田 華，付小衛(wèi)，王 暉

(1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 西安 712046；2. 陜西省人民醫(yī)院，陜西 西安 710061)

胃癌是全世界常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居腫瘤發(fā)病率的第五位，在惡性腫瘤中病死率位居第三位[1]。我國(guó)胃癌新發(fā)病例在惡性腫瘤新發(fā)病例中位居第二位[2]，這已嚴(yán)重危害了人類的健康。近些年胃癌的整體治療效果沒(méi)有取得突破性進(jìn)展，從具有抗癌活性的中藥中提取、純化有效的抗腫瘤成分成為目前醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。鹽酸小檗堿是一種常見(jiàn)的異喹啉類生物堿，其藥理作用廣泛，在臨床上被廣泛用于治療各種消化系統(tǒng)感染性疾病[3]。近年來(lái)，其抗腫瘤作用也得到了廣泛的關(guān)注和研究。本實(shí)驗(yàn)期望通過(guò)研究鹽酸小檗堿對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、凋亡、自噬及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的影響，探討鹽酸小檗堿對(duì)胃癌治療作用的可能機(jī)制，可望為鹽酸小檗堿的抗腫瘤作用提供一些實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1細(xì)胞株 胃癌SGC-7901 細(xì)胞，購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，由陜西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)培養(yǎng)。

1.2試劑 鹽酸小檗堿(Sigma，純度≥98%),RPMI-1640培養(yǎng)液,胎牛血清,胰酶,PBS,SDS-PAGE凝膠配制試劑盒，結(jié)晶紫染色液，CCK-8試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，細(xì)胞凋亡-Hoechst染色劑試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司),Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒(上海博谷生物科技有限公司)，抗體Bax(bs-0127R),Bcl-2(bs-0032R),Caspase-3(bs-0050R),微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)(bs-8878R),Beclin 1(YS-E93248),RAS(YS-19264R),p38(BM4142)。

1.3儀器設(shè)備 細(xì)胞培養(yǎng)箱、小型離心機(jī)、96孔板、R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申花科技有限公司)，311型CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)，IC1000型Countstar自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(美國(guó)Inno-Alliance Biotech公司),VICTOR X5型酶標(biāo)儀(美國(guó) Perkinelmer公司)，F(xiàn)C 500型流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)，Mini-proteanTetra System小型垂直電泳槽，Mini Trans-Blot小型轉(zhuǎn)印槽，Chemi Doc Touch高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng) 將胃癌SGC-7901細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37 ℃,5% CO2)。待細(xì)胞貼壁達(dá)80%～90%后用胰酶消化，1∶3傳代至新的細(xì)胞培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4.2細(xì)胞增殖CCK-8檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分為空白組及鹽酸小檗堿0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5 g/L組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌SGC-7901細(xì)胞，用胰酶消化后制備成細(xì)胞懸液，以每孔4×105個(gè)的密度接種于96孔板中，每孔100 μL。將培養(yǎng)板于培養(yǎng)箱(37 ℃,5% CO2)預(yù)培養(yǎng)24 h，空白組采用10%FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)，鹽酸小檗堿各組向10%FBS培養(yǎng)基中加入相應(yīng)濃度的鹽酸小檗堿培養(yǎng)，每組6個(gè)復(fù)孔，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。培養(yǎng)結(jié)束后避光加入CCK-8溶液，每孔10 μL(不要生成氣泡), 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育3 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度(A)，細(xì)胞存活率= A鹽酸小檗堿組/A空白組×100%。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.4.3細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分為空白組、鹽酸小檗堿4 g/L組和鹽酸小檗堿8 g/L組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞按每孔4×105個(gè)的密度接種于6孔板中培養(yǎng)過(guò)夜。空白組采用10%FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)，鹽酸小檗堿4 g/L組和鹽酸小檗堿8 g/L組向10%FBS培養(yǎng)基中加入相應(yīng)濃度的鹽酸小檗堿培養(yǎng)，于培養(yǎng)箱中(37 ℃,5% CO2)孵育48 h后胰酶消化收集細(xì)胞，并用1 mL PBS緩沖液清洗剩余細(xì)胞1次后全部加入15 mL管中。1 000 r/min離心5 min，用PBS洗滌3次，用低速振蕩器邊震動(dòng)邊加入5 mL預(yù)冷的70%酒精，固定，4 ℃過(guò)夜。次日將固定好的細(xì)胞以1 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清，加入4 mL PBS清洗1次。用0.4 mL PBS重懸細(xì)胞，加入5 μL RNaseA(10 mg/mL)37 ℃消化1 h，加入濃度50 mg/mL碘化丙啶(propidium iodide PI)4 ℃避光染色過(guò)夜，在EPICS XL流式細(xì)胞儀上分析。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.4.4凋亡、自噬及MAPK通路相關(guān)蛋白Western blot檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分為空白組、鹽酸小檗堿4 g/L組和鹽酸小檗堿16 g/L組。鹽酸小檗堿4 g/L組和鹽酸小檗堿16 g/L組用含10% FBS培養(yǎng)基配制相應(yīng)濃度鹽酸小檗堿處理細(xì)胞，制備SGC-7901細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞，PBS清洗3次后加入裂解液裂解細(xì)胞，13 000 r/min離心20 min，提取總蛋白上清液，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。蛋白變性，置于-80 ℃ 冰箱保存。配SDS-PAGE膠、電泳、轉(zhuǎn)膜，室溫下3%脫脂牛奶封閉2 h，吸取封閉液，分別加入一抗β-actin(1∶1 000)，Bax(1∶2 000)、Bcl-2(1∶2 000)、Caspase-3(1∶2 000)，LC3Ⅰ(1∶2 000)、LC3Ⅱ(1∶2 000)、Beclin1(1∶2 000)、RAS(1∶2 000)、P38(1∶2 000)4 ℃過(guò)夜。次日復(fù)溫2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，加入對(duì)應(yīng)的二抗(1∶10 000)室溫2 h，TBST再次洗膜3次，每次10 min，洗膜后使用發(fā)光液進(jìn)行發(fā)光，利用Image Lab軟件分析各條帶的灰度值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度比值。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

