楊達(dá)鈞 王劍一 莫嘉強(qiáng) 何軍明

(1廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405；2廣東省中醫(yī)院肝膽胰外科)

原發(fā)性肝癌是世界范圍內(nèi)常見且致命的腫瘤類型，其中最常見的肝癌組織類型是肝細(xì)胞肝癌(HCC)〔1〕。HCC每年新發(fā)病例超過70萬例，是全球第五大常見腫瘤，是全球腫瘤死亡第三大常見原因，占男性腫瘤相關(guān)死亡原因的第二位，而在我國HCC患者新發(fā)病例和死亡病例占全球病例的一半〔2，3〕。盡管近年來HCC在手術(shù)、化療和靶向等治療策略上不斷改進(jìn)，但是HCC的死亡率并沒有明顯的改善，患者5年生存率仍然很低〔4〕。目前HCC的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，越來越多的研究報(bào)道探索HCC發(fā)病的分子基礎(chǔ)對改進(jìn)其治療策略至關(guān)重要。孕激素和脂聯(lián)素受體(PAQR)4是PAQR家族成員之一，該家族中的成員參與調(diào)節(jié)許多生物過程，包括代謝和腫瘤進(jìn)展〔5〕。PAQR4在細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞分化和細(xì)胞死亡等生物過程中發(fā)揮至關(guān)重要的功能〔6〕。關(guān)于PAQR4的研究報(bào)道較少，但是其在非小細(xì)胞肺癌、胃癌和乳腺癌中被報(bào)道為癌基因，促進(jìn)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移〔7～9〕。PAQR4在HCC中的表達(dá)情況及生物學(xué)作用未見有報(bào)道，本研究旨在探討抑制PAQR4的表達(dá)對HCC增殖侵襲的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM-高糖和胎牛血清(FBS)購于美國Gibco公司；HCC細(xì)胞系HUH-7購于美國ATCC細(xì)胞庫；PAQR4 siRNA購于上海銳賽生物技術(shù)有限公司；25 cm3培養(yǎng)瓶、6孔板和Boyden小室等購于美國Coring公司；MTS試劑和聚偏氟乙烯(PVDF)膜購于美國Promega公司；細(xì)胞周期檢測試劑盒和BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自中國上海碧云天生物技術(shù)有限公司；強(qiáng)效RIPA裂解液購于北京Solarbio公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及慢病毒感染 HUH-7細(xì)胞用含有10%FBS DMEM-高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，放置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。HUH-7細(xì)胞呈對數(shù)生長期時(shí)，消化收集細(xì)胞，以2.0×105個(gè)/孔鋪至6孔板中，分為對照組(si-NC組)和PAQR4 siRNA組(si-PAQR4組)，貼壁12 h后，按說明書將NC siRNA和PAQR4 siRNA與轉(zhuǎn)染試劑Lip2000混勻后加入各組細(xì)胞中，放至培養(yǎng)箱中，8～12 h更換新鮮培養(yǎng)基，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3MTS檢測細(xì)胞活性 HUH-7細(xì)胞呈對數(shù)生長期時(shí)，消化收集細(xì)胞，以2 000個(gè)/孔鋪至96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，按上述siRNA轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞，放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染細(xì)胞24、48、72和96 h時(shí)，每孔加入30 μl MTS工作液，37℃培養(yǎng)箱中避光孵育2 h后，全波長掃描儀檢測波長490 nm處的吸光度OD值，OD值代表細(xì)胞活性。

1.4平板克隆檢測細(xì)胞克隆形成能力 HUH-7細(xì)胞呈對數(shù)生長期時(shí)，消化收集細(xì)胞，以300個(gè)/孔鋪至6孔板中，分為對照組(si-NC)和PAQR4 siRNA組(si-PAQR4)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，按上述siRNA轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞，放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)1 w時(shí)，將siRNA再次轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞，培養(yǎng)至肉眼可見的克隆團(tuán)形成。棄去培養(yǎng)基，終止培養(yǎng)，PBS洗3次，甲醛固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，干燥后計(jì)數(shù)克隆團(tuán)的數(shù)目。

