秦少杰，繆代禹，白 玉，劉虎威

(北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，北京分子科學(xué)國家實(shí)驗(yàn)室，生物有機(jī)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100871)

生物體中的核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子以及大量小分子代謝物參與了生命活動的整個(gè)過程，對其進(jìn)行超靈敏檢測，不僅為準(zhǔn)確理解細(xì)胞乃至生物體內(nèi)生命活動內(nèi)在機(jī)制提供了必要的基礎(chǔ)信息，也為臨床的早期診斷、疾病發(fā)展?fàn)顟B(tài)的跟蹤以及預(yù)后提供了重要的診治依據(jù)。生物分子種類繁多，其中具有指示性作用的生物標(biāo)志物在生物樣本中的含量往往較低，而且所處基質(zhì)復(fù)雜，使超靈敏檢測極具挑戰(zhàn)。雖然光譜、電化學(xué)、核磁等分析技術(shù)為生物標(biāo)志物的分析提供了重要工具，但是囿于其靈敏度、分析通量以及分析速度的限制，無法滿足生物分子的超靈敏檢測需求。

質(zhì)譜法具有高靈敏度、高通量、分析速度快等優(yōu)勢，且可以通過二級甚至多級質(zhì)譜對物質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，目前已廣泛應(yīng)用于蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等方面。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)法重現(xiàn)性好、定量和定性能力強(qiáng)，分析對象范圍寬，在生物分子檢測方面應(yīng)用較成熟，如非靶向代謝組學(xué)的鑒定和篩選[1]，糖基化修飾肽段的定性和定量分析等[2]。上述工作通常需要較冗雜的前處理步驟，對起始樣本量有一定要求，隨著分析需求的不斷提高，分析樣本用量逐漸減小，這對現(xiàn)有質(zhì)譜檢測方法和技術(shù)的分析靈敏度提出了更高挑戰(zhàn)，成為現(xiàn)階段質(zhì)譜在生命分析化學(xué)領(lǐng)域所面臨的一大難題。

針對上述問題，研究人員通過設(shè)計(jì)信號放大/轉(zhuǎn)移/增敏的策略，將待測物信號轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N或幾種響應(yīng)強(qiáng)的質(zhì)譜信號，利用兩者之間存在的定量關(guān)系，實(shí)現(xiàn)待測物信號的間接檢出，以提高方法的檢測靈敏度。該思路的普適性強(qiáng)，可以應(yīng)用于生物大分子以及小分子代謝物的檢測，信號增強(qiáng)效果通常可達(dá)幾個(gè)數(shù)量級以上，很大程度上解決了超微量生物樣本中標(biāo)志物的分析需求，為單細(xì)胞研究提供了重要的方法基礎(chǔ)。

綜上，本文主要聚焦應(yīng)用信號放大策略實(shí)現(xiàn)質(zhì)譜超靈敏檢測的方法及其在生物檢測方面的應(yīng)用。根據(jù)信號放大策略的不同以及質(zhì)譜離子化方式的差異，對近年來發(fā)展的質(zhì)譜技術(shù)和方法進(jìn)行總結(jié)與歸類，按照放大策略將其分為轉(zhuǎn)化、衍生化以及數(shù)量擴(kuò)增3大類；按照離子化方式分為基于電噴霧、激光解吸附以及電感耦合等離子體3大類。與此同時(shí)，本文從研究手段、放大策略以及應(yīng)用角度等方面進(jìn)行總結(jié)，最后基于質(zhì)譜超高靈敏檢測的發(fā)展現(xiàn)狀對未來提出展望。

