龐 博，劉 舒，劉志強，劉淑瑩，宋鳳瑞

(1.中國科學院長春應用化學研究所，長春質譜中心&吉林省中藥化學與質譜重點實驗室，吉林 長春 130022；2.天津市產品質量監(jiān)督檢測技術研究院，天津 300384)

中醫(yī)藥歷經幾千年的發(fā)展，在疾病的預防和治療方面發(fā)揮了重要作用。然而，由于中藥成分的復雜性以及體內過程的多樣性，早期中藥相關研究受分析技術及方法學的制約。20世紀80年代出現的電噴霧電離質譜技術，將液相色譜與質譜相結合，極大推進了中藥現代化的發(fā)展進程。特別是液相色譜-質譜聯用技術與各種生物分析技術的不斷融合，大大擴展了質譜技術在現代中藥研究及生命科學領域的應用范圍，如微透析-液相色譜-質譜聯用技術將微透析實時、原位取樣的特點，與液相色譜-質譜聯用技術的快速分離、結構表征的優(yōu)勢相結合，近年來被廣泛用于中藥活性成分的篩選、中藥藥代動力學及作用機制等方面的研究[1-5]。本文將對以上應用進行概述。

1 微透析技術簡介

微透析是以膜透析原理為基礎的微量生物活體動態(tài)連續(xù)取樣技術[6]，早期主要用于神經科學領域。近年來，微透析技術已被成功應用于許多組織器官及體液的研究[4,7-9]。微透析取樣技術的原理圖示于圖1。實驗中選取與細胞外液組成相似的生理溶液作為灌流液，將含有半透膜結構的探針插入采樣組織，在灌流液恒速灌注過程中，由于半透膜兩側存在濃度差，小分子物質可以沿濃度梯度逐漸擴散并被灌流液不斷帶出，而蛋白質等生物大分子及與蛋白結合的非游離型藥物則不能通過半透膜，從而達到取樣的目的[10-11]。

圖1 微透析取樣示意圖Fig.1 Scheme of microdialysis sampling

微透析系統通常是由微量灌流泵、探針、連接管和樣品收集器組成。其中，微透析探針是微透析系統的核心部件，不同的探針膜長、內徑、截留分子質量范圍等參數可適用于不同的取樣環(huán)境。根據探針構造的不同，一般可分為線性探針、同心圓式探針、柔性探針和分流探針。線性探針主要適用于肝臟、肌肉、皮膚和脂肪等外周組織取樣。同心圓式探針是應用最多的一類探針，主要用于腦內神經科學研究，通常需要利用腦立體定位儀選定特定腦區(qū)，并在探針套管的引導下植入采樣部位。柔性探針的形態(tài)與同心圓式探針相似，但柔性更好，可隨實驗動物活動而彎曲，對取樣部位的組織損傷降到最低，適用于肌肉、皮膚、脂肪、血管和眼部等軟組織取樣，在血管中的應用最普遍，已廣泛用于清醒動物的藥代動力學研究。分流探針主要用于膽汁取樣，可避免取樣過程中的體液損失，并可實現長時間采樣。實際應用過程中，除了微透析探針的選擇，灌流液的組成、濃度、pH值等條件也要與細胞外液等滲且相近，并以恒速灌流，這樣可有效減少探針采樣部位周圍細胞外液組成的變化及其他物質的干擾，組織損傷較輕，在采樣過程中基本無體液損失[12-13]。

利用微透析技術既可以實現對同一組織的實時、連續(xù)監(jiān)測，也可以對不同組織或體液的多個位點進行監(jiān)測，包括內源性及外源性物質[2-5]。在藥物研究中，可以觀察到藥物在體內一定時間段的實時情況，有利于獲取藥物在體內的動力學信息[2-3,14-15]。通過微透析，使用較少的實驗動物就能夠獲得大量的實驗數據，減少了所需實驗動物的數量，有效降低了因動物個體差異而產生的實驗誤差。

由于通過微透析技術獲得的樣品量非常有限，待測物會受到體內生理環(huán)境等因素的影響，使常規(guī)分析技術的靈敏度和選擇性難以滿足要求。現代分析技術與微透析的離線及在線聯用大大拓寬了微透析技術的應用領域，特別是高效液相色譜-質譜聯用技術兼具快速、靈敏、高選擇性等優(yōu)點，與微透析技術的聯用使中藥復雜體系的研究如虎添翼。

