祁 奧，劉璐璐，張俊杰，張立堅(jiān)，蔡 春

(1.南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室(湛江)，廣東 湛江 524023；2.廣東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 湛江 524023)

腦卒中俗稱中風(fēng)，通常是由于腦部血管突然破裂或因血管阻塞導(dǎo)致血液不能正常流入大腦而引起腦組織損傷的一組急性腦血管疾病[1]。腦卒中具有高發(fā)病率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率和高死亡率的特點(diǎn)，可分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中2種亞型。其中，以急性腦缺血(ACI)為代表的缺血性腦卒中占我國(guó)腦卒中發(fā)病率的69.6%～70.8%。腦出血(ICH)是常見(jiàn)的出血性腦卒中，其占比僅次于急性腦缺血，且目前沒(méi)有相應(yīng)的治療藥物，因此該疾病的預(yù)后較差[2-3]。

目前對(duì)腦卒中的診斷主要依賴于核磁共振成像(MRI)、計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)以及血管成像等影像學(xué)方式，影像結(jié)果只能提供有無(wú)病灶情況，且檢測(cè)到的是具有相對(duì)大面積的異常腦組織，很難區(qū)分腦卒中的類(lèi)型，診斷結(jié)果相對(duì)滯后[4]。所以，臨床上需要特異性強(qiáng)、靈敏度高的生物指標(biāo)對(duì)該疾病進(jìn)行早期診斷。分子生物標(biāo)記物可以作為預(yù)測(cè)腦卒中風(fēng)險(xiǎn)的敏感指標(biāo)，生物標(biāo)記物的鑒定可以極大地促進(jìn)腦卒中病理生理學(xué)機(jī)制的研究[5]。

脂肪酸尤其是多不飽和脂肪酸，在輔助疾病的診斷和解釋疾病的發(fā)病機(jī)制方面越來(lái)越受到重視[6-7]。其中，類(lèi)二十烷酸又稱類(lèi)花生酸(eicosanoid)，是一類(lèi)由二十碳多不飽和脂肪酸氧化產(chǎn)生的具有生物活性的代謝物，是重要的炎癥因子，廣泛存在于體液和組織中，調(diào)節(jié)體內(nèi)眾多生理和病理過(guò)程[8-9]。炎癥反應(yīng)在腦卒中的病理生理過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[10]。腦卒中后，活化的外周免疫細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)在受損的大腦區(qū)域積聚[11-12]，進(jìn)而加劇了大腦屏障的破壞。有研究表明[13]，促炎介質(zhì)的減少和抗炎介質(zhì)的增加與更小的梗死面積和更好的腦卒中臨床結(jié)果有關(guān)。目前也有一些關(guān)于腦卒中脂肪酸脂質(zhì)相關(guān)的標(biāo)志物研究，羥基二十碳四烯酸(HETEs)是花生四烯酸的代謝產(chǎn)物，20-HETE在腦卒中患者血液中的濃度顯著升高且與其預(yù)后較差相關(guān)，可以作為腦卒中發(fā)生發(fā)展的潛在生物標(biāo)志物之一[8]；Hagiwara等[14]研究表明，二十碳五烯酸有改善血管內(nèi)皮的功能，對(duì)腦卒中具有保護(hù)作用。

超高效液相色譜-質(zhì)譜法(UPLC-MS)具有高通量、高分離效率及高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，在分析復(fù)雜的血漿成分及其代謝物的研究中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[15-16]。本研究通過(guò)課題組前期優(yōu)化后固相萃取技術(shù)萃取血漿中脂質(zhì)介質(zhì)[17]，采用UPLC-MS法靶向分析健康人、急性腦缺血患者以及腦出血患者的158種脂肪酸代謝物在血漿中的含量，結(jié)合多維統(tǒng)計(jì)分析和受試者工作曲線，篩選出潛在的腦卒中脂肪酸代謝標(biāo)志物，為腦卒中的診斷、缺血性和出血性腦卒中的快速區(qū)分提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 樣本與試劑