1 基于噴霧的電離模式

基于噴霧的電離模式包含電噴霧電離(ESI)及在其基礎(chǔ)上發(fā)展的誘導(dǎo)電噴霧(induced ESI)和納升電噴霧(nanoESI)等方式。該類電離方式具有搭建相對簡便、質(zhì)譜儀器適配性強(qiáng)和前端樣本處理生物相容性好等特點(diǎn)。然而，受限于敞開的大氣電離環(huán)境和有限的離子傳輸效率，常壓條件下生物樣本中超痕量生物標(biāo)志物的分析仍然具有挑戰(zhàn)性。通過結(jié)合信號的捕獲、轉(zhuǎn)化/衍生化和信號放大策略，可顯著提升分析方法的靈敏度，助力超痕量生物樣本乃至單細(xì)胞層面的目標(biāo)物分析研究。

核酸是生命體的遺傳物質(zhì)，其電離效率隨聚合度的增加而降低，基于質(zhì)譜的核酸大分子分析能力有限。為解決這一問題，蔣健暉等[3]提出將檢測靈敏度較低的DNA轉(zhuǎn)化為質(zhì)譜響應(yīng)更強(qiáng)的核苷酸，憑借單核苷酸較高的檢測靈敏度和nanoESI的高電離效率，成功實(shí)現(xiàn)DNA甲基化水平的超靈敏質(zhì)譜分析。與之類似，張新祥等[4]利用毛細(xì)管電泳分離并富集消化后的單核苷酸，從125 pg DNA樣品中分析了5-甲基胞嘧啶(5mC)和5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)的含量，并進(jìn)一步將該方法用于RNA中修飾堿基的檢測[5]。不同于降解轉(zhuǎn)化高聚物的策略，陳蕓等[6-8]通過檢測肽段間接分析目標(biāo)核酸，利用與短鏈非編碼RNA(miRNA)互補(bǔ)的DNA探針特異性識別目標(biāo)miRNA，隨后酶切與探針共價(jià)相連的肽段釋放信號肽用于質(zhì)譜檢測，實(shí)現(xiàn)了多肽序列編碼的miRNA質(zhì)譜分析。將互補(bǔ)DNA探針置換為核酸適配體，該方法可用于人表皮生長因子2(HER2)等生物標(biāo)志物的檢測[9]，助力疾病診斷和藥效評價(jià)。此外，季銨鹽類化合物憑借出眾的電離效率常被用作報(bào)告離子。Badu-Tawiah等[10]將季銨鹽報(bào)告離子與抗體共價(jià)偶聯(lián)，在紙噴霧基底上完成免疫識別過程，通過滴加氨水，高效釋放pH敏感的報(bào)告離子，實(shí)現(xiàn)了瘧疾抗原以及2種腫瘤標(biāo)志物的超靈敏檢測，示于圖1a。

圖1 基于噴霧電離模式的信號放大策略[10,16,18,24]Fig.1 Signal amplification strategies based on electrospray ionization[10,16,18,24]

