賀麗娜 劉 力 賀曉旭 王建鈞 何 松

湘南學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科 (湖南 郴州, 423000)

肝癌是原發(fā)于肝臟的惡性腫瘤，是我國腫瘤致死的主要原因之一，嚴(yán)重威脅著國人的健康和生命[1]。近年來，由于外科治療、現(xiàn)代影像技術(shù)和個性化治療的不斷改進(jìn)，肝癌的治療水平已得到了極大的提高，但是肝癌患者的預(yù)后仍然不能令人滿意[2]。肝癌預(yù)后不良的主要原因是肝癌的早期診斷困難、肝癌易于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[3]， 并且缺乏早期診斷和預(yù)后預(yù)測的生物標(biāo)志物[4]。因此，迫切需要了解肝癌發(fā)生的分子機制，尋找肝癌早期診斷和轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物，以開發(fā)更有效的肝癌治療方法。越來越多的證據(jù)表明，微小RNA(miRNA)在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，例如靶向調(diào)控癌基因或癌抑制基因[5,6]。miRNA的表達(dá)具有細(xì)胞和組織特異性，且在進(jìn)化上比較保守，因此被認(rèn)為可作為癌癥預(yù)后的生物標(biāo)志物和癌癥治療的潛在靶標(biāo)。miR-146b-3p是一種致癌miRNA。既往研究顯示，miR-146b-3p在肝癌組織中的表達(dá)顯著高于正常肝組織，其被鑒定為肝癌潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物[7]。然而miR-146b-3p在肝癌中的作用及可能的分子機制尚不清楚。本課題通過干擾肝癌Huh7細(xì)胞中miR-146b-3p的表達(dá)，觀察對Huh7細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響，并探究其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系和主要試劑 人正常肝細(xì)胞系L025和人肝癌細(xì)胞系Huh7、MHCC97-H、HCCLM3(中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所)；DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；胎牛血清、胰蛋白酶(美國Gibco公司)；青霉素-鏈霉素雙抗(北京雷根生物技術(shù)有限公司)；Trizol試劑、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海生工生物工程有限公司)；SYBR Green PCR Master Mix檢測試劑盒(日本TaKaRa公司)；miR-146b-3p inhibitor、inhibitor control、miR-146b-3p mimics和mimics control(廣州銳博生物科技有限公司)；BTG2特異性siRNA和非特異性siRNA(上海吉瑪制藥有限公司)；Dual-Luciferase熒光素酶報告基因檢測試劑盒(美國Promega公司)；Transwell小室(美國Corning公司)；MTT試劑(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；Matrigel基質(zhì)膠(美國BD公司)；野生型BTG2 3′UTR(BTG2-Wt)熒光素酶重組載體質(zhì)粒和突變型BTG2 3’UTR(BTG2-Mut)熒光素酶重組載體質(zhì)粒(美國Sigma公司)；蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑(美國Thermo Fisher公司)；PVDF膜、BTG2抗體(美國Abcam公司)；辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗(美國CST公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 所有細(xì)胞系均培養(yǎng)在含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液中，將細(xì)胞放置在體積分?jǐn)?shù)為5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，隔天進(jìn)行換液。待細(xì)胞鋪滿瓶底80%以上時用胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 將生長狀態(tài)良好的Huh7細(xì)胞種植于6孔板中，放置在37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長密度達(dá)50%左右時，采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染miR-146b-3p inhibitor、BTG2特異性siRNA及陰性對照，其中轉(zhuǎn)染miR-146b-3p inhibitor的Huh7細(xì)胞作為anti-miR-146b-3p組，轉(zhuǎn)染inhibitor control的Huh7細(xì)胞作為anti-NC組，轉(zhuǎn)染空脂質(zhì)體的Huh7細(xì)胞作為Ctrl組；共轉(zhuǎn)染miR-146b-3p inhibitor和BTG2特異性siRNA的Huh7細(xì)胞作為anti-miR-146b-3p+si-BTG2組，共轉(zhuǎn)染miR-146b-3p inhibitor和非特異性siRNA的Huh7細(xì)胞作為anti-miR-146b-3p+si-NC組。各組Huh7細(xì)胞轉(zhuǎn)染后放置于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4 qPCR檢測 參照Trizol試劑使用說明書提取細(xì)胞總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用SYBR Green PCR Master Mix檢測試劑盒行qPCR檢測，條件設(shè)為：95℃ 5 min，隨后95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 20 s，共設(shè)40個循環(huán)，以U6為內(nèi)參，采用相對量2-△△Ct法分析miR-146b-3p相對表達(dá)水平。miR-204-3p正向引物：5′-GTCTGAGACTAGGGCCAGAGGC-3′；反向引物5′-GACATGGGAGTGGAGTGACAGG-3′。U6正向引物5′-AAAGCAAATCATCGGACGACC-3′；反向引物5′-GTACAACACATTGTTTCCTCGGA-3′。

