劉宗元，朱松標(biāo)，鄧海騰，陳宇凌

(1.清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100084；2.生物信息學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100084)

鑒定活性小分子的靶標(biāo)蛋白不僅可以建立活性小分子與細(xì)胞表型之間的聯(lián)系，闡明活性小分子的作用機(jī)理，還可以發(fā)現(xiàn)活性小分子的脫靶效應(yīng)及可能的適應(yīng)癥，并在藥物開發(fā)的早期階段預(yù)測潛在的副作用和毒性，從而降低研發(fā)失敗的風(fēng)險(xiǎn)?；钚孕》肿影袠?biāo)的鑒定是藥物研發(fā)的關(guān)鍵步驟之一，也是分析化學(xué)發(fā)展的重要領(lǐng)域。親和色譜-質(zhì)譜技術(shù)是活性小分子靶標(biāo)鑒定的標(biāo)準(zhǔn)方法，但需對小分子進(jìn)行化學(xué)修飾，可能導(dǎo)致小分子的活性降低或改變，影響藥物與靶蛋白的結(jié)合。近年來，不依賴化學(xué)修飾的活性小分子靶標(biāo)鑒定技術(shù)迅速發(fā)展，主要是基于活性小分子與靶標(biāo)蛋白結(jié)合引起的蛋白穩(wěn)定性變化，從而改變靶標(biāo)蛋白對酶促水解反應(yīng)、化學(xué)變性和熱變性的耐受程度。這些鑒定方法包括藥物親和反應(yīng)靶標(biāo)穩(wěn)定性(DARTS)、蛋白質(zhì)氧化速率穩(wěn)定性(SPROX)、細(xì)胞熱位移測定(CETSA)、熱蛋白質(zhì)組分析(TPP)[1]。TPP技術(shù)基于與配體結(jié)合可增加目標(biāo)蛋白在高溫下的穩(wěn)定性，造成目標(biāo)蛋白隨溫度的溶解曲線發(fā)生偏移這一原理，結(jié)合高分辨定量質(zhì)譜技術(shù)，可在細(xì)胞裂解物、細(xì)胞、組織甚至動(dòng)物等多層面上實(shí)現(xiàn)對小分子靶標(biāo)蛋白的鑒別，具有重要的應(yīng)用前景[2-3]。鑒于TPP技術(shù)在操作上的復(fù)雜性，獲得可靠和可重復(fù)的TPP數(shù)據(jù)仍然非常困難。

7，8-二氫-8-氧鳥嘌呤三磷酸酶(MTH1)通過清除氧化受損的核苷酸，防止DNA復(fù)制時(shí)氧化堿基造成的DNA損傷，是細(xì)胞應(yīng)對ROS引起DNA損傷的關(guān)鍵酶[4]。研究表明，在腫瘤細(xì)胞中抑制MTH1的活性，增加氧化核苷酸摻入 DNA的頻率，會導(dǎo)致堿基錯(cuò)配、基因突變和細(xì)胞死亡的發(fā)生[4,9]。更重要的是，MTH1是腫瘤細(xì)胞生存所必需的，而正常細(xì)胞的生存并不依賴MTH1的表達(dá)，因此MTH1的抑制能特異性地遏制癌細(xì)胞的生長。作為MTH1的第一代抑制劑，TH588是在最早篩選出的含有2-氨基嘧啶結(jié)構(gòu)的候選藥物小分子上添加了氨基環(huán)丙基得到的小分子，可有效抑制 MTH1的催化活性，并在體內(nèi)外均具有高度的代謝穩(wěn)定性[4]。研究表明，TH588對腫瘤細(xì)胞具有毒性，但具體的作用機(jī)制卻存在爭議[5-8]。TH588在納摩爾濃度條件下即可較好地抑制MTH1活性，但其發(fā)揮抗癌作用并不依賴于MTH1。例如，研究人員開發(fā)了多種其他的MTH1抑制劑(BAY-707、NPD7155、NPD9948等)，但對人源癌細(xì)胞系并無殺傷作用[7-8,10]；在腫瘤細(xì)胞中敲除MTH1，無法抑制細(xì)胞增殖[7,11]；MTH1缺陷小鼠發(fā)生自發(fā)性癌癥的概率顯著增加[12]。與此同時(shí)，TH588具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)微管蛋白解聚，造成氧化損傷，并下調(diào)PI3K-AKT-mTOR軸等作用[13-16]?？梢?，在腫瘤細(xì)胞中除MTH1外，TH588還存在其他的作用靶標(biāo)，鑒定TH588的脫靶效應(yīng)對研究其抗腫瘤及造成機(jī)體不良反應(yīng)的作用機(jī)制具有重要意義。