相較于信號轉(zhuǎn)化策略，化學(xué)衍生化策略在質(zhì)譜分析中的使用更廣泛。張新祥等開發(fā)了基于肼基三嗪的堿基衍生化策略，通過肼基與醛基、羧基的縮合反應(yīng)標(biāo)記5-醛基胞嘧啶(5fC)、5-羧基胞嘧啶(5caC)[11]和5hmC[12]，顯著提高了稀有堿基的檢測靈敏度。與之類似，袁必鋒等[13]利用季銨鹽修飾的碳二亞胺同時(shí)衍生8種堿基，將檢測限降低3個(gè)數(shù)量級。在此基礎(chǔ)上，他們進(jìn)一步設(shè)計(jì)靶向磷酸基團(tuán)的重氮喹啉衍生試劑[14]，在正離子模式下鑒定到12種游離三磷酸核苷，揭示了肝細(xì)胞癌與游離三磷酸核苷表達(dá)量的相關(guān)性。除了稀有堿基需要一定的增敏手段外，蛋白質(zhì)在質(zhì)譜檢測時(shí)同樣需要高效的富集方法或衍生化策略。黃光明等[15]應(yīng)用點(diǎn)擊化學(xué)，將季銨鹽衍生的氰基苯并噻唑與半胱氨酸共價(jià)偶聯(lián)，開發(fā)了針對半胱氨酸和末端為半胱氨酸的肽段[16]的新型檢測方法，示于圖1b。該方法應(yīng)用誘導(dǎo)電噴霧質(zhì)譜對復(fù)雜生物樣品中特定蛋白質(zhì)和肽段進(jìn)行定量分析，線性范圍為100 amol～10 nmol，并進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞中游離半胱氨酸的快速檢測。對于單細(xì)胞中代謝物的研究，郭寅龍等[17]利用酶促脫氫衍生化反應(yīng)，在nanoESI噴針中將D-乳酸轉(zhuǎn)化為質(zhì)譜響應(yīng)更強(qiáng)的吡啶鹽類化合物，將其與同質(zhì)荷比的L-乳酸區(qū)分，為超痕量手性異構(gòu)體的質(zhì)譜分析提供了新方法。聚糖較普通的手性化合物具有更復(fù)雜的同分異構(gòu)體，其高靈敏分析更具挑戰(zhàn)。Lageveen-Kammeijer等[18]應(yīng)用Girard’s P試劑將末端還原性糖衍生為吡啶鹽，提升其檢測靈敏度；同時(shí)，通過酯化-氨解唾液酸將其衍生為中性基團(tuán)，構(gòu)建了可兼顧構(gòu)型的低豐度糖組學(xué)分析方法，示于圖1c。唾液酸的衍生化旨在屏蔽羧酸陰離子，提升其在正離子模式下的響應(yīng)信號。Kema等[19]采用類似方法，使用丙酸酐原位衍生兒茶多酚類化合物以屏蔽酚羥基，大幅提升靈敏度的同時(shí)減少了血漿樣本的需求，為L-多巴、多巴胺和腎上腺素等代謝物的臨床監(jiān)測提供了新思路。