59位健康志愿者、60位急性腦缺血患者和36位腦出血患者的血漿樣品：由廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科提供，供液相色譜-質(zhì)譜分析。腦卒中患者的影像學(xué)資料示于圖1。腦卒中的納入標(biāo)準(zhǔn)為：1) 年齡在50～80歲；2) 有完整的腦磁共振成像或計(jì)算機(jī)斷層掃描檢查；3) 起病在14天以內(nèi)，入院前沒(méi)有經(jīng)過(guò)藥物的處理。排除標(biāo)準(zhǔn)：1) 嚴(yán)重心、肺、腎、肝功能不全患者；2) 既往有腫瘤病史或現(xiàn)發(fā)現(xiàn)腫瘤或可疑占位患者；3) 缺乏臨床檢驗(yàn)、影像學(xué)資料。另外，健康志愿者的血液樣本來(lái)自廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院體檢中心，納入標(biāo)準(zhǔn)為：1) 年齡在50～80歲；2) 腦動(dòng)脈血流動(dòng)力學(xué)正常；3) 腦磁共振成像或計(jì)算機(jī)斷層掃描檢查中沒(méi)有梗塞區(qū)域；4) 頸部血管彩色多普勒超聲檢查未見(jiàn)頸動(dòng)脈壁病變。樣本的具體臨床信息列于表1。

表1 樣本臨床信息表Table 1 Clinical information of samples

注：a.健康人;b.急性腦缺血；c.腦出血圖1 腦組織計(jì)算機(jī)斷層掃描Fig.1 Image of brain tissue by computed tomagraphy

前列腺素E代謝物-d6(tetranor-PGEM-d6)、6-酮-前列腺素F1α-d4(6-keto-PGF1α-d4)、血栓素B2-d4(TXB2-d4)、前列腺素F2α-d4(PGF2α-d4)、前列腺素E2-d4(PGE2-d4)、前列腺素D2-d4(PGD2-d4)、白三烯C4-d5(LTC4-d5)、白三烯B4-d4(LTB4-d4)、15(S)-羥基-5Z,8Z,11Z,13E-二十碳四烯酸-d8(15-HETE-d8)、12(S)-羥基-5Z,8Z,10E,14Z-二十碳四烯酸-d8(12-HETE-d8)、5(S)-羥基-6E,8Z,11Z,14Z-二十碳四烯酸-d8(5-HETE-d8)、血小板活化因子-d4(PAF-d4)、油酸乙醇酰胺-d4(OEA-d4)、二十碳五烯酸-d5(EPA-d5)、二十二碳六烯酸-d5(DHA-d5)、二十碳四烯酸-d8(AA-d8)16種同位素內(nèi)標(biāo)物：美國(guó)Cayman Chemical公司產(chǎn)品；乙腈、甲酸、甲醇：德國(guó)Merck公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與裝置

島津8045系列UPLC-MS：日本島津公司產(chǎn)品；液相分析色譜柱Kinetex C8(2.1 mm×150 mm×2.6 μm)：美國(guó)Phenomenex公司產(chǎn)品；3K-15臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；恒溫混勻儀：杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司產(chǎn)品；XW-80A型漩渦混合器：上海精科實(shí)驗(yàn)有限公司產(chǎn)品；超純水系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品；Strata-X固相萃取柱(10 mg)：美國(guó)Phenomenex公司產(chǎn)品。

1.3 內(nèi)標(biāo)溶液配制

取16種同位素標(biāo)準(zhǔn)品液，分別加入甲醇定容，配制成10 mg/L的同位素脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，于-20 ℃保存。使用時(shí)，用甲醇稀釋，制成濃度為100 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液。

1.4 血漿樣品的脂質(zhì)介質(zhì)萃取

取100 μL血漿于2 mL EP管中，加入1 mL甲醇和10 μL 100 μg/L內(nèi)標(biāo)，在4 ℃下混合10 min，然后以15 000 r/min離心5 min，回收上清液于10 mL EP管中；添加4 mL 0.1%甲酸溶液，混勻，待提取。SPE柱萃取過(guò)程如下：先用1 mL甲醇活化SPE固相萃取柱，再用1 mL 0.1%甲酸溶液平衡柱子，然后開(kāi)始加樣進(jìn)行脂質(zhì)提取，接著分別使用1 mL 0.1%甲酸和1 mL 15%乙醇溶液淋洗柱子，最后用200 μL甲醇洗脫，收集洗脫液，待進(jìn)樣分析。