2 微透析-液相色譜-質譜聯用技術在中藥研究中的應用

2.1 微透析-液相色譜-質譜聯用技術在中藥活性成分篩選中的應用

中藥活性成分與中藥的質量和療效密切相關。由于復雜的基質干擾，中藥活性成分的篩選及表征非常困難。微透析技術能夠利用半透膜將中藥小分子與蛋白等生物大分子分離。根據中藥小分子與生物體內靶分子間特異性結合的特點，微透析-液相色譜-質譜聯用技術通過比較有無生物靶分子加入時，溶液中處于游離狀態(tài)的中藥小分子濃度的變化來推斷其與靶分子之間的結合程度，并同時對與靶分子結合的中藥成分進行結構表征。利用該方法，Wang等[1]通過微透析取樣與液相色譜-四極桿-飛行時間質譜聯用，從梔子提取物中篩選出23種潛在的醛糖還原酶抑制劑。在緩沖液中作為生物靶分子的醛糖還原酶與中藥小分子結合形成復合物后，被微透析探針截留在膜外，未結合的中藥小分子則由于濃度梯度被灌流液帶出，進入透析液，示于圖2。該實驗分別收集梔子提取物和梔子提取物與醛糖還原酶共同孵育后的透析液，利用高效液相色譜-串聯質譜技術(LC-MS/MS)鑒定與醛糖還原酶結合的化合物，并計算出篩選的化合物與醛糖還原酶抑制劑的結合率。Pang等[16]以α-糖苷酶為生物靶點，建立了微透析結合液相色譜-串聯質譜法快速篩選黃芩提取物中α-糖苷酶抑制劑。Zhang等[17-18]以α-葡萄糖苷酶為靶分子，采用微透析-強度衰減質譜法對梔子及黃芩提取物的入血成分及代謝產物活性進行分析，確定了入血原型成分及代謝物與α-葡萄糖苷酶的結合親和力大小，該方法能排除復雜基質的干擾，有利于快速確定梔子及黃芩提取物中調節(jié)血糖的活性成分。

圖2 微透析-液相色譜-質譜聯用技術篩選梔子中醛糖還原酶抑制劑的示意圖[1]Fig.2 Schematic diagram of screening aldose reductase inhibitors in Gardenia jasminosides by microdialysis-LC-MS[1]

此外，Lei等[19]以土荊皮提取物和漢防己提取物與人乳腺癌細胞MCF-7相互作用為例，利用微透析技術取樣篩選中藥中多種活性成分。利用半透膜結構的探針分別從中藥提取物以及提取物和細胞共孵育后的體系中取樣，通過對比LC-MS分析得到的指紋圖譜中各成分的豐度差異，初步篩選出與細胞相互作用的活性成分，該研究巧妙地利用了微透析取樣技術能夠排除大分子物質干擾，僅小分子物質擴散至膜內的特點，簡化了樣品處理過程，實現了中藥活性成分的快速辨識。上述研究表明，微透析-液相色譜-質譜聯用技術可針對特定的疾病靶點(分子、細胞)對中藥活性成分進行高通量篩選，有利于從分子、細胞水平闡明藥物的作用機理，為疾病治療和新藥研發(fā)提供依據。

2.2 微透析-液相色譜-質譜聯用技術在中藥體外代謝研究中的應用

由于中藥成分復雜，其在體內發(fā)揮的療效和產生的毒副作用受代謝過程的影響很大。因此，明確中藥的代謝途徑及過程并結合藥理活性研究，不僅可以為合理用藥提供參考，也可為新藥的研發(fā)奠定基礎。與體內代謝研究相比，中藥的體外代謝模型可以排除體內復雜環(huán)境的干擾，更直接地對代謝過程進行監(jiān)測，可在短時間內獲得大量的代謝產物，為進一步闡明藥物的作用機制提供數據支持。其中，肝微粒體代謝和腸內菌培養(yǎng)是研究藥物體外代謝的兩種重要模型。

肝臟是藥物代謝的主要器官，肝微粒體含有大量的細胞色素P450(CYP450)，主要催化藥物肝臟Ⅰ相代謝[20-21]。Wen等[22]通過微透析取樣結合液相色譜-飛行時間質譜研究了毛蕊異黃酮和芒柄花黃素在大鼠肝微粒體中的代謝和藥物相互作用。通過該方法檢測并鑒定了與肝微粒體共同孵育后來自毛蕊異黃酮的2種羥基化代謝產物，以及來自芒柄花黃素的3種羥基化產物或4′-O-去甲基化衍生物。研究還發(fā)現，毛蕊異黃酮和芒柄花黃素會對CYP450酶反應產生抑制作用，當2種化合物共同存在時，抑制彼此的Ⅰ相代謝。