除了上述基于信號轉(zhuǎn)化和衍生化的方法，對檢測對象或信號分子進(jìn)行數(shù)量上的擴(kuò)增，通過信號放大同樣能夠?qū)崿F(xiàn)高靈敏檢測。2016年，Marshall等[20]運(yùn)用質(zhì)譜檢測酶聯(lián)免疫法(ELISA)的產(chǎn)物，通過酶促反應(yīng)實(shí)現(xiàn)信號分子數(shù)量上的擴(kuò)增，提出了酶聯(lián)免疫質(zhì)譜法(ELIMSA)。劉一鳴等[21]將微流控技術(shù)與解吸附電噴霧離子源(DESI)相結(jié)合，應(yīng)用循環(huán)酶法擴(kuò)增產(chǎn)生大量的報(bào)告分子，使亞皮摩爾量級miRNA的質(zhì)譜檢測成為可能。與之相似，羅海等[22]利用核酸外切酶開發(fā)出一種無基質(zhì)雙重放大方法，該方法使用三重探針構(gòu)建擴(kuò)增體系，由靶標(biāo)DNA或核酸適配體啟動擴(kuò)增，放大倍數(shù)超過600。等溫?cái)U(kuò)增作為一類特殊的酶法擴(kuò)增，具有特異性強(qiáng)、放大倍數(shù)高、發(fā)展相對成熟等優(yōu)點(diǎn)，多用于基于等溫?cái)U(kuò)增的熒光或電化學(xué)超靈敏分析。2021年，盧建忠等[23]報(bào)道了等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在質(zhì)譜分析中的應(yīng)用，借助核酸擴(kuò)增和降解轉(zhuǎn)化雙重放大策略，成功檢測了50 amol的miRNA。除酶法擴(kuò)增外，還可借助納米顆粒作為功能化基底，利用其良好的可修飾性、穩(wěn)定性與較高的比表面積，實(shí)現(xiàn)其上大量質(zhì)譜標(biāo)簽的修飾，將超痕量生物分子的直接檢測轉(zhuǎn)化為數(shù)百倍乃至數(shù)千倍的增敏質(zhì)譜標(biāo)簽的檢測，顯著提升目標(biāo)生物分子的檢測靈敏度。此外，多數(shù)納米粒子具有較好的生物相容性，可廣泛應(yīng)用于生物樣本中低豐度物質(zhì)的痕量檢測。2019年，本課題組設(shè)計(jì)并合成了基于氧雜蒽母核的系列質(zhì)譜標(biāo)簽[24]，將特異性抗體/適配體和質(zhì)譜標(biāo)簽組裝在金納米顆粒表面合成質(zhì)譜探針。在完成目標(biāo)蛋白質(zhì)的探針識別后，利用自行搭建的電噴霧加速的基底噴霧離子化質(zhì)譜進(jìn)行檢測，高速電噴霧噴射樣本表面，可實(shí)現(xiàn)大量質(zhì)譜標(biāo)簽分子的原位解離和實(shí)時(shí)檢測。本方法將蛋白生物標(biāo)志物的檢測限降低了7個(gè)數(shù)量級，實(shí)現(xiàn)了zmol水平生物標(biāo)志物的定量分析。在此基礎(chǔ)上，本課題組進(jìn)一步將該方法應(yīng)用于單細(xì)胞分析，通過質(zhì)譜探針實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞蛋白質(zhì)的檢測，與單細(xì)胞代謝物實(shí)時(shí)分析相結(jié)合，構(gòu)建了多維度有機(jī)質(zhì)譜流式細(xì)胞平臺,示于圖1d[25]。與現(xiàn)有的無機(jī)質(zhì)譜流式細(xì)胞儀相比，該平臺首次實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞層面上代謝物和蛋白質(zhì)的同時(shí)分析，并大大降低了抗體偶聯(lián)稀土元素所需的成本，為單細(xì)胞多維度、多參數(shù)分析提供了有力工具。該方法成功檢測了5種腫瘤細(xì)胞/細(xì)胞亞型中6種目標(biāo)蛋白和近百種代謝物，不僅實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞和細(xì)胞亞型的精準(zhǔn)分型，也為腫瘤耐藥異質(zhì)性的分子機(jī)制提供了相關(guān)分子信息。欒天罡等[26]進(jìn)一步將基于功能性金納米顆粒的信號放大策略與紙噴霧質(zhì)譜相結(jié)合，采用化學(xué)解離的方式釋放質(zhì)譜探針，實(shí)現(xiàn)了前列腺抗原以及癌胚抗原等多種標(biāo)志物的高效檢測。Baird等[27]應(yīng)用類似的免疫捕集-信號放大-化學(xué)解離策略，使用功能化二氧化硅納米顆粒檢測了全血中稀有細(xì)胞，為臨床快速檢驗(yàn)提供了新方法。

通過結(jié)合信號轉(zhuǎn)化、衍生化和信號放大等策略，在基于噴霧類質(zhì)譜檢測超痕量樣品中低濃度生物分子方面取得了重要進(jìn)展。信號轉(zhuǎn)化策略能夠規(guī)避檢測對象穩(wěn)定性差、靈敏度低等缺點(diǎn)，并通過檢測物種的轉(zhuǎn)化顯著提升分析靈敏度；但目前的信號轉(zhuǎn)化策略大多基于分子雜交的放大實(shí)現(xiàn)核酸分析，對于蛋白質(zhì)和代謝物等分子的信號轉(zhuǎn)化方法有待進(jìn)一步開發(fā)。衍生化策略能夠大幅提升目標(biāo)物的檢測靈敏度，但其選擇性和廣譜性受到反應(yīng)基團(tuán)的限制，在有限體積的復(fù)雜樣品中難以實(shí)現(xiàn)高特異性衍生化，在組學(xué)水平上較難實(shí)現(xiàn)無歧視的衍生。不同的信號放大策略為低含量分子的超靈敏檢測提供了更多可能，但如何提高信號放大的普適性，從而增加蛋白質(zhì)等生物分子檢測通量，仍然是未來需要著重突破的難點(diǎn)。