1.5 實(shí)驗(yàn)條件

1.5.1色譜條件 色譜柱：Kinetex C8(2.1 mm×150 mm×2.6 μm)柱；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；色譜柱柱溫：40 ℃；梯度洗脫：0～10 min(10%B)，10～20 min(35%B)，20～20.1 min(75%B)，20.1～25.1 min(95%B)，25.1～30 min(10%B)。

1.5.2質(zhì)譜條件 離子化方式：ESI源正、負(fù)離子模式；霧化氣流量：3 L/min；干燥氣流量：10 L/min；加熱氣流量：10 L/min；脫溶劑管(DL)溫度：250 ℃；加熱模塊溫度：400 ℃；接口溫度：300 ℃；碰撞誘導(dǎo)解離(CID)氣壓力：230 kPa。

1.6 數(shù)據(jù)分析

1.6.1數(shù)據(jù)預(yù)處理 剔除信噪比(S/N)小于3的數(shù)據(jù)；16種同位素內(nèi)標(biāo)按照校準(zhǔn)后的保留時(shí)間將所有檢測(cè)到的組分分為16組，將各組待測(cè)化合物的峰面積除以相應(yīng)組分的內(nèi)標(biāo)峰面積進(jìn)行峰面積標(biāo)準(zhǔn)化校正，再對(duì)該數(shù)值進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換(log10)，以實(shí)現(xiàn)正態(tài)分布。

1.6.2多維統(tǒng)計(jì)分析 標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)集分為建模集和驗(yàn)證集。將建模集的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P14.0軟件，選擇最優(yōu)的數(shù)據(jù)模型進(jìn)行建模分析，用R2Y和Q2(cum)評(píng)估所建立模型的質(zhì)量，R2Y表示模型的適用性，一般越接近1越好，Q2(cum)表示模型的預(yù)測(cè)能力，一般大于0.5表示模型的預(yù)測(cè)能力良好[18-19]。建模成功后，再挑選VIP值大于1且P<0.05的組分，作為能區(qū)分2組的候選差異物質(zhì)。然后檢驗(yàn)上述建模組里篩選出來(lái)的差異物質(zhì)在驗(yàn)證集的變化情況，用Benjamini-Hochberg方法對(duì)P值進(jìn)行矯正，篩選出校正后P<0.05的組分作為后續(xù)分析的潛在生物標(biāo)志物。

1.6.3ROC評(píng)估候選標(biāo)志物的診斷能力 為評(píng)估篩選得到的候選標(biāo)志物，本研究使用受試者工作曲線(ROC)對(duì)候選標(biāo)志物進(jìn)行分析。ROC曲線可用于比較物質(zhì)對(duì)疾病的診斷能力。ROC圖中，曲線下的面積(AUC)值范圍是0.5～1。在AUC>0.5的情況下，AUC越接近于1，診斷效果越好。

2 結(jié)果與討論

2.1 UPLC-MS分析

使用島津8045 UPLC-MS的極性切換功能達(dá)到電噴霧正負(fù)離子模式的同時(shí)檢測(cè)。158種脂肪酸及其代謝產(chǎn)物中包括87種花生四烯酸(AA)及其代謝物、18種二十碳五烯酸(EPA)及其代謝物、16種二十碳六烯酸(DHA)及其代謝物、11種乙醇酰胺類(lèi)化合物、23種其他脂肪酸代謝物、血小板活化因子(PAF)、溶血血小板活化因子(Lyso-PAF)、壬二酰化的血小板活化因子(Azelaoyl-PAF)以及16種內(nèi)標(biāo)化合物。將158種化合物與各內(nèi)標(biāo)物洗脫時(shí)間接近的化合物分為一組，具體的化合物信息及分類(lèi)情況列于附表1(請(qǐng)登錄《質(zhì)譜學(xué)報(bào)》官網(wǎng)http:∥www.jcmss.com.cn下載)。質(zhì)譜檢測(cè)采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式，一共包含174個(gè)MRM離子對(duì)，其中，AA、DHA、13-HODE的色譜圖示于圖2。

