何玲 猶秋香 陳光梅 王啟春 江顯萍 吳立新 熊勁 賀歆彥

(1黔南州人民醫(yī)院老年科，貴州 都勻 558000；2重慶醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院神經(jīng)疾病中心；3黔南州人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科)

帕金森病(PD)是一種在老年人群中較為常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病〔1〕。有調(diào)查研究顯示我國65歲以上人群患有PD的概率為1.7%，雖然PD有遺傳效應(yīng)但絕大多數(shù)的疾病患者都是散發(fā)病例〔2〕。PD患病因腦中的腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元出現(xiàn)變性死亡，從而導致黑質(zhì)多巴胺的含量減少而患病〔3〕。但導致黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元死亡的原因仍尚未清楚，目前主要影響因素包括機體老化、遺傳因素、環(huán)境因素、氧化應(yīng)激等〔4〕。雌二醇是一種甾體雌激素，雌激素對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有一定的保護作用，有研究顯示老年人體患PD與其雌性激素分泌量的減少有著一定的關(guān)系，但是將雌激素用于臨床治療卻有著較大的爭議〔5〕。本文擬探討雌二醇對PD病細胞損傷模型中PC12細胞Cav1.3基因的表達影響，為雌激素與PD之間的關(guān)系研究提供參考。

1 材料與方法

1.1材料 主要試劑：DMEM高糖培養(yǎng)基、6-羥多巴胺(6-OHDA)、17β-雌二醇、胎牛血清、馬血清、磷酸鹽緩沖液(PBS)、裂解液等。主要儀器：離心機、各類實驗用玻璃儀器、電泳機等。

1.2PC12細胞的培養(yǎng) 用DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)PC12細胞株，其中DMEM完全培養(yǎng)基的組成為5%的胎牛血清、5%的馬血清(滅活)、青霉素(100 U/ml)、鏈霉素(100 μg/ml)，傳代接種時用2×105/ml的細胞密度懸液進行，接種在25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中。細胞培養(yǎng)的環(huán)境設(shè)置為溫度37℃、CO2濃度為5%、濕度為飽和濕度，每培養(yǎng)2～3 d進行1次換液，培養(yǎng)4～6 d后進行1次傳代。

1.3實驗分組 根據(jù)實驗要求一共分為3個組，分別為空白對照組，6-OHDA作用組和雌二醇干預組，雌二醇干預組又設(shè)置不同濃度的雌二醇干預亞組?？瞻捉M為在不含有6-OHDA和17β-雌二醇的DMEM完全培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)PC12細胞；6-OHDA作用組為在含有6-OHDA的DMEM完全培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)PC12細胞，其中6-OHDA的濃度為50 μmol/L；雌二醇干預組為在含有6-OHDA和17β-雌二醇的DMEM完全培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)PC12細胞，其中6-OHDA的濃度與6-OHDA作用組相同，17β-雌二醇的濃度每個亞組的都不同，分別為10-10mol/L，10-9mol/L，10-8mol/L，10-7mol/L，10-6mol/L。所有的培養(yǎng)基都是接種相同濃度、相同規(guī)格的PC12細胞懸浮液進行培養(yǎng)。