1.5流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞周期 HUH-7細(xì)胞呈對數(shù)生長期時(shí)，消化收集細(xì)胞，以2.0×105個(gè)/孔鋪至6孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，按上述siRNA轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞，放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h時(shí)，無EDTA的胰酶收集各組細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次后，加入4℃的75%酒精固定細(xì)胞2～24 h。離心去掉酒精，PBS洗2次后，按照周期試劑檢測試劑說明書加入PI染色試劑，37℃避光孵育30 min后，上機(jī)進(jìn)行檢測。

1.6Boyden實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力 消化收集轉(zhuǎn)染NC siRNA和PAQR4 siRNA 48 h的各組HUH-7細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基洗3次后，1×105個(gè)細(xì)胞重懸至100 μl 無血清培養(yǎng)基中，加入24孔板中Boyden小室的上室中，下室趨化因子為500 μl的完全培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至在顯微鏡下觀察到細(xì)胞穿膜掉入下室后終止培養(yǎng)。PBS洗3次后，甲醇固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，干燥后將膜取下中性樹膠封片，顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.7Western印跡檢測蛋白表達(dá) 消化收集轉(zhuǎn)染NC siRNA和PAQR4 siRNA 48 h的各組HUH-7細(xì)胞，PBS洗3次后，細(xì)胞斑塊中加入RIPA裂解液，細(xì)胞完全裂解后，4℃、14 000 r/min離心20 min，收集上清液，按照BCA試劑盒說明書檢測蛋白濃度。蛋白加熱煮沸變性，80 V、150 min進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，350 mA、120 min條件進(jìn)行濕轉(zhuǎn)。8%脫脂牛奶室溫孵育PVDF膜1 h進(jìn)行非特異性蛋白封閉。按說明書加入一抗稀釋液4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，二抗稀釋液室溫孵育2 h，采用ECL法顯示蛋白條帶。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1PAQR4對HCC細(xì)胞活性的影響 MTS實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，si-NC組細(xì)胞在24、48、72和96 h的OD值分別為(0.57±0.06)、(0.76±0.11)、(0.95±0.11)、(1.37±0.09)，si-PAQR4組細(xì)胞在24、48、72和96 h的OD值分別為(0.56±0.05)、(0.65±0.08)、(0.73±0.07)、(0.84±0.08)，與si-NC組細(xì)胞活性相比，si-PAQR4組細(xì)胞活性顯著降低(均P<0.05)。

2.2PAQR4對HCC細(xì)胞平板克隆形成能力的影響 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，siRNA轉(zhuǎn)染HCC細(xì)胞HUH-7后，si-NC組細(xì)胞克隆團(tuán)數(shù)目〔(112.34±20.15)個(gè)〕明顯高于si-PAQR4組〔(45.46±9.22)個(gè)，P<0.05〕，見圖1。

圖1 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測干擾PAQR4表達(dá)對HCC細(xì)胞克隆形成能力的影響(結(jié)晶紫)

2.3PAQR4對HCC細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，siRNA轉(zhuǎn)染HCC細(xì)胞HUH-7后，si-NC組細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例〔(64.33±4.04)%〕明顯低于si-PAQR4組〔(73.01±2.99)%，P<0.05〕。

2.4PAQR4對HCC細(xì)胞侵襲能力的影響 Boyden實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，siRNA轉(zhuǎn)染HCC細(xì)胞HUH-7后，si-NC組細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)〔(38.67±5.41)個(gè)〕明顯高于si-PAQR4組〔(20.33±4.12)個(gè)，P<0.05〕，見圖2。

圖2 Boyden檢測干擾PAQR4表達(dá)對HCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力影響(結(jié)晶紫，×20)

2.5PAQR4對CyclinD1和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-7的影響 Western印跡檢測發(fā)現(xiàn)，siRNA轉(zhuǎn)染HCC細(xì)胞HUH-7后，與si-NC組相比，si-PAQR4組細(xì)胞中CyclinD1和MMP-7蛋白表達(dá)均降低，見表1和圖3。

表1 兩組轉(zhuǎn)染后cyclinD1和MMP-7蛋白表達(dá)比較

圖3 Western印跡檢測干擾PAQR4表達(dá)對CyclinD1和MMP-7蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