圖2 健康人(a,b,c)，急性腦缺血患者(d,e,f)，腦出血患者(g,h,i)的AA,DHA,13-HODE的色譜圖Fig.2 Chromatograms of AA, DHA, 13-HODE of health (a, b, c), ACI (d, e, f), ICH (g, h, i)

2.2 脂肪酸候選標(biāo)志物的篩選

將經(jīng)過(guò)各組內(nèi)標(biāo)化合物校正后的峰面積組成的數(shù)據(jù)集分為建模集和驗(yàn)證集。建模集一共包含46例樣本，即17例健康人、18例急性腦缺血患者、11例腦出血患者；驗(yàn)證集一共包含109例樣本，即42例健康人、42例急性腦缺血患者、25例腦出血患者。

在建模集里使用SIMCA-P14.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行建模分析。首先采用主成分分析(PCA)以“無(wú)監(jiān)督”分析形式檢查分組趨勢(shì)和離群值。PCA在分析數(shù)據(jù)時(shí)未知每個(gè)樣本的分組，單純根據(jù)數(shù)據(jù)的特征進(jìn)行分析，但由于代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的復(fù)雜性，特別是對(duì)于組間差異不夠明顯的樣品，單純的“無(wú)監(jiān)督”分析并不能很好地區(qū)分樣本的組間差異。我們?cè)赑CA得分圖中雖然未觀察到健康人組與腦卒中組、ACI與ICH之間有明確的分離趨勢(shì)，示于圖3a、3b，但是也沒(méi)有極端異常的樣本需要排除。

為了提高模型的解析能力和有效性，濾除與分類(lèi)信息無(wú)關(guān)的噪音，本研究進(jìn)一步采用正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)，組與組之間呈現(xiàn)出了清晰的分離趨勢(shì)，示于圖3c、3d。然后使用VIP值篩選出能引起組內(nèi)分離和聚類(lèi)的代謝物。VIP值為變量對(duì)模型的重要性，描述了每個(gè)變量對(duì)模型的總體貢獻(xiàn)，通常設(shè)定篩選標(biāo)準(zhǔn)為VIP>1，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，滿足該條件的表示這個(gè)變量對(duì)模型的分離效果貢獻(xiàn)值很大。在健康人組和腦卒中組中，篩選到了5種可用于診斷腦卒中的潛在生物標(biāo)志物；在ACI組和ICH組中，篩選到了9種可用于區(qū)分這2種中風(fēng)亞型的潛在標(biāo)志物，示于圖4。

2.3 潛在生物標(biāo)志物的聚類(lèi)分析

篩選到的差異性脂質(zhì)分子在組內(nèi)個(gè)體中的全局表達(dá)量變化可以由熱圖直觀地呈現(xiàn)出來(lái)，顏色的深淺表示化合物在個(gè)體中的表達(dá)量高低，顏色越紅，表達(dá)量越高，示于圖5。理論上，如果樣本來(lái)自于同一組，其特征應(yīng)該是相似的，在進(jìn)行聚類(lèi)的時(shí)候就很容易聚在一起。在健康人組和腦卒中組中，花生四烯酸在腦卒中組中的表達(dá)顯著上調(diào)，9，10-二羥基-12-十八碳烯酸(9,10-DiHOME)、13(S)-過(guò)氧羥基-(9S，11E)-十八碳二烯酸(13-HpODE)、16-羥基二十二碳六烯酸(16-HDoHE)、二十二碳六烯酸在腦卒中組中的表達(dá)顯著下調(diào)。在ACI和ICH中，20-羥基-白三烯B4(20-hydroxy-LTB4)、8-異-15酮-前列腺素2α(8-iso-15-keto-PGF2α)、17，18-二羥基-二十碳五烯酸(17,18-DiHETE)、5，6-二羥基--二十碳三烯酸(5,6-DHET)、13-羥基-9，11-十八碳二烯酸(13-HODE)、17，18-環(huán)氧二十碳四烯酸(17,18-EpETE)、16-羥基二十二碳六烯酸(16-HDoHE)、15-羥基二十碳-5Z，8Z，11Z，13E-四烯酸(15-HpETE)、二十二碳六烯酸等9種物質(zhì)在ICH中均是上調(diào)的。

