春蓮 吳偉樂(lè)斯 布仁巴圖

(1內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院蒙醫(yī)婦科，內(nèi)蒙古 通遼 028000；2包頭醫(yī)學(xué)院；3內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院)

蘇格木勒-7(蘇-7)雖然是傳統(tǒng)經(jīng)典方劑，但目前的研究還處于初級(jí)階段(臨床療效觀察及簡(jiǎn)單的藥理作用研究)〔1〕。蘇-7藥理作用主要是具有抗自由基、抗氧化及提高免疫力等作用〔2〕。而蘇-7在治療卵巢功能低下、保護(hù)卵巢功能、延緩卵巢衰老等方面尚無(wú)相關(guān)研究及報(bào)道。本課題組前期研究探索了蘇-7對(duì)化療性卵巢功能低下大鼠卵巢的功能保護(hù)作用研究，得出蘇-7對(duì)化療性卵巢功能低下大鼠的體重、卵巢及脾臟具有保護(hù)功能，并能提高免疫力、促進(jìn)卵巢修復(fù)、促進(jìn)卵泡發(fā)育成熟及排卵而恢復(fù)性周期，提高繁殖能力及新生鼠的生存率〔3〕。其中以1.0 g/(kg·d)和0.5 g/(kg·d)劑量蘇-7 療效較佳，本研究擬以此劑量做進(jìn)一步的機(jī)制研究。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 10周齡健康 SD 雌性大鼠56只，購(gòu)自長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵循動(dòng)物保護(hù)與使用指南，并由內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物保護(hù)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2動(dòng)物分組 采用56只SD雌性大鼠，體重170～200 g。先適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后禁食、不禁水10 h；第8天晨測(cè)體重并開(kāi)始取陰道細(xì)胞檢測(cè)性周期，共10 d，剔除無(wú)規(guī)律性周期和無(wú)發(fā)情的鼠 8只，剩余48只正常性周期的雌性大鼠按體重排序從隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)區(qū)組法分4組(n=12)，分別為模型組即環(huán)磷酰胺組(CTX)、模型加蘇格木勒-7〔0.5 g/(kg·d)〕組即蘇-7-0.5、模型加蘇格木勒-7〔1.0 g/(kg·d)〕組即蘇-7-1.0、正常組。

1.3建立模型 除了正常組其他3組均連續(xù)7 d腹腔注射CTX 30 mg/(kg·d)，同時(shí)每天早上8點(diǎn)對(duì)大鼠進(jìn)行陰道細(xì)胞涂片分析，一直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。發(fā)情周期出現(xiàn)紊亂或無(wú)發(fā)情周期代表模型成功。

1.4藥物制備與給藥方法 蘇-7由內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室提供(符合 GPP 標(biāo)準(zhǔn)制劑室)。正常組和模型組等量生理鹽水灌胃，其余給藥組在造模第1天開(kāi)始(建模同時(shí))分別灌胃給予蘇-7-1.0 g/(kg·d)和蘇-7-0.5 g/(kg·d)，每天給藥1次，連續(xù)給藥24 d。

1.5血清及各臟器標(biāo)本采集 造模7 d+給藥24 d后，剩余大鼠于動(dòng)情間期進(jìn)行麻醉后打開(kāi)腹腔，腹主動(dòng)脈取血，分離血清并送檢驗(yàn)室以備酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1水平變化。采血后迅速分離左側(cè)卵巢，分為兩部分，分裝在兩個(gè)速凍管內(nèi)迅速置于液氮中，以備-80℃保存，用Western印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)；分離右側(cè)卵巢、稱重后用10%甲醛固定后送至病理科，做免疫組化法檢測(cè)相關(guān)蛋白的定位及檢測(cè)表達(dá)量。

1.6ELISA檢測(cè) 血清TGF-β1、IL-6、TNF-α 評(píng)估化療及蘇格木勒-7對(duì)大鼠卵巢功能保護(hù)的機(jī)制。

1.7免疫組織化學(xué)法 分別對(duì)卵巢組織中生長(zhǎng)分化因子(GDF)-9和骨形成態(tài)蛋白質(zhì)(BMP)-15、8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷(OHdG)、4羥基壬烯醛(HNE)、硝基酪氨酸(NTY)進(jìn)行定位及表達(dá)量評(píng)價(jià)。

1.8Western印跡檢測(cè) Bax、Bcl-2、超氧化物歧化酶(SOD)-2、血小板反應(yīng)蛋白(TSP)-1、組織蛋白酶(Cathepin)D、骨髓基質(zhì)細(xì)胞抗原(BST)1、補(bǔ)體因子-H(CFH)等蛋白表達(dá)量 Bax、Bcl-2是凋亡相關(guān)蛋白〔2，3〕；SOD是抗氧化酶〔9〕；其中TSP-1、CathepinD、BST1、CFH是前期臨床患者蛋白組學(xué)得出的差異蛋白，通過(guò)檢測(cè)大鼠卵巢組織中表達(dá)量來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證其結(jié)果。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0軟件行方差齊性檢驗(yàn)、單因素方差分析及非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1蘇-7對(duì)化療性卵巢功能低下大鼠TNF-α、IL-6、TGF-β1的影響 與正常組相比，模型組TNF-α、IL-6水平顯著增高，TGF-β1水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，蘇-7-0.5組TNF-α、IL-6水平顯著下降，TGF-β1水平顯著增高(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組TNF-α、IL-6、TGF-β1水平比較

