林軍華，吳永明，金 梅

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是臨床常見的一種退行性疾病，其主要表現(xiàn)為認(rèn)知障礙及記憶力損害，早期診斷及治療可有效提高病人生活質(zhì)量[1-3]。因而尋找有效生物標(biāo)志物診斷AD具有重要意義。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)在AD中異常表達(dá)，并可能參與AD發(fā)生及發(fā)展過程[4-5]。有研究表明，長鏈非編碼RNA RP11-543N12.1(long non-coding RNA RP11-543N12.1，LncRNA RP11-543N12.1)在AD細(xì)胞模型中表達(dá)上調(diào)，并可能調(diào)控鈣黏蛋白13基因(cadherin 13，CDH13)的表達(dá)從而參與AD發(fā)生及發(fā)展過程[6]。有研究表明，CDH13在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中表達(dá)上調(diào)并可參與神經(jīng)細(xì)胞遷移及血管形成過程[7]。本研究主要探討LncRNA RP11-543N12.1與CDH13在老年AD病人中的表達(dá)及其與血清炎性因子、認(rèn)知功能的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年10月—2019年10月聯(lián)勤保障部隊(duì)廬山康復(fù)療養(yǎng)中心收治的120例AD病人為AD組，所有病人均符合美國國立神經(jīng)病、語言交流障礙和卒中研究所老年性癡呆及相關(guān)疾病學(xué)會(NINCDS-ADRDA)制定的AD相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。AD組120例，男80例，女40例；年齡60～75(68.59±9.65)歲；病程0.5～5.0(2.78±0.65)年。根據(jù)總體衰退量表分為輕度AD組(50例)、中度AD(39例)、重度AD(31例)[9]。所有病人均進(jìn)行簡易精神狀態(tài)量表(MMSE)篩查，根據(jù)MMSE評分將AD病人分為輕度認(rèn)知功能障礙組(60例)、中度認(rèn)知功能障礙組(40例)、重度認(rèn)知功能障礙組(20例)[10]。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并心腦等器官損傷病人；視力、聽力減退病人；合并2型糖尿病病人；自身免疫性疾病病人。選取同期在聯(lián)勤保障部隊(duì)廬山康復(fù)療養(yǎng)中心體檢的健康志愿者70名為對照組，男40名，女30名，年齡60～73(65.32±10.03)歲。AD組與對照組臨床資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究獲得聯(lián)勤保障部隊(duì)廬山康復(fù)療養(yǎng)中心倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 采集血液樣本 采集研究對象空腹肘靜脈血10 mL，置于肝素抗凝管，4 ℃條件下經(jīng)3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，分離血清，置于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存。

1.2.2 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測RP11-543N12.1、CDH13 mRNA的表達(dá)水平 采集Trizol法(美國Invitrogen公司)提取血清中總RNA，應(yīng)用Nanodrop2000c超微量分光光度計(jì)檢測RNA濃度與純度。RP11-543N12.1正向引物5′-TAATGGCTGTGACCTGCGTG-3′，反向引物5′-GTCCTTGGTGCATTTGATTTCTCTG A-3′；CDH13正向引物5′-TCCCTGCAGCATCAAACCAT-3′，反向引物5′-TCGACAAATGGGGACTCACG-3′；U6正向引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT ATTC-3′；GAPDH正向引物5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′，反向引物5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，參照實(shí)時熒光定量qRT-PCR試劑盒配置反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40次循環(huán)。RP11-543N12.1以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，CDH13以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算RP11-543N12.1、CDH13 mRNA的相對表達(dá)量。反轉(zhuǎn)錄試劑盒與實(shí)時熒光定量PCR試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測血清炎性因子水平 采用ELISA檢測血清白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)、白細(xì)胞介素8(interleukin-8，IL-8)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平，檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.2.4 認(rèn)知功能評分 采用Addenbrooke認(rèn)知評估量表第3版(ACE-Ⅲ)、蒙特利爾認(rèn)知評估量表(MoCA)、MMSE評分評估病人認(rèn)知功能[11-12]。

2 結(jié) 果

2.1 各組血清RP11-543N12.1與CDH13 mRNA表達(dá)比較 與對照組比較，AD組血清RP11-543N12.1、CDH13 mRNA的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與輕度AD組比較，中度AD組與重度AD組血清RP11-543N12.1、CDH13 mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與中度AD組比較，重度AD組血清RP11-543N12.1、CDH13 mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組血清RP11-543N12.1與CDH13 mRNA表達(dá)量比較(±s)

2.2 AD組與對照組血清炎性因子水平比較 與對照組比較，AD組血清IL-6、IL-8、TNF-α水平明顯升高(P<0.01)。詳見表2。

表2 AD組與對照組血清炎性因子水平比較(±s)

