孫倩倩，杜 裕，劉 明，宋星卓，邢彥燾，王析瑞，蔣坤秀，王 娜，劉永剛

(1.北京中醫(yī)藥大學，北京 102488；2.生物醫(yī)學分析中心，北京 100850)

去氫駱駝蓬堿(harmine, HM)，又稱肉葉蕓香堿，是一種三環(huán)β-咔啉類生物堿，主要來源于多年生草本蒺藜科駱駝蓬(PeganumharmalaL.)，在駱駝蓬子中含量較高，具有抗菌、抗腫瘤、降血糖、抗氧化和抗寄生蟲等藥理活性[1-2]。但駱駝蓬子有毒，去氫駱駝蓬堿具有嚴重的神經毒性，會引起患者嘔吐、震顫、幻覺甚至死亡，因此未應用于臨床[3]。有研究表明[4]，去氫駱駝蓬堿可能通過誘導小膠質細胞的活化，激活的小膠質細胞促使炎癥因子釋放增加，導致神經組織損傷。但是，目前對去氫駱駝蓬堿的神經毒性機制尚不明確。

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans,C.elegans)屬于線蟲動物門動物。線蟲作為模式生物，具有培養(yǎng)簡單、易保存和傳代、便于觀察、遺傳背景清晰和造模簡單等優(yōu)勢[5-8]。線蟲以尿嘧啶滲漏突變型大腸桿菌(E.coliOP50)為食，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，且單個培養(yǎng)基上(直徑9 cm)可存活幾百條線蟲，簡單易行。線蟲擁有簡單但完整的神經系統(tǒng)，有利于深入研究人類神經系統(tǒng)結構和功能[9]。目前研究發(fā)現(xiàn)[10-11]，可通過線蟲的運動行為、攝食行為、乙酰膽堿酯酶、基因表達定量分析和神經元形態(tài)反映神經毒性。

代謝組學通過觀察生物體系受刺激或干擾后，其代謝產物隨時間的變化來研究完整生物體的功能和代謝[12]。通常采用高效液相色譜(HPLC)、液相色譜-質譜(LC-MS)、氣相色譜-質譜(GC-MS)以及核磁共振(NMR)等高通量、高分辨和高靈敏度的分析手段研究生物體體液中的內源性代謝產物，并結合模式識別等化學信息學技術，分析生物體在不同狀態(tài)下代謝指紋圖譜的差異，獲得相應的生物標志物群(Biomarkers)，從而揭示生物體在特定時間、環(huán)境下的整體功能狀態(tài)[13]。近年來，代謝組學技術被越來越多地應用于藥物毒理研究領域，在揭示藥物的毒性機制、識別與靶器官損害，尤其是與肝腎損害相關聯(lián)的代謝生物標志物方面發(fā)揮著重要作用[14]。

本課題組前期研究表明[15]，去氫駱駝蓬堿可以降低秀麗隱桿線蟲的體長，神經毒性與能量代謝相關，但作用機制和通路并不明確?；诖耍緦嶒瀸⒒趦仍葱源x探究去氫駱駝蓬堿對秀麗隱桿線蟲的神經毒性機制。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜儀：日本島津公司產品；TripleTOF6600 高分辨質譜儀：美國SCIEX公司產品；超低溫冰箱、超凈工作臺：美國Thermo公司產品；生化培養(yǎng)箱：北京虹湖化工有限公司產品；體視顯微鏡：日本Nikon公司產品；高溫高壓滅菌鍋：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司產品；KQ100VDB雙頻數(shù)控超聲波清洗器：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司產品；電子天平：美國Ohaus公司產品；萬分之一電子分析天平：瑞士Mettler Toledo公司產品；微量移液器：德國Eppendorf公司產品；智能數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇金怡儀器科技有限公司產品；離心機、渦旋振蕩器：賽普銳思科技有限公司產品。