本研究擬通過優(yōu)化TPP方法，在Hela細(xì)胞中鑒定TH588的直接靶點(diǎn)和間接靶點(diǎn)，為進(jìn)一步探究TH588抗腫瘤的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

UltiMate 3000液相色譜系統(tǒng)和Q Exactive HF-X質(zhì)譜儀：美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析儀(PCR儀)：美國ABI公司產(chǎn)品。

DMEM培養(yǎng)基、PBS緩沖液、青霉素/鏈霉素：中國Wisent公司產(chǎn)品；DMSO：中國索萊寶公司產(chǎn)品；胎牛血清：德國PAN公司產(chǎn)品；ECL化學(xué)發(fā)光液、PVDF膜：德國Millipore公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈、預(yù)染蛋白標(biāo)簽：均為質(zhì)譜級，美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；胰蛋白酶(質(zhì)譜級)：美國Promega公司產(chǎn)品；三(2-羧乙基)膦(tris(2-carboxyethyl)phosphine, TCEP)、氯乙酰胺(2-chloroacetamide, ClAA)、TH588和核酸酶(benzonase)：德國Sigma公司產(chǎn)品；MTH1抗體：英國Abcam公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

在含10% FBS和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，將Hela細(xì)胞置于含5% CO2的37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱。

1.3 細(xì)胞裂解物的提取

Hela細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，用PBS洗滌2次，被重懸于含有蛋白酶抑制劑的PBS中，充分研磨裂解細(xì)胞。

1.4 細(xì)胞提取物的制備

將細(xì)胞懸液分為2組，分別加入10 μmol/L的TH588或DMSO，25 ℃水浴15 min后，每組均分成10份，按照37、40.4、44、46.9、49.8、52.9、55.5、58.6、62、66.3 ℃溫度梯度分別加熱3 min，于25 ℃孵育3 min，取出后加入終濃度250 U/mL核酸酶和0.8% NP-40，4 ℃下旋轉(zhuǎn)孵育1 h。蛋白溶液以47 900 r/min超速離心20 min，取蛋白上清用于后續(xù)的蛋白質(zhì)免疫印跡分析和基于TMT標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析。

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡分析

向蛋白上清中加入4×蛋白上樣緩沖液(含DTT)，使用SDS-PAGE分離，通過濕轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)至甲醇活化過的PVDF膜上。PVDF膜使用含5%脫脂奶粉的TBST封閉，與一抗于4 ℃孵育過夜，經(jīng)TBST洗滌3次后，與二抗于室溫孵育1 h。PVDF膜上經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光液顯色，Bio-Rad凝膠成像儀顯影成像。

1.6 基于TMT標(biāo)記定量的蛋白質(zhì)組學(xué)

向蛋白上清中加入5倍體積冰丙酮，于-20 ℃放置4 h，以9 100 r/min離心棄去上清。蛋白沉淀通過8 mol/L尿素復(fù)溶，加入10 mmol/L TCEP和40 mmol/L ClAA進(jìn)行還原烷基化，之后以酶∶蛋白=1∶50加入胰蛋白酶，于37 ℃酶解過夜。酶切后的樣品經(jīng)Sep-Pak tC18除鹽后，使用TMT10標(biāo)試劑進(jìn)行標(biāo)記，反應(yīng)終止后混合并除鹽，使用pH 10的HPLC體系對混合肽段進(jìn)行組分分離，揮干后保存于-80 ℃，待質(zhì)譜分析。

1.7 LC-MS/MS分析及數(shù)據(jù)處理

多肽樣品通過液相系統(tǒng)分離，質(zhì)譜儀檢測。液相梯度洗脫程序：0～120 min(5%～55%B)。A為100%水-0.1%甲酸，B為80%ACN-0.08%甲酸，流速0.250 μL/min。質(zhì)譜儀通過Xcalibur 3.0軟件進(jìn)行操作，一級質(zhì)譜的分辨率60 000，質(zhì)量掃描范圍m/z300～1 800，最大注入時(shí)間50 ms，自動(dòng)增益控制(AGC)3×106；二級掃描在數(shù)據(jù)依賴的采集模式(DDA)下運(yùn)行，每個(gè)一級掃描后有最多40個(gè)二級掃描，分辨率45 000，高能碰撞解離(HCD)碎裂模式，歸一化碰撞能量(NCE)35，最大注入時(shí)間100 ms，AGC 1×105；二級掃描的分離窗口m/z0.4，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間15 s。

