李素美 王文奇

(1淮安市洪澤區(qū)人民醫(yī)院，江蘇 淮安 223100；2淮安市第一人民醫(yī)院)

青光眼主要表現(xiàn)為眼紅、夜盲、虹視、視物模糊、眼痛、頭痛等，嚴(yán)重可導(dǎo)致失明〔1〕。因患者早期癥狀不明顯或無癥狀常錯(cuò)過了最佳治療時(shí)機(jī)，發(fā)現(xiàn)時(shí)病情已發(fā)展到中晚期，視覺功能損傷嚴(yán)重致失明〔2〕。晚期青光眼致盲是目前人類最主要的致盲原因，且這種致盲是不可逆的，如何有效地保護(hù)青光眼患者的視覺功能是當(dāng)前眼科的難題之一〔3〕。近年來臨床研究認(rèn)為造成青光眼患者視覺功能損傷與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)死亡相關(guān)〔4〕。而RGCs的死亡則是通過細(xì)胞凋亡來完成的，目前已知的激發(fā)RGCs凋亡的因素較多，但這些因素都是利用信號(hào)傳導(dǎo)影響細(xì)胞內(nèi)控制凋亡的相關(guān)基因完成的〔5〕。p53基因在誘導(dǎo)RGCs凋亡中有重要的作用〔6〕。醫(yī)學(xué)界針對(duì)青光眼的相關(guān)研究很多，但缺乏關(guān)于不同眼壓狀態(tài)下RGCs細(xì)胞內(nèi)控制凋亡基因的研究。本研究通過檢測(cè)不同眼壓狀態(tài)下p53基因的表達(dá)，探討其對(duì)青光眼RGCs凋亡作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 SD小鼠RGC-5細(xì)胞系，選購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。DMEM培養(yǎng)基：北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清：美國(guó)Corning公司；胰蛋白酶消化液：北京索萊寶科技有限公司；兔抗鼠單克隆體P53：美國(guó)Santa 公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒：南京森貝伽生物科技有限公司；Hoe33342染色液：美國(guó)MedChemExpress公司；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒：美國(guó)TaKa-Ra公司；Western印跡試劑盒：基爾頓生物科技(上海)有限公司；CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；IX70型倒置相差顯微鏡：徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司；流式細(xì)胞儀：美國(guó)Beckman Coulter公司；熒光顯微鏡：徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司；紫外投射儀：北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，溫度為37℃，體積數(shù)為5% 的CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行RGC-5細(xì)胞培養(yǎng)，3～4 d用0.25%的胰蛋白消化傳代1次，傳代比例為1∶4〔7〕。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組 RGC-5細(xì)胞(對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的)以每孔8×103的密度在96孔培養(yǎng)板上進(jìn)行接種，培養(yǎng)24 h后，分為4組：對(duì)照組、20 mmHg壓力組、40 mmHg組、60 mmHg組。對(duì)照組僅進(jìn)行密封處理，不加壓，壓力組分別用20、40和60 mmHg的密封加壓裝置處理，將經(jīng)處理的細(xì)胞分別放入各自的培養(yǎng)箱中48 h，然后用倒置相差顯微鏡對(duì)各組的細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行觀察記錄〔8〕。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè) 使用Annexin V-FITC和PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒來進(jìn)行檢測(cè)，按說明書操作。首先收集加壓培養(yǎng)后的RGC-5細(xì)胞，用預(yù)冷處理過的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次；在結(jié)合緩沖液中懸浮置入洗滌的細(xì)胞〔9〕。然后分別添加Annexin V-FITC和PI，進(jìn)行15 min避光孵育。最后添加結(jié)合緩沖液混合均勻，用流式細(xì)胞儀分析〔10〕。

1.2.4半定量RT-PCR檢測(cè) 加壓培養(yǎng)后，選取RGC-5細(xì)胞(1×105個(gè))通過Trizol一步法進(jìn)行RNA提取，再用Oligo(dT)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA。以Genbank上的基因序列為依據(jù)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，分別用p53引物和內(nèi)參GAPDH引物行PCR〔11〕。其反應(yīng)體系為25 μl，反應(yīng)條件為：5 min 95℃預(yù)變性，余下的34個(gè)循環(huán)50 s 95℃變性，50 s 55℃退火，50 s 72℃延伸，最后5 min 72℃延伸，共行35個(gè)循環(huán)〔12〕。利用瓊脂糖凝膠(購(gòu)自：武漢沃軒科技有限公司，內(nèi)含1%花青素)電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，同時(shí)通過紫外透射儀觀察拍照，凝膠成像系統(tǒng)分析。