大量研究表明，腸道菌群在口服中藥的代謝過程中發(fā)揮著重要作用[23-24]。中藥成分經過腸道菌群代謝產生豐富的代謝產物，對其生物活性具有重要影響。因此，研究中藥的腸內菌代謝對了解其代謝途徑、深入闡釋其體內過程具有重要意義。腸內菌群以厭氧菌群為主，目前常用的體外腸內菌代謝研究方法是將中藥提取物與腸內菌在厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[25-26]。Li等[27]通過設計簡化的厭氧培養(yǎng)裝置，利用在線微透析結合超高效液相色譜-質譜聯用技術(MD-UPLC-MS)解決了傳統的體外腸內菌代謝取樣過程，對厭氧菌群的厭氧環(huán)境及腸內菌群微生態(tài)環(huán)境造成的影響，并利用該方法對黃芪皂苷Ⅱ在腸內菌中的代謝過程進行實時監(jiān)測。實驗中通過在灌流液中加入2-羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)，有效降低了基質干擾，提高了方法的靈敏度。在黃芪皂苷Ⅱ的腸內菌代謝實驗中，共檢測到6種新物質，其中4種為中間產物。與常規(guī)方法相比，利用online-MD-UPLC-MS建立的中藥成分腸內菌代謝研究方法，不僅操作簡單，還可實現腸內菌培養(yǎng)、取樣、樣品前處理和實時在線操作的目的。

2.3 微透析-液相色譜-質譜聯用技術在中藥體內吸收代謝研究中的應用

中藥在體內發(fā)揮藥理作用，要經過復雜的機體吸收和代謝過程。因此，需要在體外代謝研究的基礎上進一步探究其體內過程。Xue等[28]采用微透析結合超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜(UPLC-Q-TOF MS)同時鑒定口服藿香提取物在血液和腎臟透析中的成分，通過微透析探針分別植入頸靜脈和腎髓質，連續(xù)采集微透析樣品，轉移至微管，采用UPLC-Q-TOF MS進行分析，確定了大鼠血液循環(huán)中和腎臟中的非結合成分。Cao等[29]利用微透析-液相色譜-質譜聯用技術快速、靈敏地分析山茱萸在大鼠微透析液中的原型及代謝產物，根據特征診斷碎片離子和分子質量信息，確定生物轉化位點，并對代謝物進行結構鑒定，首次在大鼠體內發(fā)現山茱萸的7個原型化合物和3個新的代謝物。Liu等[30]通過微透析取樣聯合超高液相色譜-四極桿-飛行時間質譜分析了知母皂苷提取物在大鼠血液中的活性成分及代謝產物。Zheng等[31]利用微透析技術與LC-MS聯用研究了青藤堿在大鼠皮下含量的實時監(jiān)控方法，發(fā)現青藤堿皮下的第一階段生物轉化可能包括去甲基化和羥基化過程。該方法可以提供真實藥物在作用部位的代謝情況，有助于研究青藤堿的代謝機理。Zhao等[32]應用改進的膽汁微透析取樣技術結合液相色譜-四極桿-飛行時間質譜研究中藥復方二妙丸在SD大鼠膽汁中的代謝變化。根據精確質量和碎片信息，鑒定出23種生物堿和內酯代謝物，其代謝途徑涉及葡萄糖醛酸化、硫酸酯化、羥基化和水解，闡明了二妙丸在體內的代謝特征。