HCC是侵襲性惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類生命健康〔1～3〕。慢性肝炎、肝硬化是導(dǎo)致HCC的重要原因，乙型和丙型肝炎病毒、黃曲霉素等感染是HCC的高危致病因素〔10,11〕。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，生活水平的提高，酒精性肝炎和脂肪性肝炎的發(fā)病增加促使HCC的發(fā)生，使得HCC的發(fā)病率居高不下〔12,13〕。HCC早期患者治療主要是局部腫瘤切除和肝臟移植，早期患者1年、3年和5年總生存率相對較高〔14〕。而大多數(shù)早期HCC患者無明顯臨床癥狀，往往是出現(xiàn)轉(zhuǎn)移臨床癥狀而被確診，屬于HCC晚期患者，錯(cuò)過最佳治療時(shí)間。同時(shí)肝細(xì)胞的再生和血管侵犯能力極強(qiáng)，手術(shù)切除后的早期HCC患者容易發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移〔15〕，對于晚期和復(fù)發(fā)HCC患者治療選擇有限，動脈化療栓塞、放化療和靶向治療的聯(lián)合治療是主要治療手段，但是具有相對嚴(yán)重的副作用〔16〕。靶向藥物索拉菲尼已經(jīng)明確可以延長晚期HCC患者幾個(gè)月的生存時(shí)間，因此靶向藥物的研究是治療HCC關(guān)鍵突破點(diǎn)。HCC是一種多基因慢性疾病，涉及復(fù)雜的基因和信號通路，在HCC發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的基因可能是治療HCC的候選靶點(diǎn)。PAQR家族于2005年首次鑒定由7個(gè)跨膜通道組成，是一類新發(fā)現(xiàn)的膜蛋白受體，含有特有的PFAM-UPF0073結(jié)構(gòu)域，具有高度保守性，其N端朝向細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，C端朝向高爾基體腔內(nèi),負(fù)責(zé)傳遞和調(diào)控胞內(nèi)信號的作用〔5〕。PAQR家族由人類基因組中PAQR1至PAQR11的11個(gè)成員組成，每個(gè)PAQR蛋白成員在人體中表達(dá)的部位和水平不同，相對應(yīng)的生物學(xué)功能也不相同，目前研究的家族成員蛋白是PAQR1、PAQR2、PAQR3、PAQR5和PAQR7〔17〕。PAQR4的研究相對較少，Wu〔7〕報(bào)道在非小細(xì)胞肺癌患者中PAQR4在癌組織中的表達(dá)顯著高于匹配的非癌組織；與正常的乳腺組織相比，PAQR4在82個(gè)乳腺癌組織樣本中表達(dá)上調(diào)〔9〕。PAQR4與HCC的研究未見有報(bào)道，本研究顯示與正常肝組織相比，PAQR4在肝癌組織中的表達(dá)顯著增加。高表達(dá)PAQR4的HCC患者預(yù)后較差，提示PAQR4在HCC中高表達(dá)，與患者預(yù)后不良相關(guān)。

研究報(bào)道在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中過表達(dá)PAQR4促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、集落形成、遷移和侵襲能力，而敲低PAQR4的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、集落形成、遷移和侵襲能力〔7〕。在胃癌細(xì)胞中PAQR4的過表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)了miR-370對腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制作用〔8〕。RAQR4在HCC細(xì)胞中高表達(dá)可能促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲能，具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。CyclinD1是細(xì)胞周期調(diào)控的正性因子，作為G0/G1期關(guān)鍵蛋白，促使細(xì)胞由G0/G1期進(jìn)入S期進(jìn)行細(xì)胞分裂〔18〕，其表達(dá)減少可使細(xì)胞阻滯在G0/G1期，細(xì)胞增殖抑制，是抗腫瘤治療的重要機(jī)制之一〔19,20〕。MMP-2屬于MMPs家族成員之一，通過降解組織基質(zhì)促進(jìn)細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移能力，在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔21,22〕，遷移和侵襲是HCC進(jìn)展和復(fù)發(fā)的重要步驟，在一定程度上決定了HCC治療的成功與失敗〔23〕。本研究結(jié)果表明RAQR4可能通過調(diào)控CyclinD1和MMP-2促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖和侵襲能力，其深入的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。