2.3 AD組與對照組認(rèn)知功能評分比較 與對照組比較，AD組MMSE、ACE-Ⅲ、MoCA評分均明顯降低(P<0.01)。詳見表3。

表3 AD組與對照組認(rèn)知功能評分比較(±s) 單位：分

2.4 不同認(rèn)知功能障礙AD病人血清RP11-543N12.1與CDH13 mRNA表達(dá)量比較 與輕度認(rèn)知功能障礙組比較，中度認(rèn)知功能障礙組與重度認(rèn)知功能障礙組血清RP11-543N12.1、CDH13 mRNA表達(dá)量明顯升高(P<0.05)；與中度認(rèn)知功能障礙組比較，重度認(rèn)知功能障礙組血清RP11-543N12.1、CDH13 mRNA表達(dá)量明顯升高(P<0.05)。詳見表4。

表4 不同認(rèn)知功能障礙AD病人血清RP11-543N12.1與CDH13 mRNA表達(dá)量比較(±s)

2.5 血清RP11-543N12.1、CDH13與血清炎性因子、認(rèn)知功能評分的相關(guān)性分析 采用Pearson法分析血清RP11-543N12.1、CDH13與血清炎性因子、認(rèn)知功能評分的相關(guān)性，結(jié)果顯示，RP11-543N12.1、CDH13與IL-6、IL-8、TNF-α呈正相關(guān)(P<0.05)，RP11-543N12.1與MMSE、ACE-Ⅲ、MoCA評分呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，CDH13與MMSE評分呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。詳見表5。

表5 血清RP11-543N12.1、CDH13與血清炎性因子、認(rèn)知功能評分的相關(guān)性分析

3 討 論

AD的主要病理學(xué)特征為海馬、大腦皮層中突觸與神經(jīng)元呈漸進(jìn)性缺失，其主要發(fā)病機(jī)制為神經(jīng)細(xì)胞外不可溶性的β-淀粉樣蛋白沉積形成老年斑與神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)微管相關(guān)Tau蛋白高度磷酸化聚集、神經(jīng)原纖維纏結(jié)。有研究表明，LncRNA可通過競爭性結(jié)合miRNA而調(diào)控其靶基因表達(dá)，還可與蛋白相結(jié)合從而參與AD發(fā)生及發(fā)展過程[13-15]。但LncRNA在AD病人血清中的表達(dá)及其臨床意義尚未完全闡明。

本研究結(jié)果顯示，AD病人血清RP11-543N12.1與CDH13mRNA的表達(dá)水平明顯升高，隨著疾病嚴(yán)重程度的增加，AD病人血清RP11-543N12.1與CDH13mRNA的表達(dá)水平明顯升高，提示RP11-543N12.1與CDH13mRNA表達(dá)量升高可能參與AD發(fā)生及發(fā)展過程。有研究表明，CDH13在神經(jīng)元識別及相互作用中發(fā)揮重要作用[16]。分析原因可能是RP11-543N12.1水平升高可促進(jìn)CDH13的表達(dá)上調(diào)從而造成AD病人神經(jīng)功能損傷。有研究表明，AD病人腦組織中IL-6、IL-8、TNF-α水平升高，表明AD病人腦組織存在嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)[17]。與上述研究結(jié)果相似，本研究結(jié)果顯示，AD病人血清IL-6、IL-8、TNF-α水平升高，進(jìn)一步研究顯示RP11-543N12.1、CDH13與IL-6、IL-8、TNF-α呈正相關(guān)，提示AD病人出現(xiàn)的神經(jīng)慢性退行性改變與RP11-543N12.1、CDH13表達(dá)量升高有關(guān)，其表達(dá)量升高可能促進(jìn)腦內(nèi)免疫及炎癥反應(yīng)從而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷及細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果顯示，AD組MMSE、ACE-Ⅲ、MoCA評分明顯低于對照組，進(jìn)一步研究顯示RP11-543N12.1與MMSE、ACE-Ⅲ、MoCA評分呈負(fù)相關(guān)，CDH13與MMSE評分呈負(fù)相關(guān)，提示RP11-543N12.1、CDH13表達(dá)量升高與AD病人認(rèn)知功能障礙有關(guān)。同時本研究根據(jù)MMSE評分將AD病人分為輕度認(rèn)知功能障礙組、中度認(rèn)知功能障礙組、重度認(rèn)知功能障礙組，結(jié)果顯示不同認(rèn)知功能障礙病人血清RP11-543N12.1、CDH13表達(dá)量升高，且隨著認(rèn)知功能障礙程度的加重，病人血清RP11-543N12.1、CDH13mRNA表達(dá)量升高，提示RP11-543N12.1、CDH13mRNA表達(dá)量升高可能參與AD病人認(rèn)知功能障礙發(fā)生過程。

綜上所述，RP11-543N12.1與CDH13mRNA在老年AD病人中的表達(dá)量升高，其表達(dá)量與炎性因子、認(rèn)知功能評分密切相關(guān)，并可能作為AD診斷及評估疾病進(jìn)展的重要指標(biāo)，其表達(dá)量升高還可能增加AD病人認(rèn)知功能障礙的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。