1.4評價方法 (1)使用MTT法檢測細胞活性，以空白對照組的細胞活性為標準，將其細胞MTT還原率定為100，其他組的細胞活性與空白對照組進行比較，觀察各組在細胞活性上的差別。(2)使用Western印跡法檢測Cav1.3基因的蛋白表達，首先進行總蛋白的提?。孩賹C12細胞從培養(yǎng)基中取出，然后將培養(yǎng)液倒掉，使用PBS將提取出來的PC12細胞清洗兩遍，清洗完后將其放置于冰上，加入適量的裂解液，保證裂解液均勻的覆蓋在細胞的表明，靜置5 min；②使用移液槍將細胞脫離到離心管中，將離心管放在冰上震蕩10 min，10 min后放入離心機中進行離心，離心設(shè)置為12 000 r/min，離心溫度為4℃，離心時長為15 min，離心結(jié)束后取上層清液；③使用考馬斯亮藍法測定蛋白的總濃度，在測出濃度后將其均一化濃度為3.75 mg/μl。其次用Western印跡法檢測Cav1.3基因的蛋白表達：①根據(jù)實驗要求配置濃度為12%的分離膠，在分離膠凝固后在配置濃度為4%的濃縮膠，在7 min后拔梳子；②將配置好的蛋白樣品加入到濃縮膠中，然后開始進行電泳，電泳的設(shè)置為50 V，1 h，100 V，2 h；③在電泳完成后將條件改變?yōu)?0 V，1.5 h，將蛋白樣本轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(NC)膜上；④在轉(zhuǎn)移完成后使用稀釋液封閉1.5 h，在封閉過程中要將起的泡泡趕干凈。在封閉時間達到后向其中加入已經(jīng)稀釋好的一抗體溶液，將樣品放到搖床上進行過夜，溫度設(shè)置為4℃；⑤第2天，將樣品中的NC膜取下，使用PBS-T溶液洗滌3次，在洗滌完成后加入濃度為1∶5 000的二抗溶液，將其混合，混合時要在避光的條件下進行，充分混合均勻后取出NC再使用PBS-T溶液洗滌4次；⑥對蛋白樣品進行掃描，將掃描結(jié)果與β-actin灰度進行比較，以此來確定目標蛋白的含量。每種分組3次平均值為最終結(jié)果。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1不同組PC12細胞活性比較 6-OHDA作用組PC12細胞活性顯著低于空白對照組(P<0.05)；各雌二醇干預組中的PC12細胞的細胞活性與空白對照組比較均顯著下降，但顯著高于6-OHDA作用組(P<0.05)；且呈濃度依賴性(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 各組PC12細胞活性及Cav1.3基因表達蛋白含量對比

A～G：空白組，6-OHDA作用組;雌二醇干預組(10-10mol/L)；雌二醇干預組(10-9mol/L)；雌二醇干預組(10-8mol/L);雌二醇干預組(10-7mol/L)；雌二醇干預組(10-6 mol/L)圖1 細胞PC12細胞活性觀察(MTT，×400)

2.2不同組細胞的Cav1.3基因表達蛋白含量比較 6-OHDA作用組Cav1.3基因相對蛋白含量顯著高于空白對照組(P<0.05)；雌二醇干預組中的PC12細胞的Cav1.3基因表達蛋白的含量顯著高于空白對照組，但顯著低于6-OHDA作用組(P<0.05)，且呈濃度依賴性(P<0.05)，見表1、圖2。

1～3為平行樣圖2 Cav1.3基因蛋白表達

3 討 論

PD的臨床癥狀主要表現(xiàn)為靜止性震顫、運動緩慢、肌肉僵直、無法以正常姿勢行走，同時PD患者還可能伴有抑郁、便秘和睡眠障礙等非運動型的癥狀〔6〕。對于PD的診斷主要是通過患者的病史，臨床癥狀和行為特征進行判斷，其他輔助性檢查對于診斷結(jié)果影響不大〔7〕。對于PD的治療主要是通過藥物進行治療，其中左旋多巴制劑是現(xiàn)在用于治療PD的最有效的藥物，還可以輔助以手術(shù)治療、心理治療、康復治療等〔8〕。但是現(xiàn)在的治療方法都只是對病情進行緩解，改善患者的臨床癥狀，無法對PD進行根本上的治愈，也無法阻止病情的持續(xù)發(fā)展〔9〕。

