如果化學(xué)計量模型準(zhǔn)確預(yù)測了細胞在培養(yǎng)過程中的新陳代謝，則各營養(yǎng)物質(zhì)的消耗速率是均衡的，即不會出現(xiàn)某些營養(yǎng)成分被消耗盡而另一些成分大量積累的問題，也就是說可以通過一個包含幾十種營養(yǎng)物質(zhì)的加料液來控制細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中所有關(guān)鍵營養(yǎng)成分的濃度使其維持在一個最優(yōu)水平。這是以前不敢想象的目標(biāo)。

1992 年，本文作者對前文描述的化學(xué)計量模型進行了解析，采用可收集的文獻數(shù)據(jù)對細胞的主要成分進行了估算：細胞干重為0.36 ng/細胞，其中各主要成分占比分別為：蛋白質(zhì)37.5%，DNA 2.5%，RNA 6.9%，脂類20%，碳水化合物25%。此外，利用文獻報道的207 個蛋白質(zhì)氨基酸組成，計算出一個平均的氨基酸摩爾分數(shù)用于化學(xué)計量模型的解析。具體為：Ala 9.0%；Arg 4.7%；Asn 4.4%；Asp 5.5%；Cys 2.8%；Glu 6.2%；Gln 3.9%；Gly 7.5%；His 2.1%；Ile 4.6%；Leu 7.5%；Lys 7.0%；Met 1.7%；Phe 3.5%；Pro 4.6%；Ser 7.1%；Thr 6.0%；Trp 1.1%；Tyr 3.5%；Val 6.9%。根據(jù)解析出的各營養(yǎng)成分的化學(xué)計量系數(shù)，設(shè)計了第一代的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和加料液配方，并在T 形培養(yǎng)瓶內(nèi)進行了兩輪流加培養(yǎng)試驗驗證。批次培養(yǎng)中，各種營養(yǎng)物質(zhì)隨著細胞生長而快速被消耗，其濃度不斷下降；而在化學(xué)計量控制的流加培養(yǎng)中，葡萄糖和氨基酸的起始濃度就處于一個較低但足以維持細胞生長的濃度，培養(yǎng)過程加入的加料液對細胞生長過程中所消耗的營養(yǎng)物質(zhì)進行了有效的補充，因此大多數(shù)營養(yǎng)物質(zhì)的濃度維持在一個相對穩(wěn)定的水平，部分成分的濃度還有一定的升高［93］。與批次培養(yǎng)對比，氨和乳酸的產(chǎn)生速率得到了大幅度（26倍和50倍）的降低。由于氨和乳酸的積累得到非常有效的控制，階段性的加料確保了關(guān)鍵必需營養(yǎng)成分的補充和維持在細胞生長所必需的最低濃度以上，細胞密度得到了大幅度的提升，而且培養(yǎng)時間從批次培養(yǎng)的150 h 延長到了流加培養(yǎng)的300 h 以上。因此，抗體的產(chǎn)量從50 mg/L 首次提高到了550 mg/L。該研究結(jié)果于1994 年初在生物工程權(quán)威刊物Biotechnology &Bioengineering上發(fā)表［93］。細胞生長的化學(xué)計量模型在流加培養(yǎng)中實現(xiàn)跨越式突破的應(yīng)用價值首次得到了初步認可。

此后，根據(jù)首次試驗獲得的數(shù)據(jù)和經(jīng)驗對化學(xué)計量模型進行了校正和優(yōu)化，并對細胞的主要成分進行了實測。結(jié)果顯示，細胞干重為0.25 ng/細胞，其中各主要成分占比分別為，蛋白質(zhì)72.9%，DNA 1.4%，RNA 3.8%，脂類13.5%，碳水化合物3.5%，與首次計算采用的文獻數(shù)據(jù)偏差較大。細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的氨基酸摩爾分數(shù)實測數(shù)據(jù)為：Ala 8.25%；Arg 5.93%；Asn 4.4%；Asp 4.69%；Cys 2.8%；Gln 6.2%；Glu 4.96%；Gly 8.54%；His 2.16%；Ile 4.22%；Leu 8.11%；Lys 6.79%；Met 2.17%；Phe 3.19%；Pro 5.26%；Ser 6.89%；Thr 5.73%；Trp 1.1%；Tyr 2.59%；Val 6.02%。實測的氨基酸比例與首次采用的平均值也有一些偏差，但整體符合性較好，對模型計算結(jié)果的影響不大。