1.5 Western blot檢測 使用蛋白提取試劑盒常規(guī)提取總蛋白，以BCA蛋白濃度測定試劑盒對蛋白濃度進(jìn)行檢測，在蛋白樣品中加入適量上樣緩沖液，加熱致蛋白變性。取等量蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳，隨后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，將膜浸入5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h，依次加入相應(yīng)稀釋的BTG2一抗(1∶500稀釋)，4℃孵育過夜，再加入1∶3 000稀釋的二抗，室溫孵育2 h，按照ECL發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯影，轉(zhuǎn)移到暗室曝光并采集圖像，使用Image J圖像分析計算BTG2蛋白相對表達(dá)水平。

1.6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?通過生物信息學(xué)在線數(shù)據(jù)庫TargetScan預(yù)測，結(jié)果顯示miR-146b-3p和BTG2 3′UTR存在互補配對堿基，根據(jù)預(yù)測結(jié)果構(gòu)建BTG2-Wt和BTG2-Mut熒光素酶重組載體質(zhì)粒(由公司完成)。分別將BTG2-Wt和BTG2-Mut重組載體質(zhì)粒分別與miR-146b-3p mimics或mimics control共轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，48 h后收集各組細(xì)胞，采用Dual-Luciferase熒光素酶報告基因檢測試劑盒分別測定螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性，計算細(xì)胞相對熒光素酶活性。

1.7 MTT檢測 生長狀態(tài)良好的各組Huh7細(xì)胞以5×103個/孔種植到96孔板中，于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h時，向細(xì)胞中添加100 μl MTT溶液，孵育4 h，再添加150 μl二甲基亞砜，振蕩10 min，使用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞在波長為450 nm處吸光度值(OD值)。

1.8 Transwell實驗 Matrigel基質(zhì)膠于4℃冰箱融化，以不含血清的培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，取100 μl稀釋的Matrigel膠加入Transwell小室的上室，放置在37℃培養(yǎng)箱靜置5 h備用。收集各組Huh7細(xì)胞，用不含血清的培養(yǎng)液饑餓處理12 h，隨后將細(xì)胞密度調(diào)整為2.0×105/ml，將200 μl細(xì)胞懸液加入Matrigel膠包被的Transwell上室(遷移實驗Transwell上室未包被Matrigel膠)，600 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)液加入到下室，37℃繼續(xù)孵育48 h。用棉簽擦去未穿膜的細(xì)胞，隨后用甲醛固定，用結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下計數(shù)侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 miR-146b-3p和BTG2在肝癌細(xì)胞中的表達(dá) 與人正常肝細(xì)胞系比，人肝癌細(xì)胞系(Huh7、MHCC97-H、HCCLM3)中miR-146b-3p的表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05)，BTG2的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。在肝癌Huh7細(xì)胞中的表達(dá)水平差異最顯著，因此后續(xù)選擇Huh7細(xì)胞為研究對象。見圖1。