注:a.健康人組vs腦卒中組；b.急性腦缺血組vs腦出血組；c.健康人組vs腦卒中組(R2Y=0.913，Q2(cum)=0.797)；d.急性腦缺血組vs腦出血組(R2Y=0.959，Q2(cum)=0.791)圖3 PCA得分圖(a,b)和OPLS-DA得分圖(c,d)Fig.3 PCA score plots (a,b) and OPLS-DA score plots (c,d)

注：a.健康人組vs腦卒中組；b.急性腦缺血組vs腦出血組圖4 潛在生物標(biāo)志物的VIP得分圖Fig.4 VIP score plots of potential biomarkers

注：a.健康人組vs腦卒中組；b.急性腦缺血組vs和腦出血組；*：P<0.05；**：P<0.01圖5 顯著差異性脂質(zhì)分子聚類(lèi)熱圖Fig.5 Cluster heat map of lipid molecules with significant differences

2.4 生物標(biāo)志物的驗(yàn)證及ROC分析

為了進(jìn)一步確認(rèn)在建模集中篩選到的潛在生物標(biāo)志物的準(zhǔn)確性，本研究在驗(yàn)證集中對(duì)上述顯著差異性脂質(zhì)分子進(jìn)行了獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果表明，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且變化趨勢(shì)與建模集一致，示于圖6。同時(shí)，構(gòu)建了ROC曲線評(píng)估這些候選標(biāo)志物的診斷能力。在能區(qū)分健康人組和腦卒中組的5種顯著差異性脂質(zhì)分子中，有2個(gè)脂質(zhì)分子的AUC大于0.8，即AA(AUC:0.997)、13-HpODE(AUC:0.832)，表明其具有良好的診斷價(jià)值，示于圖7。在能特異性區(qū)分ACI和ICH的9種物質(zhì)中，有3個(gè)脂質(zhì)分子的AUC大于0.8，分別是20-hydroxy-LTB4(AUC:0.980)、13-HODE(AUC:0.890)、17,18-EpETE(AUC:0.880)，示于圖8。

應(yīng)用單指標(biāo)分析脂肪酸及其代謝產(chǎn)物對(duì)腦卒中組和健康組的區(qū)分度后，本實(shí)驗(yàn)采用ROC曲線和Logistic回歸評(píng)價(jià)了多種指標(biāo)在腦卒中的診斷價(jià)值。

注：a.健康人組vs腦卒中組；b.急性腦缺血組vs和腦出血組；*：P<0.05；**：P<0.01圖6 建模集中篩選的顯著差異性脂質(zhì)分子在驗(yàn)證集的表達(dá)情況Fig.6 Expression of significantly different lipid molecules screened of the modeling set in the verification set

注：a.9,10-DiHOME;b.13-HpODE;c.16-HDoHE;d.DHA;e.AA;f.AA+13-HpODE圖7 健康人組和腦卒中組的候選生物標(biāo)志物的受試者工作曲線Fig.7 Receiver operating characteristic curves of candidate biomarkers between health and the stroke

注：a.20-hydroxy-LTB4;b.8-iso-15-keto-PGF2α;c.17,18-DiHETE;d.5,6-DHET;e.13-HODE;f.17,18-EpETE;g.16-HDoHE;h.15-HpETE;i.DHA;j.20-hydroxy-LTB4+13-HODE;k.20-hydroxy-LTB4+17,18-EpETE;l.20-hydroxy-LTB4+13-HODE+17,18-EpETE圖8 急性腦缺血和腦出血的候選生物標(biāo)志物的受試者工作曲線Fig.8 Receiver operating characteristic curves of candidate biomarkers between ACI and ICH