1.2.5Western印跡檢測(cè) 加壓培養(yǎng)后，收集RGC-5細(xì)胞并用細(xì)胞裂解液進(jìn)行30 min裂解。然后在4℃的環(huán)境下，以12 000 r/min的速度進(jìn)行5 min離心處理，提取上清液，加入上樣緩沖液后在沸水中煮5 min，用濃度為10%的十二烷基硫代硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離〔13〕。電泳結(jié)束后，脫奶粉(5%)封閉1 h，加入比例為1∶1 000的一抗，4℃過夜〔14〕。進(jìn)行30 min的TBST液漂洗后，加入比例為1∶2 000的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，室溫下孵育30 min，用TBST液漂洗1 h，ECL染色〔15〕。掃描得出圖像，需重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組細(xì)胞形態(tài)及存活狀況 對(duì)照組細(xì)胞形狀為梭形且有較多樹突，各壓力組細(xì)胞輪廓不清，皺縮細(xì)胞變多，有些細(xì)胞樹突變少、變短，有些細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡。而且壓力越大，細(xì)胞異常表現(xiàn)越明顯，見圖1。

圖1 倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)及存活狀況(×100)

2.2各組細(xì)胞凋亡情況比較 隨著壓力數(shù)值的上升，凋亡和壞死細(xì)胞比例均顯著高于對(duì)照組(均P<0.05)。見圖2和表1。

圖2 各組細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)下細(xì)胞凋亡

表1 各組凋亡和壞死細(xì)胞比例比較

2.3各組細(xì)胞p53 mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá) 與對(duì)照組相比，各加壓組細(xì)胞p53 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著增加，且與20 mmHg壓力組相比，40 mmHg壓力組和60 mmHg壓力組p53 mRNA和蛋白表達(dá)水平上調(diào)更顯著(P<0.05)。見圖3，4，表2。

1～4：對(duì)照組，20 mmHg壓力組，40 mmHg壓力組，60 mmHg壓力組圖3 各組細(xì)胞在不同壓力下P53的mRNA表達(dá)

1～4：對(duì)照組，20 mmHg壓力組，40 mmHg壓力組，60 mmHg壓力組圖4 各組細(xì)胞在不同壓力下p53的蛋白表達(dá)

表2 各組 p53 mRNA 和蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

目前臨床研究已證實(shí)，RGCs進(jìn)行性死亡和視神經(jīng)纖維丟失是青光眼患者眼壓上升的主要因素之一〔16〕。本研究結(jié)果證明壓力可導(dǎo)致RGCs出現(xiàn)死亡，且壓力大小與細(xì)胞損傷程度成正比。張虹等〔17〕將經(jīng)過純化培養(yǎng)的SD系大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分別施加0、20、40、80 mmHg的氣壓，在培養(yǎng)箱中進(jìn)行48 h培養(yǎng)后對(duì)細(xì)胞的凋亡狀況進(jìn)行檢測(cè)，隨著壓力數(shù)值的上升，細(xì)胞凋亡指數(shù)增高，證明壓力會(huì)導(dǎo)致RGCs凋亡，且壓力越高細(xì)胞凋亡越嚴(yán)重，且高壓力會(huì)增加細(xì)胞早期凋亡進(jìn)程。

RGCs凋亡是一個(gè)極其復(fù)雜又涉及多層面、多因素的過程〔18〕。因?yàn)楦鲗用娓饕蛩亻g是彼此聯(lián)系又相互影響制約的，現(xiàn)在研究的尚不能對(duì)其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行明確闡述〔19〕。但在目前已知的能調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的因素中，與RGCs凋亡相關(guān)性較強(qiáng)的就是p53基因。p53基因是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的抑癌基因，因其會(huì)產(chǎn)生一種名為53 kD的核蛋白而得名〔20〕。其基因分為野生型和突變型兩種，野生型通過讓細(xì)胞周期停留在G1期，來控制細(xì)胞的繁殖從而使其凋亡；突變型則為突變基因無誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用〔21〕。當(dāng)細(xì)胞DNA出現(xiàn)損害時(shí)，為了使其有時(shí)間進(jìn)行損傷修復(fù)，p53先會(huì)誘使細(xì)胞停留在G1期；但當(dāng)DNA損傷過于嚴(yán)重不能修復(fù)時(shí)，p53則會(huì)誘使細(xì)胞凋亡，以此達(dá)到清除壞死細(xì)胞的目的。