雍蘇南，龍遠(yuǎn)雄，藺曉源

高血壓是臨床常見的慢性病和多發(fā)病，血壓水平與心血管風(fēng)險(xiǎn)呈連續(xù)、獨(dú)立、直接的正相關(guān)，將導(dǎo)致腦卒中、冠心病、終末期腎病等，嚴(yán)重威脅人類生命健康[1]。我國(guó)第6次(2012年—2015年)高血壓抽樣調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，18歲及以上居民高血壓患病率粗率為27.9%，標(biāo)化率為23.2%[2]。全球現(xiàn)有高血壓病人超過10億人，預(yù)計(jì)到2025年，高血壓人群可能突破15億人[3]。西藥治療高血壓雖然降壓效果確切，但是多以單純控制血壓為主，長(zhǎng)期使用存在依賴性大、副作用多且經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重等諸多弊端，而中醫(yī)藥在高血壓的防治方面，具有多靶點(diǎn)、多途徑、毒副作用小等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

本課題組前期研究證實(shí)，運(yùn)用具有養(yǎng)陰柔肝、化瘀通絡(luò)功效的復(fù)方七芍降壓片治療高血壓臨床療效確切[4-6]，其中三七、白芍為該方的君藥，對(duì)于復(fù)方七芍降壓片發(fā)揮臨床療效起到至關(guān)重要的作用。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過生物信息學(xué)分析構(gòu)建“化合物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，以期揭示三七、白芍治療高血壓的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，為高血壓的中醫(yī)藥臨床治療提供藥理研究基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 三七、白芍有效化合物及作用靶點(diǎn)獲取 本研究通過中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)平臺(tái)檢索三七、白芍的化學(xué)成分，并以口服吸收利用度(OB)≥30%、藥物相似性(DL)≥0.18為篩選條件，提取各味中藥的主要活性化合物。

1.2 高血壓疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP)通過化合物MOL_ID編號(hào)檢索其作用靶標(biāo)，并通過Uniport數(shù)據(jù)庫(kù)檢索各靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因名；基于GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)，以“hypertension”為關(guān)鍵詞檢索相關(guān)基因，并與藥物活性化合物靶點(diǎn)取交集，得到三七、白芍治療高血壓的相關(guān)作用靶點(diǎn)。

1.3 “有效化合物-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 將三七、白芍活性化合物及其作用于高血壓的相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件中，并利用“Network Analyzer”功能對(duì)中藥化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，根據(jù)化合物與靶點(diǎn)連接情況篩選出三七-白芍治療高血壓的關(guān)鍵化合物。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選 將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中，并限定研究物種為人類，得到三七、白芍作用于高血壓的PPI網(wǎng)絡(luò)。借助Cytoscape 3.7.1軟件中的“Network Analyzer”對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，選取自由度(degree)、介數(shù)(betweenness)和中心性(closeness)都大于平均值的靶點(diǎn)為關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 基因本體(GO)功能富集分析與京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路分析 為進(jìn)一步了解核心靶點(diǎn)基因功能和三七、白芍治療高血壓的主要作用通路，將藥物與疾病相關(guān)靶點(diǎn)輸入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，選定物種為“homo sapiens”，設(shè)定閾值P<0.05進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路分析，并對(duì)富集分析結(jié)果用R語(yǔ)言編程軟件進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié) 果

2.1 三七、白芍有效化合物及作用靶點(diǎn)提取結(jié)果 通過TCMSP分析平臺(tái)檢索三七、白芍的主要有效成分，并設(shè)置口服生物利用度(OB≥30%)、類藥性(DL≥0.18)，篩選出各藥物有效成分，再根據(jù)有效成分“MOL_ID”獲取各化合物的靶點(diǎn)(以蛋白名表示)。其中篩選三七有效化合物8個(gè)，白芍有效化合物13個(gè)，三七與白芍重復(fù)化合物1個(gè)：MOL000358(beta-sitosterol)，去重后有效化合物20個(gè)，逐一對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)時(shí)發(fā)現(xiàn)3個(gè)化合物找不到靶點(diǎn)，即三七-白芍藥對(duì)有效化合物17個(gè)(三七7個(gè)，白芍11個(gè)，重復(fù)1個(gè))，得到有效化合物靶點(diǎn)461個(gè)，去重后剩余靶點(diǎn)數(shù)為138個(gè)，再通過Uniprot獲取各靶點(diǎn)基因名。詳見表1。