在健康組和腦卒中組中，將AUC較高的AA和13-HpODE組成一個(gè)診斷組合，經(jīng)Logistic回歸分析后，得到該組合對(duì)疾病的診斷概率值，然后以此概率值計(jì)算該診斷組合的AUC。聯(lián)合AA和13-HpODE對(duì)腦卒中的診斷評(píng)價(jià)，其AUC是0.996，該結(jié)果與單獨(dú)使用AA診斷腦卒中的能力基本一致。同理，在區(qū)分ACI和ICH時(shí)，選擇了AUC較高的幾種脂肪酸形成3個(gè)診斷組合：20-hydroxy-LTB4和13-HODE、20-hydroxy-LTB4和17,18-EpETE、20-hydroxy-LTB4和13-HODE以及17,18-EpETE。結(jié)果表明，20-hydroxy-LTB4聯(lián)合17,18-EpETE的診斷性能與單獨(dú)使用20-hydroxy-LTB4的相同，20-hydroxy-LTB4、13-HODE和17,18-EpETE等3個(gè)組分的聯(lián)合與20-hydroxy-LTB4和13-HODE 2個(gè)組分的聯(lián)合診斷價(jià)值一致，但略高于單獨(dú)使用20-hydroxy-LTB4，示于圖8。結(jié)果表明，聯(lián)合使用20-hydroxy-LTB4和13-HODE是特異性區(qū)分急性腦缺血和腦出血的最佳組合(AUC:0.990)。

2.5 討論

與炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)的脂質(zhì)代謝的改變是心腦血管疾病中硬化斑塊形成及其相關(guān)病理變化的主要驅(qū)動(dòng)因素之一[20]。研究結(jié)果表明，脂肪酸結(jié)合代謝組學(xué)的方法能夠區(qū)分腦卒中患者與健康人之間的差異，此外，通過(guò)比較急性腦缺血患者和腦出血患者血漿的脂肪酸代謝物質(zhì)，篩選并評(píng)估出3個(gè)能夠區(qū)分這2種腦卒中亞型的潛在生物標(biāo)志物。

上述篩選到的一些差異脂肪酸及其代謝產(chǎn)物主要富集在AA、LA(亞油酸)、EPA以及DHA的代謝途徑中，示于圖9。其中，AA、LA屬于ω-6系列的多不飽和脂肪酸，DHA、EPA屬于ω-3系列。這些多不飽和脂肪酸是神經(jīng)、內(nèi)分泌以及免疫系統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)，能夠改變細(xì)胞膜的流動(dòng)性，影響神經(jīng)遞質(zhì)的合成及釋放，而且ω-3和ω-6系列的多不飽和脂肪酸在多種疾病中發(fā)揮著重要的藥理作用[21-22]。

本研究觀察到腦卒中患者血漿中AA的表達(dá)水平顯著升高，DHA的表達(dá)水平顯著下降。AA和DHA是神經(jīng)細(xì)胞膜磷脂中常見(jiàn)的多不飽和脂肪酸。AA代謝物的主要作用是促進(jìn)急性炎癥反應(yīng)，與急性中風(fēng)、全腦缺血、蛛網(wǎng)膜下腔出血和抗凝相關(guān)的出血轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，也有研究報(bào)道[23-24]，食用過(guò)多的AA會(huì)增加梗死的風(fēng)險(xiǎn)。DHA是神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞生長(zhǎng)及維持的一種主要成分，其在大腦中的積累與神經(jīng)炎癥的減少和抗凋亡途徑的激活有關(guān)[25]。DHA可通過(guò)脂氧合酶途徑代謝轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩锘钚缘闹|(zhì)分子，如保護(hù)素、消退素等，這類(lèi)物質(zhì)的生理功能有強(qiáng)大的免疫特性，有助于消炎和清除炎癥相關(guān)組織損傷[26-27]。本研究還觀察到腦卒中血漿中DHA的代謝產(chǎn)物16-HDoHE相較于健康人顯著下降，這可能與腦卒中后的不良預(yù)后有關(guān)。Edin等[28]報(bào)道，9,10-DiHOME能增加腦缺血后的冠狀動(dòng)脈阻力，顯著降低腦缺血后的功能恢復(fù)，13-HpODE會(huì)減少細(xì)胞的氧化磷酸化，且可能有促進(jìn)細(xì)胞色素P450的抗氧化反應(yīng)和解毒作用的能力[29]，這兩者都是亞油酸的氧化產(chǎn)物。本研究中，9,10-DiHOME在腦卒中血漿中的表達(dá)量是下降的，這可能與機(jī)體的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制有關(guān)；13-HpODE在腦卒中的表達(dá)降低可能與疾病的不良預(yù)后有關(guān)。