1.2 主要材料與試劑

胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂、蛋白胨、膽固醇、無水乙醇、次氯酸鈉、二甲基亞砜(DMSO)等：北京虹湖化工有限公司產品；氯化鈉、氯化鈣、磷酸二氫鉀、氫氧化鉀、硫酸鎂、磷酸氫二鈉、氯化銨、氫氧化鈉等試劑：蘭博利德生物科技有限公司產品；甲醇、乙醇、甲酸、乙腈：質譜級，美國Fisher公司產品；去氫駱駝蓬堿：實驗室自制；培養(yǎng)皿(直徑3、6 cm)：北京拜爾迪有限公司產品；野生型秀麗隱桿線蟲(N2 Bristol)：由遺傳所丁梅老師惠贈。

1.3 實驗條件

1.3.1色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLCTM HSS T3 柱(100 mm×2.1 mm×1.8 μm)；柱溫：40 ℃；進樣量：3 μL；流動相：A為0.1%甲酸-水溶液，B為0.1%甲酸-乙腈溶液；流速：0.3 mL/min；梯度洗脫程序：0～1.5 min(1%B)；1.5～13.0 min(1%～99%B)；13.0～16.5 min(99%B)；16.5～20.0 min(1%B)。

1.3.2質譜條件 電噴霧離子源(ESI)，正、負離子模式下檢測；數(shù)據(jù)采集方式為依賴采集模式 (IDA)；全掃描一級譜圖及二級譜圖可以在一次分析中獲得；質量掃描范圍m/z50～1 000；質量偏差50 mu；離子源霧化氣Gas1和輔助氣Gas2壓強均為50 Pa，氣簾氣壓強35 Pa，溫度500 ℃；噴霧電壓 (ISVF) 5 500 V/-4 500 V，去簇電壓(DP)80 V/-80 V，碰撞能量(collision energy)30±15 eV。

1.4 培養(yǎng)基(NGM)的配制

為保證線蟲能夠與藥物充分接觸，在NGM中補充對應濃度的去氫駱駝蓬堿，以DMSO作為空白對照。用DMSO溶解藥物，配制成50 mmol/L母液，于4 ℃或-20 ℃保存，待NGM滅菌結束后，將配制好的藥物母液與NGM混合，制成含去氫駱駝蓬堿濃度為160、300 μmol/L的培養(yǎng)液，然后倒入培養(yǎng)板中。將培養(yǎng)板置于室溫下，待其凝固，將培養(yǎng)皿倒置，4 ℃保存，備用。

1.5 秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)

無菌環(huán)境下，在培養(yǎng)基中接種50 μL缺陷型大腸桿菌(E.coliOP50)后，再放置于生化培養(yǎng)箱中1天用于培養(yǎng)線蟲，秀麗隱桿線蟲在培養(yǎng)基上生長發(fā)育，于22 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。根據(jù)實驗需要，大約3～4天轉一次板，避免線蟲過于擁擠或處于饑餓狀態(tài)而進入dauer時期(該時期線蟲為永久性幼蟲)，同時還需要保證線蟲的干凈，防止霉菌、細菌以及螨蟲等污染。

1.6 暴露實驗

在含有300 μmol/L去氫駱駝蓬堿的培養(yǎng)板上分別接種同步化后處于卵期、L4時期的秀麗隱桿線蟲，卵期秀麗隱桿線蟲在22 ℃下暴露72 h，L4時期秀麗隱桿線蟲分為2組，分別暴露2 h和24 h，對照組為含300 μmol/L DMSO濃度的培養(yǎng)基。暴露結束后，用于后續(xù)實驗，每個給藥組和空白組至少含有5 000只秀麗隱桿線蟲。