雌二醇是一種甾體雌激素，這種激素有兩種類型分別為α-雌二醇和β-雌二醇，本實驗使用的就是β-雌二醇。雌二醇是一種生理作用較強的激素，由于其有很強的性激素作用，所以又將其稱為“動情素”和“求偶素”〔10〕。雌激素能促使細胞合成DNA、RNA和相應(yīng)組織內(nèi)各種不同的蛋白質(zhì)，在臨床疾病的治療中有著一定的應(yīng)用〔11〕。主要是用于補充患者的雌激素不足、治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌、治療晚期前列腺癌、防治骨質(zhì)疏松、治療痤瘡、白細胞減少癥、用作事后避孕藥和退奶等〔12〕。6-OHDA是一種神經(jīng)毒性物質(zhì)，可以對神經(jīng)細胞產(chǎn)生損傷，雖然人體腦中也會產(chǎn)生6-OHDA，但是產(chǎn)生的量很少，對神經(jīng)細胞的毒性作用很小，但是在一定生理作用下可能會產(chǎn)生大量的6-OHDA，從而對神經(jīng)細胞產(chǎn)生嚴重的損傷。有研究顯示6-OHDA的含量過高可能是導致黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元細胞變性死亡的原因之一〔13〕。PC12細胞是一個常用于相關(guān)實驗的神經(jīng)細胞株，其來源為于一種可移植的鼠嗜鉻細胞瘤，這種細胞有明顯的神經(jīng)細胞反應(yīng)，常被用于體外神經(jīng)細胞模型，進行相關(guān)的藥物實驗，以此來探討相關(guān)藥物對于神經(jīng)細胞的作用原理和效果〔14〕。

L型鈣通道作為一種類型鈣通道，對電壓有極強的依賴性，故又將其視作一種電壓依賴性鈣通道的類型鈣通道，這個通道可以通過控制鈣離子的流動形成L型電流，在神經(jīng)細胞中有著重要作用〔15〕。哺乳動物的大腦主要表達Cav1.2和Cav1.3兩種LTCC亞型。Cav1.3介導的細胞內(nèi)鈣超載導致了黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的病理改變，且該作用發(fā)生在疾病早期。其對神經(jīng)細胞中的L型鈣離子通道有著重要的影響作用，通過檢測Cav1.3基因的表達情況可以來判斷神經(jīng)細胞的活躍程度和損傷狀況。雌激素除了控制人體的一些生殖行為和非生殖行為之外還對位于中腦的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元有著調(diào)節(jié)作用。有研究〔9〕顯示雌激素的含量水平與PD的發(fā)病率有著一定的關(guān)聯(lián)，雌激素可以激活中腦的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元細胞核內(nèi)的受體，提高其抗凋零蛋白基因的表達以此來阻止中腦的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的變性死亡，保護中腦的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的效果，對PD起到治療效果。

本實驗顯示空白對照組的PC12細胞中的Cav1.3基因表達蛋白的含量要低于6-OHDA作用組，造成這樣的原因為6-OHDA是一種具有神經(jīng)細胞毒性的物質(zhì)，6-OHDA作用組的PC12細胞受到了6-OHDA的神經(jīng)毒素作用受到了損傷，細胞內(nèi)的代謝程度下降呈現(xiàn)壞死狀態(tài)，導致Cav1.3基因的表達增加，會引起鈣超載從而加重細胞的損傷。在檢測中可以發(fā)現(xiàn)17β-雌二醇對PC細胞起到了保護作用，降低了6-OHDA對其的毒性效果，讓細胞沒有受到那么大的損傷，使得相關(guān)蛋白的含量要低于作用組，其作用原理為17β-雌二醇通過擴散作用進入到PC12細胞的細胞核內(nèi)與細胞核類的相關(guān)受體產(chǎn)生結(jié)合發(fā)揮作用，提高增加神經(jīng)細胞活性的相關(guān)基因進行表達，保護細胞不受6-OHDA的影響，不會影響Cav1.3基因的表達。17β-雌二醇的濃度越高對神經(jīng)細胞的保護效果越好。

綜上，雌二醇對PD細胞損傷模型中PC12細胞Cav1.3基因的表達有著積極的影響，雌二醇可通過保護PD細胞損傷模型中PC12細胞從而避免細胞中的Cav1.3基因表達過高，并且雌二醇的濃度與Cav1.3基因表達呈負相關(guān)， 6-OHDA制備PC12細胞損傷模型，在6-OHDA作用組中Cav1.3的表達增高；加了雌二醇保護后，增高的Cav1.3基因的表達量下降，期望為PD的治療提供一定參考和思路。