在評(píng)估能區(qū)分急性腦梗死和腦出血的候選生物標(biāo)志物時(shí)，本研究結(jié)果表明，20-hydroxy-LTB4的AUC高達(dá)0.980，是最具潛力區(qū)分腦卒中分型的物質(zhì)。LTB4是白三烯類(lèi)化合物，羥基化改變了LTB4的物理特性，降低了非特異性的細(xì)胞結(jié)合，因此20-OH-LTB4作為細(xì)胞外效應(yīng)物具有更大的潛力，并且可以比LTB4更準(zhǔn)確地視為激素。20-OH-LTB4是BLT受體的弱激動(dòng)劑，具有對(duì)嗜中性粒細(xì)胞和LTB4的共同結(jié)合特性，腦出血中高水平的20-OH-LTB4可能與BLT受體的激活有關(guān)，BLT受體可以增強(qiáng)血管通透性并促進(jìn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和炎性細(xì)胞粘附[30]。此外，13-HODE(AUC:0.890)、17,18-EpETE(AUC:0.880)也具有良好的特異性區(qū)分這2種腦卒中分型的能力。13-HODE是亞油酸的氧化產(chǎn)物，研究表明，內(nèi)源性的HODEs具有一定的病理生理學(xué)作用，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化和乳腺癌等疾病的發(fā)生發(fā)展具有促進(jìn)作用[31-32]。本研究結(jié)果顯示，腦出血中高水平的13-HODE可能表明該物質(zhì)對(duì)腦卒中的發(fā)生發(fā)展有一定的促進(jìn)作用。17,18-EpETE是EPA的代謝產(chǎn)物，其具有有效的抗過(guò)敏和抗炎特性，且有一定的限制線粒體損傷的細(xì)胞保護(hù)作用[33-34]。腦出血后，各種炎癥因子會(huì)在大腦受損區(qū)域聚集，過(guò)度的炎癥反應(yīng)可能會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體的抗炎機(jī)能增加，以利于清除炎癥因子，使受損的腦組織得以修復(fù)。在本研究結(jié)果中，17,18-EpETE在腦出血中的表達(dá)量增高可能與機(jī)體的抗炎機(jī)能增加有關(guān)。

注：PLA2：磷脂酶2；COX：環(huán)氧合酶；CYP：細(xì)胞色素P450酶；a.亞油酸異構(gòu)酶；b.CYP1A2；c.水解酶；d.亞油酸8R-脂氧合酶；e.LOX1-5；f.LOX2S；g.酰基-CoA去飽和酶；h.CYP2B6；i.ALOX5；j.CYP4F2;k.ALOX15；l.COX1；m.NADP+圖9 花生四烯酸、亞油酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸的相關(guān)代謝通路Fig.9 Metabolic pathways related to arachidonic acid, linoleic acid, eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA)

3 結(jié)論

本研究通過(guò)靶向脂肪酸代謝組學(xué)結(jié)合UPLC-MS分析技術(shù)，診斷和區(qū)分腦卒中不同亞型。結(jié)果表明，AA和13-HpODE是診斷腦卒中的敏感指標(biāo)；20-hydroxy-LTB4、13-HODE、17,18-EpETE能特異性區(qū)分急性腦缺血和腦出血這2種腦卒中亞型。該結(jié)果為脂肪酸類(lèi)生物標(biāo)志物在腦卒中的診斷及其分型區(qū)分，以及發(fā)病機(jī)理的研究提供了科學(xué)依據(jù)。