質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用Proteome Discoverer Software 2.3中的SEQUEST搜索引擎進(jìn)行分析。參數(shù)設(shè)置如下：胰蛋白酶全切，最多允許2個(gè)漏切位點(diǎn)；修飾半胱氨酸上烷基化，肽段N端和賴氨酸上的TMT10標(biāo)修飾設(shè)置為固定修飾；甲硫氨酸上的氧化修飾和蛋白N端的乙?；O(shè)置為可變修飾；一級質(zhì)譜誤差范圍為2×107，二級質(zhì)譜誤差設(shè)置為20 mmu；假陽性率FDR基于q-value，設(shè)置為小于1%，Xcorre>3；只使用特異性的肽段進(jìn)行蛋白定量分析，蛋白定量基于肽段比例進(jìn)行；使用 Uniprot人類蛋白數(shù)據(jù)庫(2019.11下載，共20 302個(gè)序列)進(jìn)行搜庫分析。

搜庫結(jié)果以最低溫度條件作為參照，計(jì)算不同溫度點(diǎn)蛋白量的倍數(shù)變化，基于R語言下TPP R包[15-16]進(jìn)行S型曲線擬合，并基于如下條件進(jìn)行過濾：DMSO和TH588處理后的蛋白質(zhì)熔解曲線，R2>0.8；DMSO曲線的平臺期<0.3；配對的DMSO和TH588處理的蛋白質(zhì)熔解曲線最陡斜率<-0.06；2次DMSO重復(fù)之間每種蛋白質(zhì)的熔點(diǎn)變化(ΔTm)<1.5 ℃。通過過濾條件的蛋白，根據(jù)2次ΔTm均大于1.5，以及TH588與DMSO的ΔTm大于2個(gè)DMSO組間的ΔTm這2個(gè)條件，篩選TH588的靶標(biāo)蛋白。

2 結(jié)果與討論

2.1 TPP實(shí)驗(yàn)中TH588濃度的確定

前期實(shí)驗(yàn)顯示，不是所有的蛋白都表現(xiàn)出隨溫度升高而穩(wěn)定性逐漸下降的現(xiàn)象，小分子結(jié)合對蛋白熱穩(wěn)定性的影響也表現(xiàn)出較大的差異。在TPP實(shí)驗(yàn)中，小分子濃度的選擇尤為重要，過低的濃度可能導(dǎo)致一些結(jié)合力相對較低的靶標(biāo)蛋白無法被鑒定到，而過高的濃度則會增加假陽性率，給后續(xù)數(shù)據(jù)分析和靶標(biāo)驗(yàn)證造成困難。為了確定最合適的TH588藥物濃度，并為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供質(zhì)量控制指標(biāo)，首先利用Western Blotting評估了TH588對其靶標(biāo)MTH1熱穩(wěn)定性的影響。

將細(xì)胞裂解液分別以44、47、50、53、56、59、63、67 ℃的溫度梯度進(jìn)行加熱，經(jīng)超速離心去除沉淀后，取等量上清液進(jìn)行蛋白免疫印跡分析，用于確定高溫對MTH1穩(wěn)定性的影響，結(jié)果示于圖1a。可見，隨著溫度升高，溶解于上清液中的MTH1總量呈下降趨勢，并且在56 ℃時(shí)已經(jīng)減少了50%以上。因此，最終選取56 ℃用于TH588藥物最佳濃度的測試分析。

圖1 溫度梯度(a)和濃度梯度(b)處理下，MTH1的免疫印跡結(jié)果Fig.1 Western blot results of MTH1 treated with different temperatures (a) and different TH588 concentrations (b)

本實(shí)驗(yàn)向細(xì)胞裂解液中分別加入0、0.1、0.5、1、5、10、50、100、500、1 000 μmol/L TH588，于25 ℃孵育15 min后，56 ℃加熱3 min。超速離心去除沉淀后，取等量上清液進(jìn)行蛋白免疫印跡分析，結(jié)果示于圖1b?？梢?，隨著TH588濃度的升高，MTH1在56 ℃的溶解度呈劑量依賴性地逐漸增加，在10～1 000 μmol/L時(shí)，MTH1的溶解度基本持平，10 μmol/L TH588即可充分保護(hù)蛋白，抵抗溫度升高造成的蛋白變性。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇10 μmol/L TH588作為后續(xù)TPP實(shí)驗(yàn)的濃度。

2.2 TH588在Hela細(xì)胞中靶標(biāo)的檢測

以上實(shí)驗(yàn)已證明了TH588可以保護(hù)作用靶點(diǎn)MTH1，增加其在加熱條件下的穩(wěn)定性，并確定了10 μmol/L作為TPP實(shí)驗(yàn)的TH588濃度。本研究將使用Hela的細(xì)胞裂解物進(jìn)行TPP實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)一步確定TH588的脫靶靶點(diǎn)。

