張國梁 張先姚 侯 勇 施 美 韓 啥 李夢夢 王 姣

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科 (安徽 合肥， 230031) 2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)

慢性乙型肝炎(CHB)會導(dǎo)致慢性肝纖維化、肝硬化、原發(fā)性肝癌。而HBV感染慢性化的機(jī)制至今尚不明確。研究認(rèn)為，機(jī)體的免疫應(yīng)答低下或免疫耐受是導(dǎo)致HBV感染慢性化的重要機(jī)制，其中涉及細(xì)胞、細(xì)胞因子及信號傳導(dǎo)通路等因素相互作用[1]。有研究證實，NKT細(xì)胞功能低下是HBV感染慢性化主要機(jī)制[2]。PD-1是屬于免疫球蛋白超家族成員的一種抑制性受體，與其配體PD-L1形成的通路對T細(xì)胞增殖、NKT細(xì)胞的活化具有一定的抑制作用，造成機(jī)體不能有效清除病毒，從而使病毒慢性持續(xù)性感染[3]。而通過阻斷PD-1/PD-L1信號通路可以激活iNKT細(xì)胞的功能，從而發(fā)揮抑制病毒的作用。近年來在臨床研究過程中發(fā)現(xiàn)軟肝飲能夠上調(diào)CHB患者外周血液中NKT細(xì)胞的數(shù)量，提升NKT細(xì)胞的活性，同時能夠下調(diào)PD-1的表達(dá)，除具有抗肝纖維化作用外，對細(xì)胞免疫功能的調(diào)控也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。為了進(jìn)一步研究其免疫學(xué)機(jī)制，筆者通過觀察軟肝飲對HBV轉(zhuǎn)基因小鼠iNKT細(xì)胞及細(xì)胞表面PD-1/PD-L1的表達(dá)的影響，探討軟肝飲治療HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物 50只SPF級BALB/C品系HBV轉(zhuǎn)基因小鼠，雌雄各半；年齡：35～40 d；體重(16±25)g。與HBV轉(zhuǎn)基因小鼠同窩的非HBV轉(zhuǎn)基因正常小鼠10只，雌雄各半；年齡：35～40 d；體重(16±25)g。購買于中國人民解放軍第458醫(yī)院全軍肝病中心(許可證編號：2017-0016)，飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物房(普通級飼養(yǎng)室)。在開始實驗前小鼠先適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 藥物及試劑 中藥軟肝飲組方及劑量：生黃芪、紫丹參各30 g，赤芍15 g，醋鱉甲20 g，莪術(shù)、柴胡、炒白術(shù)各10 g，三七、五味子各5 g(由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供)。采用中藥水煎法制備軟肝飲，準(zhǔn)確稱取對應(yīng)中藥，首先將中藥放入干凈的煎藥鍋，加入蒸餾水200 ml，浸泡30 min，加水煎煮兩次，第1次加1 200 ml，煎煮1.5 h，第2次加水1 200 ml，煎煮1 h，合并煎液，濾過，靜置24 h。取上清液，減壓濃縮至67.5 ml，生藥濃度為2 g/ml，4℃保存。另取中藥2劑，以同樣方法分別制配成中劑量濃縮液135 ml(1 g/ml生藥)和低劑量濃縮液270 ml(0.5 g/ml生藥)，每次制備軟肝飲使用期限不超過1周。恩替卡韋分散片(規(guī)格：0.5 mg/片，安徽貝克藥業(yè)有限公司)。0.9%生理鹽水。TCR V beta 11 Monoclonal Antibody(RR3-15), APC；TCR V alpha 24 J alpha 18 Monoclonal Antibody(6B11), FITC；CD279(PD-1) Monoclonal Antibody(J43), PE；CD274(PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE；均購自eBioscience公司。

1.3 分組及給藥方法 將10只非HBV轉(zhuǎn)基因小鼠作為空白對照組，50只HBV轉(zhuǎn)基因小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組,即模型組,軟肝飲高、中、低劑量組(含軟肝飲方生藥濃度為2、1、0.5 g/ml),陽性對照組(恩替卡韋分散片0.5 mg溶于77 ml生理鹽水中)。分別給予相應(yīng)藥物灌胃,灌胃體積為0.2 ml/次,1次/d,連續(xù)4周；空白對照組及模型組小鼠給予等體積的生理鹽水。

1.4 標(biāo)本采集及檢測方法 在灌胃第30 d時，用小鑷子摘取眼球后行眼球后采血，每只分別采全血，置于管中，密封后靜置于4℃的冰箱1 h，隨后取出，1 500 rpm/min的速率離心10 min，吸取上層血清，分別轉(zhuǎn)移至規(guī)格0.5 ml的EP管中，存放于-20℃的冰箱內(nèi)備用。全血則注入抗凝管內(nèi)，立即進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。采血后處死小鼠，取出肝組織，于福爾馬林中浸泡，用于流式細(xì)胞學(xué)檢測及免疫熒光技術(shù)檢測。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠外周血iNKT細(xì)胞及其表面 PD-1、PD-L1表達(dá)情況 見表1。