圖1 miR-146b-3p和BTG2在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 轉(zhuǎn)染miR-146b-3p inhibitor對Huh7細(xì)胞miR-146b-3p和BTG2表達(dá)的影響 與anti-NC組比較，anti-miR-146b-3p組Huh7細(xì)胞中miR-146b-3p的表達(dá)的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，BTG2的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。與Ctrl組比較，anti-NC組中miR-146b-3p和BTG2的表達(dá)水平差異均不顯著(P>0.05)。見圖2。

圖2 轉(zhuǎn)染miR-146b-3p inhibitor對Huh7細(xì)胞中miR-146b-3p和BTG2表達(dá)的影響

2.3 miR-146b-3p靶向調(diào)控BTG2 生物信息學(xué)在線數(shù)據(jù)庫TargetScan預(yù)測發(fā)現(xiàn)，BTG2 3′UTR區(qū)域存在與miR-146b-3p結(jié)合的位點，提示BTG2可能是miR-146b-3p的直接靶基因。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，過表達(dá)miR-146b-3p能夠明顯抑制BTG2-Wt細(xì)胞的相對熒光素酶活性(P<0.05)，而對BTG2-Mut細(xì)胞的相對熒光素酶活性無明顯影響(P>0.05)。見圖3。

圖3 miR-146b-3p靶向BTG2

2.4 干擾miR-146b-3p對Huh7細(xì)胞增殖的影響 與anti-NC組比較，anti-miR-146b-3p組Huh7細(xì)胞在轉(zhuǎn)染48 h和72 h時增殖活力明顯降低(P<0.05)。與Ctrl組比較，anti-NC組Huh7細(xì)胞在24 h、48 h和72 h時增殖活力差異均不顯著(P>0.05)。見圖4。

圖4 干擾miR-146b-3p對Huh7細(xì)胞增殖活力的影響

A：qPCR檢測各細(xì)胞系中miR-146b-3p的表達(dá)水平；B：Western blot檢測各細(xì)胞系中BTG2的表達(dá)水平；C：BTG2在各細(xì)胞系中表達(dá)水平比較： 與L025細(xì)胞系比較，*P<0.05

A：qPCR檢測各組Huh7細(xì)胞中miR-146b-3p的表達(dá)水平；B：Western blot檢測各組Huh7細(xì)胞中BTG2的表達(dá)水平；C：BTG2在各組Huh7細(xì)胞中表達(dá)水平比較；與anti-NC組比較，*P<0.05

A：miR-146b-3p與BTG2 3’UTR靶向結(jié)合示意圖；B：雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CBTG2是miR-146b-3p的靶基因；與miR-NC組比較，*P<0.05

2.5 干擾miR-146b-3p對Huh7細(xì)胞侵襲和遷移的影響 與anti-NC組比較，anti-miR-146b-3p組侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)均明顯降低(P<0.05)。與Ctrl組比較，anti-NC組侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)差異均不顯著(P>0.05)。見圖5。

A：Transwell實驗檢測各組Huh7細(xì)胞侵襲能力；B：Transwell遷移實驗檢測各組Huh7細(xì)胞遷移能力；C：各組Huh7細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)比較；D：各組Huh7細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)比較；與anti-NC組比較，*P<0.05

2.6 沉默BTG2逆轉(zhuǎn)干擾miR-146b-3p對Huh7細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的抑制作用 與anti-miR-146b-3p+si-NC組比較，anti-miR-146b-3p+si-BTG2組Huh7細(xì)胞中BTG2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞增殖活力明顯升高(P<0.05)，侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0.05)；與anti-miR-146b-3p組比較，anti-miR-146b-3p+si-NC組Huh7細(xì)胞中BTG2蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞增殖活力、侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)差異均不顯著(P>0.05)。見圖6。

圖6 沉默BTG2對干擾miR-146b-3p調(diào)控的Huh7細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響