在25 ℃下，加入TH588或DMSO的細(xì)胞裂解樣品孵育15 min后，將蛋白溶液分成10份，分別在37～66.3 ℃范圍內(nèi)的10個(gè)不同溫度條件下，嚴(yán)格控制3 min的加熱時(shí)間，并以47 900 r/min超速離心將不溶蛋白去除，取等體積的蛋白溶液進(jìn)行基于10標(biāo)TMT標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析。同時(shí)，為了嚴(yán)格控制樣品質(zhì)量，確保質(zhì)譜分析前蛋白樣品的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，選取部分蛋白溶液進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，證實(shí)在這批樣品中TH588增加了MTH1在高溫下的溶解性。本研究利用R語言中的TPP程序包對質(zhì)譜分析結(jié)果進(jìn)行解析，對2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)分別進(jìn)行蛋白的熔解曲線擬合、擬合度過濾和熔點(diǎn)計(jì)算。

2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)分別檢測到5 546個(gè)和5 705個(gè)蛋白，其中同時(shí)鑒定到5 141個(gè)蛋白。與預(yù)期相符，大多數(shù)蛋白隨著溫度的升高而減少，并且在TH588組與DMSO組中沒有顯著差異，示于圖2。根據(jù)Savitski等[14-15]的方法，對數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選和蛋白熔解曲線的繪制，并計(jì)算熔點(diǎn)(Tm)，即單一蛋白變性沉淀50%時(shí)的溫度，2次實(shí)驗(yàn)分別計(jì)算出3 630個(gè)和3 873個(gè)蛋白的Tm，其中有3 248個(gè)蛋白在2次實(shí)驗(yàn)中均出現(xiàn)。分別計(jì)算2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中所有蛋白的Tm值相關(guān)性，并繪制不同實(shí)驗(yàn)組間的相關(guān)性分布圖，示于圖3?？芍蟛糠值鞍椎腡m值在不同的實(shí)驗(yàn)組間具有高度的相關(guān)性，表明本次實(shí)驗(yàn)具有良好的重復(fù)性。

圖2 處理組(TH588)和對照組(DMSO)中所有蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性熱圖Fig.2 Thermostability heat maps of all proteins treated with TH588 or DMSO in two replicated experiments

圖3 不同實(shí)驗(yàn)組中蛋白Tm的相關(guān)性分布的矩陣散點(diǎn)圖Fig.3 Matrix scatter of protein Tm correlations in two replicated experiments

本研究計(jì)算了蛋白在TH588組和DMSO組之間的Tm差值，得到了3 248個(gè)蛋白的熔點(diǎn)差ΔTm。MTH1作為TH588的已知靶點(diǎn)，在2次實(shí)驗(yàn)中，ΔTm分別為1.89、5.81 ℃，均發(fā)生了明顯的正向偏移，即TH588的加入顯著增加了MTH1在高溫下的穩(wěn)定性，提高了其熔點(diǎn)，示于圖4a。雖然大多數(shù)小分子的結(jié)合可以使靶標(biāo)蛋白的ΔTm升高，但前期結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，部分蛋白在小分子處理組的Tm較對照組出現(xiàn)下降的情況，將這類蛋白稱為小分子的間接靶標(biāo)，該類蛋白可能會與小分子的直接靶標(biāo)蛋白存在結(jié)合作用，小分子的結(jié)合占據(jù)了直接靶標(biāo)蛋白，使該類蛋白失去了直接靶標(biāo)蛋白在加熱條件下對其保護(hù)的作用，因此ΔTm下降。本研究遵循2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，ΔTm均大于1.5 ℃(直接靶標(biāo)蛋白)或均小于-1.5 ℃(間接靶標(biāo)蛋白)的篩選標(biāo)準(zhǔn)，確定了28個(gè)直接靶標(biāo)蛋白和53個(gè)間接靶標(biāo)蛋白，分別列于表1和表2。通過在線網(wǎng)站STRING(https:∥www.string-db.org/)對鑒定到的TH588直接靶標(biāo)和間接靶標(biāo)進(jìn)行相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果示于圖5?？梢钥闯?，中間區(qū)域蛋白網(wǎng)絡(luò)相對密集，表示TH588能夠影響該區(qū)域的蛋白互作。其中，RAN、SNRPB2、CPSF3、DDX39A、ZC3H11A、NUP214等與mRNA和蛋白在細(xì)胞內(nèi)的加工和轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)。有報(bào)道證明[18]，TH588可能通過影響有絲分裂中紡錘體調(diào)節(jié)的通路來抑制腫瘤增殖，同時(shí)在功能聚類中發(fā)現(xiàn)SEH1L、RACGAP1、WAPAL等與有絲分裂相關(guān)的蛋白，提示TH588的脫靶功能可能通過影響細(xì)胞分裂來抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