2 基于激光解吸附的電離模式

基于激光解吸附的MALDI/LDI質(zhì)譜技術(shù)具有靈敏度高、鹽容忍度高、空間分辨率好以及較強(qiáng)的非靶向檢測能力等優(yōu)點(diǎn)，在生物組織以及細(xì)胞中的代謝物、脂質(zhì)以及蛋白質(zhì)和肽段的檢測中發(fā)揮著重要作用。盡管如此，由于生物大分子較低的離子化效率，目前借助該方法僅能對一些高豐度的蛋白[28]以及肽段[29]進(jìn)行檢測，檢測靈敏度仍十分有限。因此，如何將被檢測分子信號轉(zhuǎn)移或放大，提高檢測靈敏度，實(shí)現(xiàn)微量生物樣本甚至是單細(xì)胞水平的檢測仍極具挑戰(zhàn)。2003年，Mirkin等[30]首次提出了利用基于納米顆粒的生物標(biāo)簽對蛋白質(zhì)進(jìn)行超靈敏檢測。通過在磁性納米顆粒表面組裝靶標(biāo)蛋白的抗體與DNA序列，與靶標(biāo)蛋白識別后進(jìn)行磁分離，進(jìn)而通過去雜交的方式將釋放的單鏈DNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增與檢測。該方法可實(shí)現(xiàn)30 amol/L的前列腺抗原檢測，相比于常規(guī)的臨床檢測方法，檢測限降低了6個(gè)數(shù)量級。此外，利用類似的模式，該方法還可實(shí)現(xiàn)DNA 的檢測[31]。對于信號響應(yīng)更強(qiáng)的質(zhì)譜標(biāo)簽，除了短鏈核酸序列外，可裂解的有機(jī)小分子標(biāo)簽由于具有設(shè)計(jì)性更強(qiáng)、體積更小、離子化效率更高等優(yōu)勢，與超靈敏質(zhì)譜結(jié)合具備更強(qiáng)大的檢測能力。劉寶紅等[32]將PEG鏈作為質(zhì)譜標(biāo)簽組裝在金納米顆粒表面，利用巰基的光可裂解性以及Au納米本身的基質(zhì)作用，通過LDI/MS實(shí)現(xiàn)信號放大與轉(zhuǎn)移，實(shí)現(xiàn)了模式蛋白凝血酶以及表皮黏附因子EpCAM在血清環(huán)境中的超靈敏檢測，示于圖2a，在此基礎(chǔ)上，將磁性顆粒引入體系中[33]，通過形成三明治免疫結(jié)構(gòu)減少非特異吸附，并借助磁性分離提高分離效率。Cooks等[34]將該方法應(yīng)用于稀有的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)的檢測。相關(guān)工作也有一些報(bào)道[35-41]。該方法還可實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞蛋白質(zhì)的檢測，即單個(gè)MCF-7細(xì)胞表面的EpCAM蛋白、細(xì)胞角蛋白19 (CK19)和粘蛋白1(muc1)的相對定量[42]。但此類方法的檢測靈敏度仍有限，且樣本需要送入真空完成激光解吸附過程，分析通量受限。此外，雖然可通過內(nèi)標(biāo)校正，但方法的重復(fù)性和準(zhǔn)確性仍有待進(jìn)一步提升。

在上述工作的基礎(chǔ)上，利用多重信號放大的思路還可將檢測靈敏度進(jìn)一步提升。林金明等[43]通過等溫滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)技術(shù)進(jìn)行了信號的二次放大，提高了120個(gè)凝血酶分子的檢出靈敏度。除了利用質(zhì)譜標(biāo)簽進(jìn)行信號放大外，利用酶催化底物的特性也可以實(shí)現(xiàn)信號的轉(zhuǎn)移和放大。Schellenberger等[44]將自制的20種肽段底物混合溶液噴灑至組織表面，反應(yīng)一段時(shí)間后，通過產(chǎn)物生成量來反映組織層面的十幾種蛋白酶、激酶以及磷酸化酶的空間分布以及活性變化，示于圖2b[45]。Zenobi等[46]將酶混合溶液噴灑至靶板表面，實(shí)現(xiàn)核心代謝物ATP/ADP的檢測。