3 討論

肝癌一直是人類最致命和最普遍的惡性腫瘤之一，而肝細(xì)胞癌是最常見的肝癌類型，占所有病例的90%以上。近幾十年來盡管在肝癌的診斷和治療方面取得了一定的進(jìn)展，但肝癌患者的預(yù)后仍然很差，主要由于腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)導(dǎo)致患者5年生存率低下[8]。因此，了解肝癌發(fā)病機制，開發(fā)針對該疾病的有效早期診斷技術(shù)和系統(tǒng)性治療策略對于提高患者生存率至關(guān)重要。目前，大量研究主要集中在鑒定新的、特異性的生物標(biāo)志物，以用于肝癌診斷、治療和預(yù)后預(yù)測[9,10]。miRNA的異常表達(dá)與許多人類疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，例如癌癥、神經(jīng)發(fā)育障礙和心血管綜合征[11,12]。證據(jù)表明，許多miRNA在肝癌患者的血清和血漿以及肝癌細(xì)胞和組織中都存在異常表達(dá)[13]。因此，miRNA可作為新型臨床標(biāo)志物用于肝癌的早期診斷、治療監(jiān)測和預(yù)后預(yù)測。miR-146b-3p和miR-146b-5p是來自同一基因的兩個同工型，具有不同的序列并用于調(diào)節(jié)不同的基因表達(dá)。目前對miR-146b-5p的研究比較深入，研究顯示miR-146b-5p可調(diào)節(jié)多種腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移，且其表達(dá)水平與患者預(yù)后不良密切相關(guān)[14-16]。然而，關(guān)于miR-146b-3p在肝癌中的作用及機制仍未明確。本實驗首先通過qPCR檢測了miR-146b-3p在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-146b-3p在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于正常肝細(xì)胞。在肝癌Huh7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-146b-3p inhibitor后，Huh7細(xì)胞增殖活力明顯降低，侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)明顯減少，這提示干擾miR-146b-3p能夠抑制肝癌Huh7細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力。

眾所周知，miRNA和靶標(biāo)mRNA之間的相互作用形成了一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)眾多的細(xì)胞過程，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和器官發(fā)育的調(diào)節(jié)[17]。B細(xì)胞易位基因2(BTG2)蛋白在各種癌癥類型中均被認(rèn)為是腫瘤抑制因子[18-20]。有研究顯示，BTG2的表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后相關(guān)，BTG2的過表達(dá)促使體外Huh7細(xì)胞和裸鼠模型中對輻射誘導(dǎo)的凋亡敏感[21]。另一項研究顯示，下調(diào)BTG2的表達(dá)能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖[22]。本研究前期預(yù)實驗通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-146b-3p和BTG2存在靶向關(guān)系，然而，miR-146b-3p是否能夠通過靶向BTG2調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的研究鮮有報道。本實驗qPCR檢測結(jié)果顯示，miR-146b-3p在肝癌細(xì)胞系中呈高表達(dá)，而BTG2在肝癌細(xì)胞中呈低表達(dá)。且干擾miR-146b-3p能夠上調(diào)BTG2的表達(dá)，熒光素酶報告實驗結(jié)果表明，miR-146b-3p和BTG2間存在靶向關(guān)系，這些數(shù)據(jù)表明miR-146b-3p能夠靶向調(diào)控BTG2的表達(dá)。為進(jìn)一步探究miR-146b-3p靶向BTG2來影響肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，本實驗在Huh7細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-146b-3p inhibitor和BTG2 siRNA，通過BTG2功能恢復(fù)實驗探究BTG2對miR-146b-3p調(diào)控的Huh7細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默BTG2能夠逆轉(zhuǎn)干擾miR-146b-3p對Huh7細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的抑制作用。本實驗數(shù)據(jù)表明miR-146b-3p可通過靶向BTG2調(diào)控肝癌Huh7細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。

綜上，miR-146b-3p在肝癌細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，干擾miR-146b-3p能夠通過靶向調(diào)控BTG2的表達(dá)抑制肝癌Huh7細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。然而miR-146b-3p是否靶向其他靶基因參與肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控尚未可知，尚需進(jìn)一步的深入探究。本實驗結(jié)果提示，miR-146b-3p可作為肝癌診斷和治療的靶標(biāo)提供新的實驗依據(jù)。