表1 三七-白芍有效化合物基本信息表

(續(xù)表)

2.2 高血壓疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 以“hypertension”為關(guān)鍵詞，利用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，得到與高血壓相關(guān)的靶點(diǎn)7 811個(gè)，按“Relevance score”排序提取Relevance score≥5的靶點(diǎn)，共1 324個(gè)靶點(diǎn)作為高血壓疾病相關(guān)的靶點(diǎn)，Relevance score 排名前50個(gè)的靶點(diǎn)詳見表2。

表2 高血壓疾病靶點(diǎn)(Relevance score排名前50個(gè))

2.3 活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 三七-白芍去重后的有效化合物共20個(gè)(實(shí)際為17個(gè)化合物，其中有3個(gè)找不到靶點(diǎn)信息)，對(duì)應(yīng)去重后的靶點(diǎn)數(shù)為138個(gè)，通過與GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中與高血壓相關(guān)的靶點(diǎn)基因(1 324個(gè))進(jìn)行比對(duì)，其中有62個(gè)可能是與治療高血壓相關(guān)的作用靶點(diǎn)(交集靶點(diǎn))。詳見表3。

表3 三七-白芍治療高血壓相關(guān)的作用靶點(diǎn)

構(gòu)建中藥化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape 3.7.1軟件中的“Network Analyzer”功能對(duì)中藥化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，“節(jié)點(diǎn)”(node)代表三七-白芍所含藥物化學(xué)成分與潛在作用靶點(diǎn)；“邊”展現(xiàn)了中藥成分和其作用靶點(diǎn)之間的聯(lián)系，根據(jù)化合物與靶點(diǎn)連接情況篩選出三七-白芍作用于高血壓的關(guān)鍵化合物。

將138個(gè)化合物靶點(diǎn)與1 324個(gè)高血壓靶點(diǎn)基因取交集，得到62個(gè)交集基因，對(duì)應(yīng)三七-白芍中16個(gè)候選化合物(白芍-MOL001924無(wú)交集靶點(diǎn)，故未進(jìn)入分析)，其中對(duì)應(yīng)三七化合物7個(gè)，白芍化合物10個(gè)，重復(fù)1個(gè)。借助軟件Cytocsape 3.7.1構(gòu)建中藥化合物-靶點(diǎn)基因相互作用網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中有78個(gè)節(jié)點(diǎn)(化合物節(jié)點(diǎn)16個(gè)，靶基因節(jié)點(diǎn)62個(gè))和168條邊，詳見圖1。圖中度值最高的化合物為quercetin，其次為kaempferol、beta-sitosterol、Stigmasterol、DFV、(+)-catechin、Mandenol，詳見表4，這些度值較高的化合物可能是三七-白芍發(fā)揮治療高血壓的關(guān)鍵化合物。

圖1 有效化合物-作用靶點(diǎn)圖

表4 三七-白芍治療與高血壓相關(guān)的關(guān)鍵化合物(自由度>5)

2.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選 利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)藥物-疾病交集靶點(diǎn)(62個(gè))進(jìn)行PPI分析，研究物種設(shè)定為“Homo Sapiens”，獲得三七-白芍用于高血壓的PPI網(wǎng)絡(luò)(見圖2)，以TSV格式文件保存后，導(dǎo)入Cytoscape軟件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，選取自由度、介數(shù)和中心性都大于平均值的靶點(diǎn)為關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖2 交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

網(wǎng)絡(luò)中有61個(gè)靶點(diǎn)發(fā)生蛋白相互作用(有1個(gè)靶點(diǎn)COLQ未與其他蛋白發(fā)生相互作用，已在PPI圖中刪除)，894條邊代表了蛋白之間相互作用。網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)的平均自由度為14.66，平均介數(shù)為57.81，平均中心度數(shù)為0.522，自由度、介數(shù)、中心度數(shù)均超過平均值的靶點(diǎn)有12個(gè)，詳見表5。推測(cè)這些靶點(diǎn)可能是三七-白芍治療高血壓的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