1.7 秀麗隱桿線蟲樣本的代謝物提取以及樣品制備

用M9緩沖液收集不同濃度去氫駱駝蓬堿暴露1天后的秀麗隱桿線蟲，靜置3～5 min，棄去多余的M9，用800 μL 80%甲醇沖洗3次，然后用手持勻漿機充分勻漿(冰浴)。將研磨液在4 ℃下以12 000 r/min離心20 min，上清液轉移至2 mL EP管中；再加入0.4 mL 80%甲醇提取1次，合并2次提取的上清液，在-20 ℃保存沉淀1 h，放置于離心機中，在4 ℃下以12 000 r/min離心15 min，吸取150 μL至新EP管，并備份1份。將樣品與備份樣品冷凍干燥(樣品干燥時間3～5.5 h)，于-20 ℃保存。進行UPLC-QTOF MS檢測前，向每份樣品凍干粉中加入100 μL乙醇-水(1∶1，V/V)混合液，反復吹打管底和管壁，使其充分混合均勻，常溫下超聲5 min，以14 000 r/min離心10 min；每個樣品吸取2 μL上清液制備成質控樣品(QC)，吸取20 μL上清液至塑料上樣管，將上樣管樣品轉移至樣品瓶中，按照空白、QC、待測樣品的順序依次放入上樣品盤中，待UPLC-QTOF MS檢測。

1.8 秀麗隱桿線蟲內源性代謝物代謝組學分析

在網(wǎng)站(https:∥www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml)進行信號通路的分析，分為以下幾個步驟：1) 在MetaboAnalyst home界面，點擊click here to start，進入模塊選擇頁面；2) 在模塊選擇頁面，選擇Pathway Analysis模塊；3) 上傳數(shù)據(jù)，參數(shù)設置完成后，點擊Submit；4) 對網(wǎng)頁所顯示的物質進行校對；5) 選擇相應的物種以及數(shù)據(jù)庫；6) 下載檢測結果。

2 結果與討論

2.1 秀麗隱桿線蟲代謝物檢測質譜條件

秀麗隱桿線蟲代謝樣品在正、負離子模式下的離子流圖示于圖1。通過總離子流圖可以查看實驗結果的穩(wěn)定性，色譜峰重疊部分越多則表明穩(wěn)定性越好。

2.2 秀麗隱桿線蟲內源性代謝物代謝組學分析

秀麗隱桿線蟲內源性代謝物的代謝通路示于圖2。在信號通路分析結果中會出現(xiàn)代謝組視圖，可以顯示所有匹配到的通路，將鼠標放在每個節(jié)點上將顯示其通路名稱，單擊每個節(jié)點將在右側面板上顯示對應通路。通路中，淺藍色表示這些代謝物僅作為富集分析的背景信息，并未被匹配到；灰色表示該物質既不在數(shù)據(jù)中，富集分析時也不包括這些數(shù)據(jù)；其他顏色(從黃色到紅色不等)表示代謝物在數(shù)據(jù)中具有不同的顯著性水平。代謝物代碼信息可以直接鏈接到京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)查找。

注：每個秀麗隱桿線蟲樣本重復3次進針；不同顏色代表不同線蟲樣本的不同進針圖1 秀麗隱桿線蟲代謝物在負(a)、正(b)離子模式下的離子流圖Fig.1 Ion current chromatography of metabolite of caenorhabditis elegans in negative (a) and positive (b) ion modes

卵期給藥的結果示于圖2，圖中所示編號信息列于表1。所涉及顯著性水平較高的前3個通路有：嘌呤代謝通路、精氨酸和脯氨酸代謝通路以及煙酸酯和煙酰胺代謝通路。與空白組相比，嘌呤代謝通路中的ADP、cGMP、腺嘌呤、腺苷琥珀酸、鳥苷、鳥嘌呤、黃嘌呤5′-磷酸、肌苷、次黃嘌呤含量均下調，尿酸含量上調；精氨酸和脯氨酸代謝通路中，L-精氨酸、S-腺苷-L-蛋氨酸、L-脯氨酸以及L-谷氨酸鹽含量均下調；煙酸酯和煙酰胺代謝通路中，煙酰胺D-核糖核苷酸以及煙酰胺含量均下調。

表1 卵期給藥72 h涉及到的3個代謝通路有差異的代謝物信息Table 1 Specific information of the different metabolites of the 3 metabolic pathways after 72 h exposure during embryo