2.4 微透析-液相色譜-質譜聯用技術在中藥藥代動力學及藥代動力學-藥效學研究中的應用

中藥藥代動力學是在中醫(yī)藥理論的指導下，通過藥代動力學原理，研究中藥活性成分在體內吸收、分布、代謝和排泄，以及在體內的藥物濃度隨時間的變化規(guī)律。由于采樣技術的限制，早期的藥代動力學研究多用血液樣本進行分析，而微透析取樣技術與液相色譜-串聯質譜的聯用不僅可以實現幾乎所有組織的取樣，還能利用質譜的高選擇性和高靈敏度的特點，解決生物樣品的內源性干擾多、目標成分含量低的問題，因而，被廣泛用于中藥的藥代動力學研究[33-34]。Zheng等[35]采用微透析取樣結合液相色譜-串聯質譜方法，比較了黃芪桂枝五物湯中芍藥苷、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮-7-O-β-D-6-葡萄糖苷和姜酚這4種成分在正常大鼠和腦缺血再灌注損傷大鼠的血液和腦中的藥代動力學行為。研究表明，腦缺血可影響體內藥物代謝，增加血液中芍藥苷和姜酚的含量，降低毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮-7-O-β-D-6-葡萄糖苷的含量。Mi等[36]利用血腦雙位點微透析技術結合液相色譜-質譜聯用法，比較了在血瘀型偏頭痛模型大鼠中不同濃度天麻素和天麻苷元對川芎嗪和阿魏酸藥代動力學的影響。發(fā)現不同濃度的天麻素和天麻苷元會明顯影響川芎嗪和阿魏酸的藥代動力學；天麻素和天麻苷元可以增加川芎嗪和阿魏酸的腦靶向性。與其他傳統采樣方式相比，離線微透析取樣大大簡化了樣品的前處理步驟，且可以同時進行多個位點、多個部位的微透析取樣，獲得豐富的藥代動力學及組織分布信息。但在采集、儲存以及濃縮等過程中，依然存在樣品的污染、降解等問題，并且離線微透析方式往往受分析系統對樣品量要求的限制，需要在獲得較好探針回收率的前提下，犧牲一定的樣品時間分辨率以實現成功進樣。

為更好地解決此類問題，在線微透析分析系統應運而生，將采集到的樣品直接注入包括分離和檢測設備的分析系統中，具有許多超越離線微透析的優(yōu)勢。但微透析取樣時間短，在線液相色譜-質譜儀需要具有超快的色譜分離速度，以及高靈敏度的質量檢測能力。而商品微透析接口耐壓較低，不適合與超高效液相色譜-質譜聯用。因此，本課題組自行設計研制了耐96.53 MPa高壓的在線接口，并將其應用于中藥藥代動力學[37-38]及作用機制等方面的研究[3,5]。如Wang等[3]構建了急性不完全性腦缺血模型，利用在線微透析-液相色譜-串聯質譜聯用方法研究刺五加葉中主要成分的腦內代謝動力學過程及其對腦缺血大鼠腦內神經遞質的影響。發(fā)現刺五加葉中的金絲桃苷和1,5-二咖啡酰奎寧酸均能成功透過血腦屏障到達腦部, 并能有效緩解由缺血引發(fā)的神經遞質水平紊亂，實現了在不同離子監(jiān)測模式下對內源性及外源性物質的同時、實時、連續(xù)檢測。Zhang等[37]利用在線微透析-超高效液相色譜-串聯質譜(MD-UPLC-MS/MS)法研究了梔子4種未結合環(huán)烯醚萜在健康和2型糖尿病大鼠血液中的藥代動力學，發(fā)現2型糖尿病大鼠的藥代動力學行為明顯改變；在不需要標準品的條件下，采用MD-UPLC-MS /MS方法直接、實時測定梔子環(huán)烯醚萜提取物在2型糖尿病大鼠體內主要代謝物genipin-1-O-glucuronic acid和genipin-monosulfat的相對含量，獲得了兩者的相對藥動學參數[38]。與離線微透析-液相色譜-質譜聯用技術相比，在線微透析-超高效液相色譜-質譜聯用技術具有更高的時間分辨率，可以實現實時監(jiān)測，減少樣品在采集、轉移和儲存過程中可能造成的污染、降解等問題；簡化樣品處理過程，避免處理小體積樣品帶來的困擾，實現自動分析；在線聯用系統還能夠獲得更好的穩(wěn)定性和重現性[39]。

此外，血、腦微透析-超高效液相色譜-串聯質譜法也可應用于氨溴索與遠志聯合用藥的藥物相互作用研究[39]，結果表明，遠志提取物與氨溴索聯合的給藥方案是安全的，且不存在藥代動力學相互作用。

藥代動力學-藥效學 (PK-PD) 關聯分析可以將藥物在體內的動力學過程與其對機體的效應關聯起來，有助于全面系統地闡明藥物的作用機制，為藥物篩選、藥物毒性預測、臨床劑量方案選擇提供了重要的研究方法和理論依據[40-44]。Zhan等[45]通過建立一個簡單的自由運動大鼠血液微透析取樣系統，結合液相色譜-串聯質譜研究了生脈注射液對異丙腎上腺素誘導大鼠心肌缺血NO實時釋放的PK-PD效應。Wang等[46]搭建了微透析-超高液相色譜-三重四極桿質譜聯用的在線分析平臺，通過PK-PD關聯分析研究了刺五加葉治療缺血性腦中風的藥效物質基礎和作用，示于圖3。該研究搭建的在線分析平臺可同時、連續(xù)采集和定量檢測清醒狀態(tài)下缺血性腦卒中大鼠的血漿和海馬區(qū)腦脊液中刺五加葉的6種活性成分，以及與缺血性腦卒中有關的8種神經活性物質，建立了一種可視化的方法來表達缺血性海馬區(qū)藥代動力學和藥效學之間的關系，證明了刺五加葉對缺血性腦卒中有多方面的調節(jié)作用。