表5 三七-白芍治療高血壓關(guān)鍵基因基本信息表

2.5 GO功能與KEGG通路分析

2.5.1 GO功能分析結(jié)果 將藥物-疾病交集基因?qū)隓AVID6.8數(shù)據(jù)庫(kù)，輸入靶基因名稱列表，限定物種為“Homo Sapiens”，閾值設(shè)定為P<0.05，進(jìn)行GO功能分析和KEGG通路富集分析。62個(gè)基因影響了89個(gè)生物學(xué)過程，其中生物進(jìn)程(BP)59個(gè)，細(xì)胞組分(CC)過程12個(gè)，分子功能(MF)過程18個(gè)，選取各類過程中P值排名前10的功能信息，其中P值越大，表示富集顯著性最強(qiáng)(見表6)。用R軟件進(jìn)行可視化展示形成柱狀圖3，圖中藍(lán)色越深表示富集程度越顯著，紅色越深表示富集程度越不顯著，柱狀長(zhǎng)度表示富集的基因數(shù)量，長(zhǎng)度越長(zhǎng)，表示富集基因數(shù)越多，發(fā)揮的作用可能越大。

圖3 GO分析結(jié)果

表6 藥物-疾病交集基因GO分析結(jié)果

2.5.2 KEGG分析結(jié)果 62個(gè)交集基因得到(P<0.05)通路共80條，選擇富集顯著排名前15的進(jìn)行分析。詳見圖4。

圖4 KEGG 分析結(jié)果

3 討 論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，基于TCMSP、GeneCards、Uniprot、STRING等公共數(shù)據(jù)庫(kù)以及Cytoscape等軟件，系統(tǒng)科學(xué)地探討了三七-白芍配伍治療高血壓病的作用機(jī)制。三七-白芍可能發(fā)揮抗高血壓治療作用的關(guān)鍵成分有槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇、食脂素、兒茶素、甘露醇。已有研究顯示，槲皮素主要是通過調(diào)控ROS間接影響磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路，從而抑制炎癥和凋亡的發(fā)生，最終減輕動(dòng)脈粥樣硬化程度，延緩高血壓的發(fā)生[7]。張文通等[8]研究發(fā)現(xiàn)山柰酚-3-O-蕓香糖苷能降低血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)活力，減少遷移相關(guān)蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)的表達(dá)，山柰酚-3-O-蕓香糖苷可能通過抑制TGFBR1信號(hào)通路抑制VSMC的增殖和遷移，從而延緩斑塊形成，預(yù)防高血壓。β-谷甾醇和豆甾醇的藥理作用廣泛[9-10]，具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)血脂、抑制腫瘤等藥理活性，而炎癥反應(yīng)能刺激血管內(nèi)皮，導(dǎo)致內(nèi)皮損傷，從而引起血壓升高。β-谷甾醇可能通過抗炎作用來(lái)有效控制血壓。兒茶素可有效預(yù)防心血管疾病，調(diào)節(jié)血脂水平、抗氧化損傷、抑制血栓形成和低密度脂蛋白的氧化，降低氧自由基，從而維持內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)，維持血壓正常[11]。