L4時期給藥24 h所涉及到的通路結果示于圖3，圖中所示編號信息列于表2。所涉及顯著性水平較高的前3個通路有：嘌呤代謝通路、氨?；?tRNA的生物合成通路，以及煙酸酯和煙酰胺代謝通路。其中，與空白組相比，嘌呤代謝通路中腺嘌呤、黃嘌呤、鳥苷、鳥嘌呤、黃嘌呤5′-磷酸、肌苷以及ADP含量均下調，尿酸含量上調；氨?；?tRNA的生物合成通路中，L-蛋氨酸、L-異亮氨酸、L-酪氨酸 、L-谷氨酸鹽以及L-脯氨酸含量均下調；煙酸酯和煙酰胺代謝通路中，煙酰胺D-核糖核苷酸以及煙酰胺含量均下調。

表2 L4時期給藥24 h涉及到3個代謝通路有差異的代謝物信息Table 2 Specific information of the different metabolites of the 3 metabolic pathways after 24 h exposure during L4 larva

L4時期給藥2 h所涉及到的通路結果示于圖4，圖中所示編號信息列于表3。所涉及顯著性水平較高的前3個通路有：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成通路，苯丙氨酸代謝通路以及嘌呤代謝通路。與空白組相比，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成通路中，L-酪氨酸和L-苯丙氨酸含量下調；苯丙氨酸代謝通路中，L-酪氨酸以及L-苯丙氨酸含量均下調；嘌呤代謝通路中，腺嘌呤、腺苷琥珀酸、鳥苷、黃嘌呤、黃嘌呤5′-磷酸、ADP以及cGMP含量均下調。

注：a.嘌呤代謝通路；b.精氨酸和脯氨酸代謝；c.煙酸酯和煙酰胺代謝通路圖2 卵期給藥72 h通路結果 Fig.2 Pathway results of 72 h exposure during embryo

續(xù)表2

表3 L4時期給藥2 h涉及到3個代謝通路有差異的代謝物信息Table 3 Specific information of the different metabolites of the 3 metabolic pathways after 2 h exposure during L4 larva

從以上結果可以看出，3個加藥時期共同的通路是嘌呤代謝通路以及與氨基酸代謝相關的通路，且均與能量代謝相關。

在嘌呤代謝中，尿酸是人體嘌呤代謝的終末產物，尿酸含量過高可引起高尿酸血癥等疾病。在3個給藥時期中，除尿酸外，檢測到所有變化的代謝物含量均下調，并且下調趨勢幾乎是：卵期給藥>L4時期給藥24 h>L4時期給藥2 h。尿酸升高的原因可能是由于線蟲嘌呤代謝的增加，使嘌呤等物質含量下調，導致尿酸生成過高，也可能是由于尿酸排泄減少。

注：a.嘌呤代謝通路；b.氨?；?tRNA的生物合成通路；c.煙酸酯和煙酰胺代謝通路圖3 L4時期給藥24 h的通路結果 Fig.3 Pathway results of 24 h exposure during L4 larva

注：a.苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸的生物合成通路；b.苯丙氨酸代謝通路；c.嘌呤代謝通路圖4 L4時期給藥2 h通路結果Fig.4 Pathway results of 2 h exposure during L4 larva

在氨基酸代謝通路中，所有涉及氨基酸代謝通路有變化的代謝物含量均下調。蛋氨酸缺乏時，可導致食欲減退、生長減緩、肝壞死。異亮氨酸減少也會引起食欲減退，影響肌肉蛋白質代謝。精氨酸減少會導致血氨過高，甚至昏迷，影響生長發(fā)育。

3 結論

本文建立了超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜法分析去氫駱駝蓬堿的秀麗隱桿線蟲神經毒性模型的代謝物以及代謝通路變化。結果表明，在去氫駱駝蓬堿的線蟲神經毒性模型中，嘌呤代謝和氨基酸代謝等與能量相關的通路發(fā)生顯著變化，嘌呤代謝通路中尿酸含量升高，腺嘌呤、腺苷琥珀酸、鳥苷、黃嘌呤等代謝物含量下調；氨基酸代謝通路中，蛋氨酸、異亮氨酸、精氨酸等含量下調，且下降趨勢與給藥時間成正相關。本研究提示能量代謝與神經毒性的相關性，為下一步闡釋駱駝蓬總生物堿神經毒性機制提供了研究思路，也為駱駝蓬的體內安全性評價研究提供依據(jù)。