圖3 基于在線微透析-高效液相色譜-串聯質譜技術的PK-PD分析示意圖[46]Fig.3 Schematic diagram of PK-PD analysis based on online microdialysis-LC-MS/MS[46]

2.5 微透析-液相色譜-質譜聯用技術在中藥代謝組學及作用機制研究中的應用

中藥多成分、多靶點及多途徑作用的特點為中藥現代化研究帶來了極大的挑戰(zhàn)。近年來，隨著代謝組學的不斷發(fā)展，利用代謝組學進行中藥的藥效物質基礎、安全性評價和藥理作用機制等方面的研究，符合中藥多成分、多靶點的特點，有利于理解中藥在體內發(fā)揮的整體療效。微透析-液相色譜-質譜聯用技術能夠充分發(fā)揮微透析取樣“實時、活體、微量、微創(chuàng)”的特點，以及液相色譜-質譜聯用技術的高通量、高靈敏度和高特異性的特點，為代謝組學研究提供了新視角[4,47-48]。

類風濕性關節(jié)炎是最常見的自身免疫性疾病之一，其特征是持續(xù)性滑膜炎和異?；ぴ錾?。類風濕性關節(jié)炎的局部炎癥可以改變關節(jié)滑液的化學組成，顯著加速慢性炎癥的發(fā)展和向全身炎癥變化的進程。Zhan等[48]利用微透析技術解決了關節(jié)滑液的取樣困難，應用親水相互作用液相色譜與高分辨質譜聯用(HILIC-HRMS) 技術研究了佐劑性關節(jié)炎大鼠的代謝特征和京尼平苷治療的潛在機制。通過多元統計分析發(fā)現，佐劑性關節(jié)炎大鼠與正常大鼠的20種代謝物存在顯著差異，京尼平苷治療可以回調其中13種代謝物的變化。本實驗室利用微透析頸靜脈和腎臟雙位點取樣技術，結合基于液相色譜-串聯質譜聯用技術的靶向代謝組學方法，分別篩選出血液和腎臟中梔子治療糖尿病腎病的生物標志物，并闡釋其作用機制，示于圖4[4]。此外，本實驗室利用自行設計的在線接口，采用在線微透析-超高效液相色譜-質譜聯用方法監(jiān)測糖尿病腦病大鼠海馬區(qū)的8種神經活性物質的含量變化，對刺五加[3]、黃連[5]、人參[49]、北五味子[50]治療糖尿病腦病的作用機制進行了深入研究。

圖4 雙點微透析靶向代謝組學示意圖[4]Fig.4 Schematic diagram of the targeted metabolomics by dual-probe microdialysis[4]

3 結語

微透析-液相色譜-質譜聯用技術將微透析技術在活體、實時、連續(xù)取樣的特點與質譜技術的快速、靈敏、特異性強等優(yōu)點融合，有效解決了中藥體系復雜、內源性干擾眾多、活性成分及代謝物在生物樣品中濃度較低等問題，在中藥活性成分篩選、藥物代謝、藥代動力學及作用機制等研究方面發(fā)揮了其他技術不可比擬的優(yōu)勢，為中藥現代化研究提供了一條新的途徑。但由于微透析取樣量少、影響探針回收率等原因，單純依靠微透析-液相色譜-質譜聯用方法研究中藥中含量跨度較大的眾多成分的體內過程，以及它們的整體作用機制尚存在一定的局限性，需要與其他方法相結合，發(fā)揮各自優(yōu)勢，形成完整的研究體系。

目前，微透析-液相色譜-質譜聯用技術在中醫(yī)藥研究領域的應用還不夠廣泛，除上述提到的應用外，期待該技術能夠解決中藥劑型的改良、中藥制劑的靶向給藥、中醫(yī)藥理論及臨床研究中的瓶頸問題，使之成為中醫(yī)藥傳承和創(chuàng)新研究的有力工具。相信隨著現代分析技術的不斷發(fā)展，以及多學科技術和手段的交叉融合，微透析-液相色譜-質譜聯用技術會在中藥現代化研究中發(fā)揮更重要的作用。