表1 各組小鼠外周血iNKT細(xì)胞及其表面PD-1、PD-L1表達(dá)水平的變化

2.2 各組小鼠肝臟iNKT細(xì)胞及其表面PD-1、PD-L1表達(dá)情況 HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟細(xì)胞iNKT表達(dá)明顯低于空白對照組，iNKT細(xì)胞表面PD-1、PD-L1的表達(dá)明顯高于空白對照組，均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；軟肝飲高、中劑量組及陽性對照組小鼠肝臟細(xì)胞iNKT表達(dá)與模型組相比均明顯增加，iNKT細(xì)胞表面PD-1、PD-L1的表達(dá)均明顯降低，差異有顯著性意義(均P<0.05)；軟肝飲低劑量組小鼠肝臟細(xì)胞iNKT及其表面PD-1、PD-L1的表達(dá)與模型組相比無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、2、3。

圖1 各組小鼠肝臟iNKT細(xì)胞表達(dá)水平

圖2 各組小鼠肝臟iNKT細(xì)胞表面PD-1表達(dá)水平

圖3 各組小鼠肝臟iNKT細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)水平

3 討論

祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為，CHB發(fā)病以濕熱毒邪為其致病外因，正氣虧損為致病內(nèi)因。因肝主疏泄與藏血，若邪氣入肝，則血脈運(yùn)行不暢，病情發(fā)展久后則致瘀?；谏鲜稣J(rèn)識，我們以“化瘀軟堅、益氣健脾”為治療原則，組成中藥復(fù)方軟肝飲應(yīng)用于CHB臨床治療多年，療效確切安全。方中以紫丹參、醋鱉甲為君，行祛瘀軟堅之功效；莪術(shù)、三七破血行氣化瘀；黃芪、白術(shù)益氣健脾；柴胡疏肝理氣；五味子益氣生津、補(bǔ)腎寧心。全方共奏活血化瘀，益氣健脾之效。

NKT細(xì)胞是一種特殊的T細(xì)胞亞群，同時具有傳統(tǒng)T細(xì)胞和NK細(xì)胞某些特征，受脂質(zhì)抗原刺激，連接先天性和適應(yīng)性免疫。NKT細(xì)胞根據(jù)其表面TCR的表達(dá)類型及是否依賴CD1d分子，可分為3型[4]。Ⅰ型：主要表現(xiàn)為占NKT細(xì)胞的絕大部分且表達(dá)恒定的TCR受體的經(jīng)典型NKT細(xì)胞(iNKT)，在人類和小鼠中具有不同的特征,Vα24Jα18和Vβ11主要表現(xiàn)于人類，而 Vα14Jα18和Vβ8.2、Vβ7或是Vβ2則在小鼠中體現(xiàn)出來。Ⅱ型：主要表現(xiàn)的NKT細(xì)胞亞群是以CD1d 依賴的，同時含有不同的非Va14 TCR亞基。Ⅲ型：主要表現(xiàn)的NKT細(xì)胞亞群是不以CD1d 依賴的，而含有不同的 TCR 重排亞基。因為Ⅱ、Ⅲ型占比較少，同時無恒定的TCR表達(dá)，所以目前國內(nèi)外研究主要集中于iNKT細(xì)胞。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)人體肝臟內(nèi)含有豐富的NKT細(xì)胞，在HBV感染中，NKT細(xì)胞在病毒等脂類抗原的刺激下被激活迅速產(chǎn)生IFN-γ、IL-4 等細(xì)胞因子從而發(fā)揮抑制HBV的作用[5]。同時大量的動物性試驗也證實了肝內(nèi)NKT細(xì)胞有抗HBV的作用。

PD-1是一種免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白，屬于CD28家族中的免疫抑制性受體。PD-1通過激活后在T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、活化的單核細(xì)胞以及髓細(xì)胞和胸腺細(xì)胞中表達(dá)[6]。PD-1有兩個配體PD-L1和PD-L2。其中PD-L1廣泛表達(dá)在造血和非造血組織中，同時上調(diào)性表達(dá)于刺激后活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(DC)中， PD-1介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑抑制T淋巴細(xì)胞耗竭、細(xì)胞因子產(chǎn)生、增殖和存活。目前研究發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1在自身免疫、感染免疫、腫瘤免疫中均扮演著關(guān)鍵的角色。臨床研究發(fā)現(xiàn)在CHB患者中外周血PD-1呈高表達(dá)狀態(tài)，通過抗病毒藥物治療后，患者外周血PD-1的表達(dá)明顯降低，結(jié)果表明抗病毒藥物發(fā)揮抑制HBV的作用可能與阻斷PD-1/PD-L1信號通路有關(guān)[7]。唐曼麗[8]在研究CHB體外誘導(dǎo)培養(yǎng)實驗中將CD8+T細(xì)胞同補(bǔ)腎清毒湯藥混合培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎清毒方藥能使CHB患者的CD8+T細(xì)胞表達(dá)共刺激分子PD-1、PD-L1的表達(dá)水平下調(diào)，揭示了補(bǔ)腎清毒方治療CHB的作用可能與抑制PD-1、PD-L1的表達(dá)水平有關(guān)。

本次研究結(jié)果表明中藥軟肝飲治療HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的免疫機(jī)制可能通過阻斷iNKT細(xì)胞上PD-1/PD-L1信號通路，調(diào)控iNKT細(xì)胞功能發(fā)揮抗HBV作用。