基于激光解吸附離子化質(zhì)譜的空間分辨率可達(dá)幾微米，可用于組織表面的高分辨微區(qū)成像。Lim等[47]將免疫組織化學(xué)(IHC)與MALDI-MS相結(jié)合，示于圖2c，在抗體表面共價(jià)結(jié)合了可裂解的質(zhì)譜標(biāo)簽與熒光基團(tuán)，在與常規(guī)免疫熒光的結(jié)果互相驗(yàn)證的前提下，實(shí)現(xiàn)了對小鼠腦部以及人體扁桃體和乳腺癌切片的成像，同時(shí)獲得一些代謝物的信息。

圖2 基于激光解吸附類電離的信號放大策略[32,44,47-48]Fig.2 MALDI/LDI based signal amplification strategies[32,44,47-48]

除了增強(qiáng)蛋白質(zhì)檢測信號外，對于很多質(zhì)譜響應(yīng)較差的代謝物和生物標(biāo)志物，發(fā)展與之相關(guān)的衍生化策略以提高其檢出能力也是非常有效的手段。Fletcher等[48]利用吡啶硼酸陽離子與鄰二羥基的特異性縮合反應(yīng)，對組織表面的兒茶酚胺等4種代謝物進(jìn)行了原位衍生化，并利用LDI/GCIB-TOF-SIMS雙重檢測方式，實(shí)現(xiàn)了豬腎上腺組織的高分辨成像，示于圖2d。林金明等[49]利用凝集素與細(xì)胞表面糖鏈的特異性相互作用，在凝集素的一端修飾長鏈DNA引物，通過RCA方式實(shí)現(xiàn)信號擴(kuò)增，進(jìn)而利用MALDI-TOF MS實(shí)現(xiàn)短鏈DNA probe的釋放和檢測，最終實(shí)現(xiàn)了MCF-7細(xì)胞表面α-d-甘露糖基和β1-6N-乙酰葡萄糖胺的成像。由于細(xì)胞中糖合成的過程需要從外界攝入原料，因此，可借助代謝標(biāo)記的策略提高糖鏈以及糖蛋白的檢出能力。聶宗秀等[50]通過click反應(yīng)將激光可裂解探針(Tphsene)與攜帶正交標(biāo)記基團(tuán)的唾液酸類糖蛋白耦合，最終檢測限可低至約500個(gè)Hela細(xì)胞。

基于信號放大策略的MALDI/LDI-MS超靈敏檢測，使用最廣泛的方法是在納米顆粒上負(fù)載質(zhì)譜標(biāo)簽來實(shí)現(xiàn)信號放大，進(jìn)而通過引入新的識別方法及改造質(zhì)譜標(biāo)簽結(jié)構(gòu)以滿足不同的檢測需求。針對某一類蛋白質(zhì)或者代謝物，可結(jié)合本身的性質(zhì)，通過衍生化或者酶促反應(yīng)來間接實(shí)現(xiàn)這一目的。更重要的是，區(qū)別于其他離子化方式，MALDI/LDI-MS具有高空間分辨的特點(diǎn)，有望實(shí)現(xiàn)高分辨率下組織甚至單細(xì)胞中蛋白質(zhì)以及代謝物的檢測。

但是，由于基于激光解吸附的離子化方式通常需要在真空環(huán)境下進(jìn)行，以獲得高靈敏分析結(jié)果，給保持生物樣本的本征狀態(tài)帶來困難。因此，發(fā)展常壓MALDI/LDI方法可能是解決該問題的一個(gè)思路，但常壓下的檢測靈敏度損失也是不容忽視的問題；代謝物的衍生化策略以及蛋白質(zhì)的同時(shí)檢測數(shù)目有限對現(xiàn)有方法提出了進(jìn)一步挑戰(zhàn)；對于單細(xì)胞研究而言，如何進(jìn)一步提高空間分辨率和靈敏度，實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞甚至亞細(xì)胞器水平的質(zhì)譜成像，則是該領(lǐng)域所面臨的共同挑戰(zhàn)。