根據(jù)優(yōu)化的模型和細胞株的實測組成數(shù)據(jù)解析出的化學(xué)計量系數(shù)進行了第二輪的培養(yǎng)基設(shè)計，并在自動控制的2L 生物反應(yīng)器中進行了第二輪驗證和優(yōu)化實驗。在本輪實驗中，加料液的添加是由計算機控制自動連續(xù)進行的，因此避免了間歇式手動加料造成的瞬時濃度刺突式的增加。溶氧和pH 值也得到了控制并維持穩(wěn)定，從而避免了首輪試驗中T 形培養(yǎng)瓶中溶氧限制和pH 下降產(chǎn)生的局限性。

結(jié)果顯示，乳酸的產(chǎn)生速率比批次培養(yǎng)降低了62 倍，比首輪采用化學(xué)計量模型控制的T 形培養(yǎng)瓶流加培養(yǎng)實驗進一步降低了8倍；抗體產(chǎn)量比批次培養(yǎng)提高了17 倍，達到900 mg/L，此為當(dāng)時文獻報道最高水平。在350 h 以上的培養(yǎng)中，總細胞密度達到了2.2×107細胞/mL，最高活細胞密度達到了6.3×106細胞/mL，而乳酸的峰值濃度僅為11 mmol/L，氨的峰值濃度僅為6 mmol/L 左右。葡萄糖和谷氨酰胺的濃度在培養(yǎng)全過程中均得到了良好控制［94］，再次驗證了化學(xué)計量模型對動物細胞流加培養(yǎng)工藝優(yōu)化和控制的巨大價值。

通過化學(xué)計量模型解決了關(guān)鍵營養(yǎng)成分在培養(yǎng)過程中被耗盡或大量積累的問題，同時還大幅度降低了有毒副產(chǎn)物乳酸和氨的產(chǎn)生速率，避免了氨和乳酸積累到抑制細胞生長或?qū)е录毎劳龅臐舛取Ｈ欢?，在嚴格控制的細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中，當(dāng)活細胞密度達到（5～10）×106細胞/mL 水平時，盡管總細胞密度繼續(xù)增加，但活細胞密度不再增加，導(dǎo)致培養(yǎng)后期的細胞活率下降，很可能是還有一些細胞生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì)未能通過化學(xué)計量模型得到有效控制。

因此，又對流加培養(yǎng)工藝過程和控制進行了進一步的優(yōu)化：①通過離線細胞計數(shù)，每12 h 對細胞生長速率和加料速率進行校正；②通過分析認為，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的磷將可能在培養(yǎng)后期被耗盡，進而影響細胞的能量代謝和磷脂合成，因此，對磷的化學(xué)計量系數(shù)進行了測算并應(yīng)用到加料液配方設(shè)計中；③在培養(yǎng)中期添加了血清和金屬離子（Li+，Zn2+，Cu2+等）。由于上述優(yōu)化改進，流加培養(yǎng)時間進一步延長到550 h，最高活細胞密度達到1.7×107細胞/mL（圖2），總細胞密度達到5×107細胞/mL。細胞培養(yǎng)反應(yīng)器從外觀上觀察已成肉色。在未采取細胞截留措施的流加培養(yǎng)中能達到如此高的細胞密度是前所未有的，因此，抗體產(chǎn)量也達到了前所未有的2400 mg/L（圖3），比批次培養(yǎng)提高了45 倍［79］。上述結(jié)果是基于化學(xué)計量平衡的培養(yǎng)基設(shè)計和加料速率控制，關(guān)鍵營養(yǎng)成分維持在一個較優(yōu)且基本恒定的水平而實現(xiàn)的。如圖4 和圖5 所示，與批次培養(yǎng)中葡萄糖和谷氨酰胺濃度由于細胞代謝的消耗而隨培養(yǎng)時間延長而快速下降不同，在化學(xué)計量平衡和控制的流加培養(yǎng)中，葡萄糖和谷氨酰胺濃度在全培養(yǎng)過程中均被控制在一個較低且相對穩(wěn)定的濃度范圍，既避免了濃度過高而導(dǎo)致的低效率代謝和有毒副產(chǎn)物的過度積累，又避免了因必要營養(yǎng)物質(zhì)的耗盡而導(dǎo)致的細胞生長停滯和死亡。因此，由于細胞生長營養(yǎng)環(huán)境得到了有效的控制，細胞的新陳代謝效率得到大幅度提升，副產(chǎn)物的產(chǎn)生速率大幅度下降（圖6）。僅有3.4%的葡萄糖被轉(zhuǎn)化為乳酸，其余均被用于細胞成分的合成和更高效的TCA 循環(huán)能量代謝，而在批次培養(yǎng)對照中，有67%的葡萄糖被轉(zhuǎn)化成乳酸，既導(dǎo)致葡萄糖的低效利用，又導(dǎo)致乳酸副產(chǎn)物的積累。