2 結(jié) 果

2.1鹽酸小檗堿對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響 鹽酸小檗堿2 g/L、2.5 g/L、3 g/L、3.5 g/L組處理24 h、48 h、72 h后細(xì)胞存活率均明顯低于空白組(P均<0.05)，且細(xì)胞存活率隨著鹽酸小檗堿濃度的增加逐漸降低，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 空白組和不同濃度鹽酸小檗堿組胃癌SGC-7901細(xì)胞存活率比較

2.2鹽酸小檗堿對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響 空白組、鹽酸小檗堿4 g/L組、鹽酸小檗堿8 g/L組的細(xì)胞凋亡率分別為(3.08±0.72)%、(12.19±1.04)%、(22.27±1.65)%，鹽酸小檗堿4 g/L組、鹽酸小檗堿8 g/L組的細(xì)胞凋亡率明顯高于空白組(P均<0.05)，且鹽酸小檗堿8 g/L組明顯高于鹽酸小檗堿4 g/L組(P<0.05)。

2.3鹽酸小檗堿對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響 與空白組比較，鹽酸小檗堿4 g/L組、鹽酸小檗堿16 g/L組Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)量均明顯增高(P均<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05)；鹽酸小檗堿4 g/L組與鹽酸小檗堿16 g/L組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 空白組和不同濃度鹽酸小檗堿組胃癌SGC-7901細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況

2.4鹽酸小檗堿對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的影響 與空白組比較，鹽酸小檗堿16 g/L組Beclin 1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)量均明顯增高(P均<0.05)，鹽酸小檗堿4 g/L組、鹽酸小檗堿16 g/L組LC3I蛋白表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05)；鹽酸小檗堿16 g/L組LC3Ⅱ、Beclin 1蛋白表達(dá)量均明顯高于鹽酸小檗堿4 g/L組(P均<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 空白組和不同濃度鹽酸小檗堿組胃癌SGC-7901細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況

2.5鹽酸小檗堿對(duì)MAPK通路的影響 與空白組比較，鹽酸小檗堿4 g/L組、鹽酸小檗堿16 g/L組RAS、p38蛋白表達(dá)量均明顯增高(P均<0.05)，鹽酸小檗堿4 g/L組與鹽酸小檗堿16 g/L組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 空白組和不同濃度鹽酸小檗堿組胃癌SGC-7901細(xì)胞中RAS、p38蛋白表達(dá)情況