3 基于電感耦合等離子體電離

與基于激光的離子化方式不同，ICP-MS通過電感耦合的方式產(chǎn)生等離子體，在極高的火焰溫度下將待測物分子離子化，由于離子化效率高，蒸發(fā)能力強(qiáng)，尤其適用于檢測微量金屬元素。2002年，Tanner等[51]將攜帶金屬標(biāo)簽的抗體與靶標(biāo)蛋白相孵育，金屬標(biāo)簽與目標(biāo)蛋白通過免疫識別的作用相連，利用兩者含量間存在的對應(yīng)關(guān)系，通過ICP-MS定量分析金屬元素，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的定量。該方法本質(zhì)上是一種信號轉(zhuǎn)移和放大，可實(shí)現(xiàn)0.1 μg/L蛋白質(zhì)的檢測，如此高的靈敏度主要得益于ICP-MS對金屬元素的檢測敏感性。Tanner等[52]對ICP-MS裝置中的TOF部分進(jìn)行了改造，通過使用120 V正交加速器，在提高空間分辨率的同時(shí)，獲得了更快的采樣速度，每秒可以采集50 000張譜圖，能夠滿足單個(gè)細(xì)胞的多變量分析需求。將該技術(shù)進(jìn)一步優(yōu)化整合，推出了商業(yè)化的質(zhì)譜流式細(xì)胞儀—“mass cytometry”。Tanner與Nolan等[53]使用該儀器，將攜帶金屬標(biāo)簽的抗體與細(xì)胞孵育后，通過氬氣噴霧的形式將細(xì)胞懸液處理成單細(xì)胞液滴實(shí)現(xiàn)進(jìn)樣，之后進(jìn)入溫度高達(dá)5 500 K的等離子炬焰區(qū)進(jìn)行離子化過程，并利用ICP-MS對元素進(jìn)行定量分析。該實(shí)驗(yàn)利用34個(gè)標(biāo)記試劑對人骨髓中的免疫細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞表型及免疫信號響應(yīng)的深度分析，揭示了全新的藥物作用與人體造血免疫功能的聯(lián)系。除了對細(xì)胞懸液進(jìn)行分析，通過對質(zhì)譜流式方法進(jìn)行改進(jìn)，可以用于高分辨的組織成像。由于激光直徑只有1 μm，通過后續(xù)的單細(xì)胞成像分割軟件，即可實(shí)現(xiàn)多維單細(xì)胞成像與分析[54]。Bodenmiller在這一領(lǐng)域開展了一系列工作，其中相當(dāng)一部分工作是圍繞乳腺癌這一疾病展開的，通過對300多位乳腺癌患者的研究，發(fā)現(xiàn)了新的疾病亞型，并且與后期患者的生存曲線有很好的對應(yīng)關(guān)系[55]。除此之外，他們利用質(zhì)譜流式研究了腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞的關(guān)系，揭示了與免疫抑制相關(guān)的生態(tài)系統(tǒng)特征和不良預(yù)后[56]。

無機(jī)質(zhì)譜流式細(xì)胞儀還可實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞多組學(xué)研究，Nolan等[57]應(yīng)用臨近連接(proximity ligation)策略，設(shè)計(jì)與靶向mRNA序列互補(bǔ)的DNA探針，加入模板后通過RCA方式將探針延長，之后使用攜帶金屬元素的DNA probe進(jìn)行互補(bǔ)配對，這一路線與抗體孵育探針互不干擾。因此，可以實(shí)現(xiàn)30多種與細(xì)胞表型相關(guān)的蛋白與mRNA的同時(shí)檢測。利用該方法，Bodenmiller等[58]研究了與乳腺癌發(fā)病相關(guān)的蛋白質(zhì)與RNA表達(dá)水平的相關(guān)性。