圖2 化學(xué)計量平衡和加料控制的流加培養(yǎng)工藝中活細胞密度與批次培養(yǎng)對比Fig.2 Comparison of the viable cell density in the perfusion culture developed on stoichiometric balance and feed control to that observed in the batch process

圖3 化學(xué)計量平衡和加料控制的流加培養(yǎng)工藝中抗體產(chǎn)量與批次培養(yǎng)對比Fig.3 Comparison of the antibody yield in the perfusion culture developed on stoichiometric balance and feed control with that of the batch process

圖4 化學(xué)計量平衡和加料控制的流加培養(yǎng)工藝中葡萄糖控制情況與批次培養(yǎng)對比Fig.4 Comparison of the glucose control index of the perfusion culture developed on stoichiometric balance and feed control with that of the batch process

圖5 化學(xué)計量平衡和加料控制的流加培養(yǎng)工藝中谷氨酰胺控制情況與批次培養(yǎng)對比Fig.5 Comparison of the glutamine control for the perfusion culture developed on stoichiometric balance and feed control with that of the batch process

圖6 化學(xué)計量平衡和加料控制的流加培養(yǎng)工藝中副產(chǎn)物乳酸和氨產(chǎn)生速率與批次培養(yǎng)對比Fig.6 Comparison of the byproduct lactic acid and ammonia production for the perfusion developed on stoichiometric balance and feed control with those of the batch process

為驗證化學(xué)計量模型的通用性，還針對表達γ-干擾素蛋白的CHO 細胞無血清培養(yǎng)流加工藝進行了初步優(yōu)化。采用間歇式的手動加料方式，在T 形培養(yǎng)瓶培養(yǎng)實驗中，化學(xué)計量平衡的培養(yǎng)基設(shè)計和加料同樣可以將葡萄糖和氨基酸濃度控制在一個相對穩(wěn)定的水平。與批次對照培養(yǎng)比較，活細胞密度提高2 倍以上，γ-干擾素蛋白產(chǎn)量從7.6 mg/L 提高到30 mg/L 的水平［95］。

2000 年，王義翹教授的學(xué)生邱紫文博士畢業(yè)后回臺灣任教，將動物細胞的化學(xué)計量模型完整地應(yīng)用到昆蟲細胞流加培養(yǎng)中并得到了良好的結(jié)果［96］。與經(jīng)典的流加培養(yǎng)工藝對比，采用化學(xué)計量模型平衡和控制的昆蟲細胞流加培養(yǎng)工藝，SF21 細胞密度提高了3 倍，達到1.7×107細胞/mL，白介素5 蛋白表達量也得到了大幅度提高。盡管昆蟲細胞培養(yǎng)與哺乳動物細胞培養(yǎng)有較大的不同，然而物質(zhì)守恒和能量守恒的定律不變，細胞的新陳代謝化學(xué)反應(yīng)原理不變，因此動物細胞的化學(xué)計量模型和昆蟲細胞基本一致，只是細胞的成分有差別，細胞的副產(chǎn)物產(chǎn)生速率有差別，維持細胞生長速率所需的各種關(guān)鍵營養(yǎng)物質(zhì)最佳濃度有差別。該研究進一步驗證了化學(xué)計量模型在優(yōu)化流加細胞培養(yǎng)工藝中的廣泛應(yīng)用價值。