進(jìn)一步進(jìn)行GO功能和KEGG通路分析預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，三七-白芍配伍治療高血壓作用機(jī)制的生物過程為氧化還原過程(富集靶點(diǎn)數(shù)10個(gè))、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(富集靶點(diǎn)數(shù)6個(gè))、腺苷酸酯活化腎上腺素能受體信號(hào)通路(富集靶點(diǎn)數(shù)5個(gè))等；主要影響的細(xì)胞組分為質(zhì)膜的組成成分(富集靶點(diǎn)數(shù)12個(gè))、細(xì)胞外間隙(富集靶點(diǎn)數(shù)12個(gè))、胞漿(富集靶點(diǎn)數(shù)12個(gè))等；主要影響的分子功能為血紅素結(jié)合(富集靶點(diǎn)數(shù)9個(gè))、蛋白質(zhì)均聚活性(富集靶點(diǎn)數(shù)7個(gè))、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性(富集靶點(diǎn)數(shù)6個(gè))。與高血壓密切相關(guān)的通路為：腫瘤壞死因子(TNF)信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)信號(hào)通路、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)信號(hào)通路、環(huán)磷酸鳥苷-蛋白激酶G(cGMP-PKG)信號(hào)通路、心肌細(xì)胞腎上腺素能信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。而炎性因子參與高血壓內(nèi)皮損害過程，TNF-α可上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞Fas表達(dá)，作用于Caspase-8、Caspase-3，從而引起微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙[12]。研究表明，抑制VEGF-VEGF受體(VEGFR)通路可明顯使血壓升高，可見VEGF在血壓的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，VEGF與VEGFR-2結(jié)合后，激活PI3K/AKT通路和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，上調(diào)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)，從而使一氧化氮(NO)表達(dá)增加[13]；另一方面，酪氨酸激酶c-Src被激活后，導(dǎo)致磷脂酶Cγ1活化、生成肌醇1，4，5-三磷酸酯、Ca2+釋放、激活eNOS、介導(dǎo)其下游產(chǎn)物前列環(huán)素生成[14]，從而調(diào)控血管的生成、管壁的通透性及其舒縮功能，調(diào)節(jié)血壓。因此，在生理狀態(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞通過內(nèi)源性VEGF維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，通過VEGF信號(hào)通路促進(jìn)血管生成、保證內(nèi)皮功能的正常，這對(duì)穩(wěn)定血壓是至關(guān)重要的[15]。HIF-1與VEGF的相互作用是缺氧狀態(tài)下毛細(xì)血管形成的主要機(jī)制[16]，HIF是由α和β兩種不同亞基單位組成的異源二聚體蛋白，在機(jī)體正常狀態(tài)下，HIF-1α?xí)ㄟ^泛素化作用在細(xì)胞內(nèi)降解，當(dāng)組織缺氧時(shí)，HIF-1α則會(huì)在胞質(zhì)聚集，轉(zhuǎn)入胞核，HIF-α增強(qiáng)后激活VEGF的表達(dá)，同時(shí)HIF-1α可促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的表達(dá)，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、黏附，還可通過多種途徑抑制線粒體氧化代謝，降低活性氧(ROS)水平，從而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡和保護(hù)血管內(nèi)皮的作用[17]。另外，鈣離子是參與人體各項(xiàng)生理活動(dòng)的重要信使，儲(chǔ)存于細(xì)胞外或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器中，若細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡，可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、生長(zhǎng)抑制和細(xì)胞凋亡，參與調(diào)控平滑肌收縮、增殖等過程，從而誘發(fā)心血管疾病[18]。王瑤函等[19]觀察了cAMP對(duì)高血壓鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)cAMP可以通過抑制氧化應(yīng)激的上下游信號(hào)通路抑制Giα蛋白的表達(dá)和細(xì)胞增殖，從而減輕高血壓狀態(tài)下氧化應(yīng)激所誘導(dǎo)的并發(fā)癥對(duì)機(jī)體和細(xì)胞的影響。同時(shí)，在sCG催化下，細(xì)胞內(nèi)cGMP水平迅速升高，進(jìn)一步激活下游靶點(diǎn)PKG，而PKG可增加通道活性，有效舒張血管平滑肌、擴(kuò)血管、降血壓[20]。

綜上所述，三七-白芍的降壓機(jī)制主要與抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激、維持血管內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)、調(diào)控血管平滑肌舒縮功能等多個(gè)方面有關(guān)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一門新興學(xué)科，基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，強(qiáng)調(diào)對(duì)某個(gè)節(jié)點(diǎn)的多靶點(diǎn)分析，充分利用網(wǎng)絡(luò)平衡的觀點(diǎn)來(lái)認(rèn)識(shí)藥物對(duì)機(jī)體的作用，這種研究模式正符合中藥復(fù)方治療疾病的“整體觀”以及其“多基因、多靶點(diǎn)、多通路”的療效優(yōu)勢(shì)研究，具有重要的應(yīng)用價(jià)值[21]。本研究挖掘了三七-白芍藥對(duì)治療高血壓的諸多靶標(biāo)，但因?yàn)楣矓?shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)及軟件的使用局限，個(gè)別有效化合物的作用靶點(diǎn)無(wú)法搜集全面，將在今后的研究中繼續(xù)完善和深入研究驗(yàn)證。