3 討 論

胃癌患者早期無(wú)明顯癥狀，導(dǎo)致早期診斷率較低，多數(shù)患者在診斷時(shí)即已發(fā)展為晚期，且胃癌有著高復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)。因此在治療上很多患者喪失了手術(shù)機(jī)會(huì)，這時(shí)化療、靶向治療為主的內(nèi)科治療在胃癌治療中便占據(jù)了重要地位。雖然分子靶向藥物的出現(xiàn)給腫瘤治療帶來(lái)了新的前景，但總體療效卻不盡如人意。近些年來(lái)大量的研究顯示，中醫(yī)藥在治療胃癌方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。尤建良等[4]報(bào)道中藥復(fù)方微調(diào)三號(hào)合劑治療晚期胃癌可抑制腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移,可提高患者生活質(zhì)量。楊繼泉等[5]采用中藥治療中晚期胃癌，結(jié)果生存期超過(guò)半年者占85.4%。肖真真等[6]實(shí)驗(yàn)觀察到中藥養(yǎng)正散結(jié)湯可明顯遏制胃癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡。王新等[7]研究顯示，鹽酸青藤堿可通過(guò)線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡。趙行宇等[8]研究發(fā)現(xiàn)，6-姜烯酚可抑制胃癌BGC-823細(xì)胞侵襲及遷移。上述研究提示中醫(yī)中藥體內(nèi)及體外均有抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。

正常組織細(xì)胞增殖和凋亡保持著動(dòng)態(tài)平衡，腫瘤是這個(gè)平衡被打破，增殖失控或凋亡失調(diào)的結(jié)果。腫瘤的發(fā)生不僅與腫瘤細(xì)胞的增殖速度有關(guān)，還與腫瘤細(xì)胞的死亡有關(guān)。腫瘤細(xì)胞在癌變的進(jìn)程中，獲得了無(wú)限增殖的能力，其中凋亡缺失是腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖的主要原因之一。Bcl-2和Bax是兩類典型的抑凋亡和促凋亡蛋白。Caspase-3是Caspase家族的凋亡效應(yīng)分子，處于凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，Bcl-2和Bax通過(guò)從線粒體釋放細(xì)胞色素C，激活凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)Caspase-3的活化并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[9]。

研究表明，自噬在早期腫瘤的形成、中晚期腫瘤的增長(zhǎng)、耐藥及胃癌的轉(zhuǎn)移中都起到了非常重要的作用[10-12]。Beclin 1是酵母Atg6哺乳動(dòng)物的同源基因，是自噬調(diào)節(jié)的核心基因，參與自噬體的形成，Beclin 1可以介入自噬發(fā)生的全過(guò)程[13]。LC3是泛素樣蛋白綴合系統(tǒng)，在自噬體隔離膜的延伸和擴(kuò)展過(guò)程中起促進(jìn)作用。LC3存在2種形式，即LC3Ⅰ和LC3Ⅱ。細(xì)胞內(nèi)新合成的LC3經(jīng)過(guò)加工，成為胞質(zhì)可溶形式的LC3Ⅰ，后者被進(jìn)一步泛素化加工修飾，成為膜結(jié)合形式的LC3Ⅱ。LC3Ⅱ是自噬體的標(biāo)志分子，隨自噬體膜的增多而增多。LC3Ⅱ含量或LC3Ⅰ/LC3Ⅱ的比例與自噬體的數(shù)量呈正相關(guān)，在某種程度上反映了細(xì)胞的自噬活性[14]。MAPK通路是與細(xì)胞自噬相關(guān)的信號(hào)通路之一，是細(xì)胞將信號(hào)從細(xì)胞膜傳遞到核內(nèi)的主要通路，MAPK主要分為ERK1/2、JNK、p38 MAPK 3個(gè)亞族，其中p38 MAPK對(duì)自噬有重要的調(diào)控作用[15]。郭滿等[16]研究證明骨橋蛋白依賴p38 MAPK信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)Beclin 1的調(diào)節(jié)作用進(jìn)而調(diào)控自噬。范曉圓[17]研究證實(shí)，鹽霉素可通過(guò)誘導(dǎo)人胃癌BGC-823細(xì)胞的自噬來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。張曄等[18]研究發(fā)現(xiàn)，蟾蜍靈能通過(guò)誘導(dǎo)自噬抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)。方悅等[19]用中藥漢防己的提取物漢防己甲素作用于人胃癌BGC-823細(xì)胞，得到了與上述實(shí)驗(yàn)相似的結(jié)果。 本實(shí)驗(yàn)觀察到鹽酸小檗堿能夠抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡；蛋白表達(dá)檢測(cè)提示鹽酸小檗堿可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生自噬，上調(diào)MAPK通路上游RAS蛋白的表達(dá)，促進(jìn)p38的磷酸化。故推測(cè)鹽酸小檗堿能夠通過(guò)調(diào)控Bax/Bcl-2蛋白的表達(dá)而抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖及促進(jìn)其凋亡，可通過(guò)激活p38 MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞發(fā)生自噬，為其用于胃癌的治療提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。