根據(jù)多輪化學(xué)計量平衡和控制的流加細胞培養(yǎng)實驗所測定的細胞生長，各營養(yǎng)成分的加入量、消耗量、副產(chǎn)物的產(chǎn)生以及目標(biāo)抗體的合成等實驗結(jié)果，采用化學(xué)劑量模型中涉及的化學(xué)反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，本文作者對各種營養(yǎng)成分的實際代謝路徑和效率進行了系統(tǒng)分析［97］，還對細胞的整個能量代謝網(wǎng)絡(luò)進行了解析［98］。上述分析對動物細胞探索在不同的營養(yǎng)環(huán)境下的新陳代謝規(guī)律提供了重要的數(shù)據(jù)，為后續(xù)進一步修正和優(yōu)化化學(xué)計量模型以及流加工藝提供了很多重要的線索和實驗依據(jù)。

在詳細發(fā)表上述模型、培養(yǎng)基配方、流加策略以及多輪實驗結(jié)果后，該研究在學(xué)術(shù)界和工業(yè)界產(chǎn)生了強烈反響。應(yīng)工業(yè)界的要求，筆者在王教授實驗室從事博士論文研究的最后一年，指導(dǎo)碩士研究生共同完成了動物細胞化學(xué)計量模型通用軟件的開發(fā)。此后，該軟件系統(tǒng)被廣泛免費提供給加入MIT 生物技術(shù)工程中心生物制藥工業(yè)聯(lián)盟的制藥企業(yè)會員并被應(yīng)用于支持其商業(yè)化產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝開發(fā)和優(yōu)化。

王義翹教授實驗室自20 世紀70 年代開始開展的細菌發(fā)酵和動物細胞培養(yǎng)相關(guān)研究工作，奠定了90 年代動物細胞培養(yǎng)應(yīng)用于單克隆抗體和重組蛋白藥物商業(yè)化生產(chǎn)工藝的基礎(chǔ)。在抗體藥物產(chǎn)業(yè)化初始階段，王教授實驗室開展的動物細胞高密度培養(yǎng)系列研究對后續(xù)30 年抗體藥物大規(guī)模高效率流加生產(chǎn)工藝的廣泛商業(yè)化應(yīng)用和不斷發(fā)展起到了重要的支撐和推動作用。

5 動物細胞培養(yǎng)過程中大分子蛋白的糖基化修飾多樣性分析和調(diào)控

王義翹教授實驗室不僅在動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)工藝開發(fā)和優(yōu)化上做出奠基性貢獻，還在20 世紀90 年代初期就開始對重組蛋白藥物的糖基化修飾多樣性進行了比較系統(tǒng)的研究。單克隆抗體和γ-干擾素等蛋白質(zhì)藥物的糖基化存在2 個維度的多樣化：一是糖基化位點的糖基化修飾多樣化，即宏觀多樣性（macroheterogeneity），如有些位點的糖基化修飾比例很高，而有些位點的糖基化修飾比例可能較低，且隨培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時間動態(tài)變化；二是蛋白上的糖鏈結(jié)構(gòu)存在多樣性，即微觀多樣性（microheterogeneity）。糖鏈結(jié)構(gòu)對蛋白質(zhì)的性質(zhì)、穩(wěn)定性、代謝、生物學(xué)功能都可能有重要意義。舉例來說，抗體藥物的糖基化位點位于抗體的重鏈恒定區(qū)，糖鏈參與和影響抗體與免疫細胞上的Fc 受體（CD16a，CD16b，CD32a，CD32b，CD64）和FcRn分子的結(jié)合，對抗體的藥代動力學(xué)、Fc功能（如ADCC、CDC、ADCP生物活性）均可能有重要影響［99-104］。

王教授的學(xué)生Harmon B.博士在20世紀90年代初期開始探索基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI/TOF mass spectrometry）技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)糖基化多樣性的快速分析和監(jiān)測［105］，建立了高靈敏度2 h 快速分析蛋白質(zhì)各糖基化位點糖鏈結(jié)構(gòu)多樣性的技術(shù)，為實時動態(tài)研究和檢測細胞培養(yǎng)環(huán)境、過程參數(shù)對蛋白質(zhì)和抗體藥物糖基化多樣性變化，控制大分子生物藥糖基化關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)提供了重要的手段。在此基礎(chǔ)上，王教授的博士生顧學(xué)軍對CHO 細胞表達γ-干擾素蛋白糖基化及唾液酸修飾情況進行了分析，研究了無血清培養(yǎng)過程中添加蛋白水解物對CHO 細胞代謝及γ-干擾素蛋白唾液酸修飾程度的影響，并成功通過添加N-乙?；事短前罚∟-acetylmannosamine）對唾液酸修飾進行優(yōu)化，以達到提高唾液酸修飾比例的目的［106-110］。利用CHO 細胞連續(xù)培養(yǎng)可以實現(xiàn)細胞培養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)態(tài)控制的特點，王教授的博士生Nyberg G.和Balcarcel R.與Harmon B.合作，系統(tǒng)研究了細胞培養(yǎng)環(huán)境和代謝中間產(chǎn)物對γ-干擾素蛋白糖基化修飾程度的影響［110-111］，為控制蛋白質(zhì)藥物糖基化特性提供了重要的線索。