表1 TPP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的TH588在Hela細(xì)胞中的直接靶標(biāo)Table 1 Direct targets of TH588 in Hela cells found in the TPP experiment

表2 TPP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的TH588在Hela細(xì)胞中的間接靶標(biāo)Table 2 Indirect targets of TH588 in Hela cells found in the TPP experiment

2.3 TH588在PI3K-Akt通路中的功能分析

研究表明[15]，TH588可降低AKT和 4EBP1的磷酸化水平，以及EGFR和IGFR的表達(dá)，抑制PI3K-Akt通路，降低腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CDC37和HSP90B1可與TH588直接結(jié)合，示于圖4b、4c。熱休克蛋白90(HSP90)是一種保守的分子伴侶，有數(shù)百種蛋白質(zhì)底物，除參與蛋白質(zhì)折疊外，還參與包括DNA修復(fù)、發(fā)育、免疫反應(yīng)和神經(jīng)退行性疾病在內(nèi)的多種細(xì)胞過程，是維持真核細(xì)胞在生理和壓力條件下蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。HSP90B1是HSP90蛋白家族成員之一，參與蛋白的穩(wěn)定和折疊，并在分泌蛋白質(zhì)的加工和運(yùn)輸中發(fā)揮作用。HSP90可通過與多種伴侶蛋白結(jié)合發(fā)揮作用，CDC37是目前研究最深入的底物特異性伴侶蛋白之一，其作用主要與蛋白激酶的激活相關(guān)，CDK4，Akt等激酶的成熟依賴于CDC37-HSP90伴侶復(fù)合物[17]。TH588與CDC37和HSP90的結(jié)合可能會影響CDC37-HSP90復(fù)合物的形成，阻止其對Akt的招募與磷酸化，下調(diào)PI3K-Akt通路，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。

圖4 MTH1(a)、CDC37(b)、HSP90B1(c)、TUBB(d)和PPP4R2(e)的熔解曲線Fig.4 Melting curves of MTH1 (a), CDC37 (b), HSP90B1 (c), TUBB (d) and PPP4R2 (e)

續(xù)表2

注：灰色圓圈代表直接靶標(biāo)；白色圓圈代表間接靶標(biāo)；蛋白間連線表示已有報(bào)道的相互作用圖5 TH588的靶標(biāo)蛋白網(wǎng)絡(luò)分析圖Fig.5 Network analysis of target proteins of TH588

2.4 TH588在微管形成中的功能分析

微管蛋白是構(gòu)成微管的結(jié)構(gòu)單元，在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、染色體分離和細(xì)胞遷移等多種細(xì)胞過程中起著重要作用。研究表明[18]，TH588是一種微管調(diào)節(jié)劑，可導(dǎo)致微管蛋白解聚，阻斷有絲分裂，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果顯示，TH588可與TUBB和PPP4R2發(fā)生直接結(jié)合作用，分別示于圖4d、4e。作為9種人源β-微管蛋白之一，TUBB與微管的組成直接相關(guān)，其表達(dá)降低可增加肺腺癌細(xì)胞對紫杉醇等化療藥的敏感性。PPP4R2是蛋白磷酸酶4(PPP4C)的調(diào)節(jié)亞基之一，與PPP4C形成復(fù)合物，在中心體微管組織中心調(diào)節(jié)PPP4C的活性，參與微管生長、細(xì)胞凋亡和腫瘤壞死因子信號傳導(dǎo)等生物學(xué)過程。TH588與TUBB的相互作用可能直接阻止微管的組裝，與PPP4R2的結(jié)合可能會影響PPP4R2-PPP4C復(fù)合物的形成，破壞PPP4R2對PPP4C的活性調(diào)節(jié)，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡。

3 結(jié)論

本研究系統(tǒng)地介紹了TPP技術(shù)的工作流程，通過對已有靶點(diǎn)蛋白熔點(diǎn)和最佳藥物濃度的優(yōu)化，確定TPP實(shí)驗(yàn)的溫度范圍和藥物刺激濃度，并應(yīng)用該方法鑒定了TH588的作用靶標(biāo)，發(fā)現(xiàn)了28個(gè)直接靶標(biāo)和53個(gè)間接靶標(biāo)，有助于加深對TH588抗癌作用機(jī)制的理解。