基于無機(jī)質(zhì)譜的流式細(xì)胞儀可以實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞水平多維度和多組學(xué)的研究，這對于從系統(tǒng)生物學(xué)的角度去理解疾病機(jī)制、細(xì)胞分化以及信號傳導(dǎo)都具有重要的作用。但是，該方法的儀器和試劑昂貴，抗體的制備和修飾繁雜，且可能存在抗體的交叉反應(yīng)，更重要的是該類技術(shù)從原理上無法獲得直接反映細(xì)胞狀態(tài)的代謝物信息，限制了相關(guān)應(yīng)用的開展。

4 結(jié)論

本文根據(jù)離子化方式以及待測物種類的不同，對近年來基于信號放大策略的質(zhì)譜超靈敏檢測方法及其在生物分析中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述。方法都各具特色，且很好地提升了檢測能力和靈敏度，但同時(shí)存在各自的局限性：1) 檢測通量有限。在ICP-MS方法中尤為明顯，雖然相比于基于熒光信號輸出的方法，該方法不存在光譜重疊的影響，可同時(shí)檢出30種金屬元素，但這樣的通量仍無法滿足真正意義上的組學(xué)分析需求。而近期發(fā)展的有機(jī)質(zhì)譜流式方法，利用質(zhì)譜標(biāo)簽的結(jié)構(gòu)可拓展性，從理論上極大提高了分析通量，但這對質(zhì)譜標(biāo)簽的合成簡便性、結(jié)構(gòu)類似性、無離子化歧視等也提出了要求，目前正在進(jìn)一步發(fā)展和逐步完善中。針對代謝物的檢測，目前衍生化策略還只能針對某一類具有相似結(jié)構(gòu)的分子或特定的官能團(tuán)進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)和增敏，普適性面臨挑戰(zhàn)。因此，進(jìn)一步提高信號放大策略的檢測通量是非常重要的發(fā)展方向之一。2) 信號放大能力有待提高。雖然借助納米粒子較高的比表面積，可以實(shí)現(xiàn)上萬個(gè)質(zhì)譜標(biāo)簽的有序組裝，但解離過程同樣存在效率損失；目前借助各種信號放大策略，靈敏度達(dá)到了單細(xì)胞水平，而隨著研究的深入，針對單細(xì)胞器、甚至單分子水平的檢測則更具研究價(jià)值和挑戰(zhàn)。因此，如何進(jìn)一步提高信號放大能力，從而達(dá)到生命分析靈敏度的“天花板”，是一個(gè)值得思考的問題。3) 多組學(xué)兼容能力有待加強(qiáng)。從多組學(xué)角度對生物學(xué)問題進(jìn)行全面的解釋，已被越來越多的科研工作者所接受和認(rèn)同[59]，因此發(fā)展多組學(xué)分析技術(shù)對理解相關(guān)生物學(xué)問題提供了更嚴(yán)謹(jǐn)和整體的視角。截至目前，基于質(zhì)譜的多組學(xué)分析方法仍然非常有限，無機(jī)質(zhì)譜流式可實(shí)現(xiàn)基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀遺傳組以及蛋白質(zhì)組學(xué)的同時(shí)分析[60-61]。本課題組近期發(fā)展的多維度有機(jī)質(zhì)譜流式細(xì)胞分析方法，可實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞蛋白質(zhì)以及代謝組學(xué)的同時(shí)檢測[25]。因此，發(fā)展高通量、高內(nèi)涵的多組學(xué)質(zhì)譜分析新技術(shù)，也是該領(lǐng)域努力的目標(biāo)。

通過發(fā)展信號放大策略提高信號檢出靈敏度的方法尚處在發(fā)展階段，值得進(jìn)一步研究和深入挖掘，創(chuàng)新性方法的建立將推動生命分析領(lǐng)域朝著更精準(zhǔn)、更靈敏的方向發(fā)展。