6 動物細胞培養(yǎng)過程中剪切力對細胞生長和活率的影響研究

動物細胞在攪拌式生物反應(yīng)器中高密度懸浮大規(guī)模培養(yǎng)已經(jīng)成為重組蛋白藥物、單克隆抗體藥物和基因工程疫苗類產(chǎn)品的主流生產(chǎn)技術(shù)。由于需要連續(xù)不斷地將空氣中的氧氣傳遞到液體培養(yǎng)基中的細胞，并將細胞新陳代謝產(chǎn)生的二氧化碳移除出生物反應(yīng)器，機械攪拌和空氣鼓泡是大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)的必要手段，也是工藝放大的關(guān)鍵和難點。這是因為動物細胞沒有細胞壁的保護，細胞膜對剪切力很敏感，在細胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器中無法耐受高速攪拌和鼓泡所產(chǎn)生的剪切力。

王義翹教授早在20 世紀60 年代末就開始研究流體力學(xué)對動物細胞死亡的影響。為了模擬細胞在攪拌式生物反應(yīng)器中所經(jīng)受的剪切力并能準(zhǔn)確計算剪切力，Augenstein D.C.設(shè)計了一個毛細管裝置讓動物細胞在含10%牛血清的培養(yǎng)基懸浮液中多次通過毛細管并測定細胞死亡率，建立了細胞死亡速率與剪切力的關(guān)聯(lián)關(guān)系，為細胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器的設(shè)計、培養(yǎng)工藝放大以及生物反應(yīng)器的控制提供了基礎(chǔ)性的依據(jù)［112］。原代細胞的微載體貼壁培養(yǎng)所用的微載體直徑遠大于單個動物細胞的直徑，因此，貼附在微載體上的動物細胞對攪拌所產(chǎn)生的剪切力更敏感，容易導(dǎo)致細胞脫落后死亡。王教授的博士生Croughan 在80 年代對FS-4 細胞微載體培養(yǎng)攪拌式生物反應(yīng)器中的流體力學(xué)和湍流所產(chǎn)生的剪切力進行了系統(tǒng)模擬分析和計算，系統(tǒng)研究了攪拌速度對細胞的生長和死亡速率的影響［27，113］，以及培養(yǎng)液黏度對減輕湍流所產(chǎn)生的剪切力和細胞損傷的影響［31］。90 年代，王教授的博士生Orton 和Meier 先后對細胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器中空氣鼓泡導(dǎo)致的損傷和死亡進行了全面系統(tǒng)的研究［114-116］。Orton采用熒光示蹤法全程記錄了氣泡從液體中上升并浮出水面破裂過程中細胞死亡的情況，發(fā)現(xiàn)細胞死亡主要發(fā)生在氣泡破裂的瞬間。模擬計算顯示，氣泡破裂時可產(chǎn)生巨大的剪切力并足以撕裂細胞。她還比較了不同濃度的多種表面活性劑，如PF68，對降低空氣鼓泡導(dǎo)致的細胞死亡作用的影響。Meier 在此基礎(chǔ)上，進一步研究了PF68 等高分子表面活性劑分別對氣泡在上升階段和破裂時細胞死亡的影響［115-116］。

本文作者在默克公司工作期間帶領(lǐng)學(xué)生對不同表面活性劑PF68 濃度對細胞吸附、死亡的影響首次進行了準(zhǔn)確測定［117］。結(jié)果顯示，在PF68低濃度情況下，細胞被大量富集到氣泡表面，氣泡層的細胞密度可以達到反應(yīng)器中細胞密度的10 倍。當(dāng)PF68濃度提高到1 g/L 時，氣泡層的細胞密度僅為反應(yīng)器中細胞密度的一半左右。因此，在無血清培養(yǎng)基中添加PF68 等高分子表面活性劑對細胞的保護作用主要是降低氣泡對細胞吸附并在氣泡層的富集作用。

7 細胞培養(yǎng)技術(shù)的未來方向和應(yīng)用前景

王義翹教授團隊在20 世紀90 年代及以前針對動物細胞培養(yǎng)技術(shù)開展的奠基性研發(fā)，推動了90 年代至今全球生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，高密度動物細胞流加培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)成為單克隆抗體規(guī)?；a(chǎn)的主流技術(shù)。在此基礎(chǔ)上，過去30 年，生物藥產(chǎn)業(yè)化技術(shù)在三個方面取得了重要進展：①分子生物學(xué)技術(shù)的進步持續(xù)推動目標(biāo)蛋白表達載體的不斷優(yōu)化，穩(wěn)定高產(chǎn)細胞株獲取成為可能；②高通量細胞克隆篩選技術(shù)（如流式細胞分選儀和ClonePix 細胞克隆系統(tǒng)）的推廣應(yīng)用，使細胞株的表達水平不斷提高；③通過對特定單克隆細胞株的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化，以流加培養(yǎng)方式，活細胞密度達到107細胞/mL 已成為常態(tài)，因此，單克隆抗體產(chǎn)量已普遍超過3 g/L。

由于單克隆抗體藥物的臨床應(yīng)用價值得到廣泛驗證，臨床需求大的品種往往需要采用10 000 L 以上規(guī)模的生物反應(yīng)器進行商業(yè)化生產(chǎn)。國際主流生物制藥企業(yè)大多建成了12 000 L、15 000 L 細胞培養(yǎng)規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)線。盡管理論上反應(yīng)器規(guī)?？梢赃M一步提高，但隨著培養(yǎng)規(guī)模的擴大，下游純化成本成為主要瓶頸，因此進一步放大細胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器的風(fēng)險收益比不再具有吸引力。近年來，采用設(shè)備投資小、建設(shè)周期短、車間GMP 認證快、不要對固定式生物反應(yīng)器進行清洗和消毒的一次性生物反應(yīng)器（如2000 L）開展產(chǎn)業(yè)化，得到了中小型生物技術(shù)企業(yè)的青睞，尤其是在我國得到了快速推廣和應(yīng)用，對我國生物制藥領(lǐng)域的高速發(fā)展起到了重要的推動作用。

可以預(yù)見，隨著重組蛋白藥物、單克隆抗體藥物、雙特異性抗體藥物、抗體藥物偶聯(lián)物（ADC）、CAR-T 細胞治療、重組蛋白疫苗、病毒樣顆粒疫苗等生物藥的開發(fā)和商業(yè)化，細胞培養(yǎng)技術(shù)（動物細胞、T 細胞、昆蟲細胞培養(yǎng)）將得到越來越多的應(yīng)用，推動生物產(chǎn)品的不斷發(fā)展和進步。王義翹教授團隊數(shù)十年前奠定的基礎(chǔ)仍將不斷發(fā)揮重要作用。

8 總結(jié)

王義翹教授自20 世紀60 年代開始，以其前瞻性的洞察力和深厚的工程學(xué)背景，對哺乳動物細胞培養(yǎng)技術(shù)進行了數(shù)十年全面系統(tǒng)的研究和優(yōu)化，尤其是在80 年代中期，領(lǐng)導(dǎo)組建了美國唯一的生物工程技術(shù)中心（BPEC），匯集了MIT 化工系、生物系以及世界各地不同領(lǐng)域的教授專家進行交叉學(xué)科的研究和探索，為90 年代開始的全球重組蛋白、單克隆抗體和基因工程疫苗等生物技術(shù)產(chǎn)品的蓬勃發(fā)展奠定了堅實的理論和工程基礎(chǔ)，做出了不可磨滅的偉大貢獻。本文限于作者自身的專業(yè)知識和在王義翹教授實驗室的短暫經(jīng)歷，僅對王教授在動物細胞培養(yǎng)及相關(guān)領(lǐng)域的奠基性工作進行了粗淺的概述。王教授培養(yǎng)的學(xué)生遍布世界各國主流的生物制藥企業(yè)并成為推動生物工程技術(shù)不斷發(fā)展的核心力量，將王義翹教授的思想和品德不斷傳承下去，推動人類健康事業(yè)的不斷發(fā)展。王義翹教授永垂不朽！