2.2Western印跡檢測(cè)結(jié)果 與正常組比較，模型組卵巢內(nèi)Bax、TSP-1、CFH表達(dá)顯著增高(P<0.01)，而蘇-7-1.0和蘇-7-0.5組與模型組相比明顯下降(P<0.05，P<0.01)；與正常組比較，模型組Bcl-2、SOD表達(dá)水平顯著下降(P<0.01)，而蘇-7-1.0和蘇-7-0.5組與模型組比較顯著增加(P<0.05，P<0.01)；其中蘇-7-0.5組與蘇-7-1.0組相比以蘇-7-0.5效果更佳。與正常組比較，模型組CathepinD表達(dá)量有所增加，但無(wú)顯著差異(P>0.05)，治療后有所下降，但無(wú)顯著差異(P>0.05)；模型組BST1表達(dá)量有所下降，但無(wú)顯著差異(P>0.05)，治療后也無(wú)升高，反而有降低趨勢(shì)。見(jiàn)表2。

表2 各組相關(guān)蛋白表達(dá)量比較

2.3免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果 卵巢組織中8-OHdG、4HNE、NTY等氧化應(yīng)激產(chǎn)物指標(biāo)及生長(zhǎng)因子指標(biāo)在各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CTX不會(huì)導(dǎo)致大鼠卵巢組織氧化應(yīng)激反應(yīng)及GDF-9和BMP-15表達(dá)量；蘇-7可能不通過(guò)改善氧化應(yīng)激及生長(zhǎng)因子相關(guān)指標(biāo)起作用。見(jiàn)表3。

表3 免疫組化檢測(cè)各組相關(guān)蛋白表達(dá)量比較

3 討 論

卵巢是女性激素產(chǎn)生的重要器官，對(duì)女性的內(nèi)分泌生殖起非常重要的作用，卵巢損傷引起的卵巢功能下降及卵巢功能提前衰退，將不可避免地導(dǎo)致過(guò)早絕經(jīng)及生殖能力的喪失〔5〕。以往研究〔6～9〕已經(jīng)證實(shí)CTX能引起67%的生育期女性絕經(jīng)，另外完整的化療方案后只有0.6%的女性可以懷孕〔10，11〕。卵巢儲(chǔ)備功能良好才能有正常的卵巢功能，卵巢儲(chǔ)備取決于始基卵泡池的激活與卵泡閉鎖的速度〔5〕。本研究逼真的模擬了卵巢功能下降及卵巢早衰，發(fā)現(xiàn)蘇-7對(duì)化療性卵巢功能低下大鼠卵巢內(nèi)分泌及生殖功能有改善及保護(hù)作用。Bcl-2蛋白家族成員是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要因子，調(diào)控著個(gè)體程序性細(xì)胞凋亡通路，其中包括抑制細(xì)胞凋亡，如Bcl-2和促進(jìn)細(xì)胞凋亡Bax兩類功能相反的蛋白質(zhì)〔12～14〕。Bax是一種重要的促凋亡蛋白，破壞線粒體外膜的完整性而導(dǎo)致促凋亡因子，如細(xì)胞色素c的釋放及細(xì)胞質(zhì)中凋亡蛋白酶的激活〔15〕。本研究結(jié)果表明CTX組卵巢顆粒細(xì)胞凋亡明顯，蘇-7通過(guò)對(duì)抗卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，從而減少卵泡閉鎖，增加健康卵泡數(shù)目來(lái)改善及保護(hù)化療大鼠卵巢功能。

SOD是一個(gè)重要的抗氧化酶，本研究結(jié)果表明蘇-7通過(guò)增強(qiáng)大鼠卵巢組織抗氧化能力，抑制細(xì)胞凋亡，抑制卵泡提前閉鎖，增加健康卵泡數(shù)量而起到保護(hù)卵巢功能的作用。CTX可能對(duì)卵巢組織造成損傷，而TGF-β1表達(dá)降低，卵泡不能正常生長(zhǎng)發(fā)育；低劑量的蘇-7可以促進(jìn)卵巢損傷修復(fù)而TGF-β1分泌增高，促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)發(fā)育，保護(hù)卵巢功能。

CFH參與免疫調(diào)節(jié)及補(bǔ)體激活過(guò)程，CFH升高提示組織損傷，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與免疫相關(guān)炎癥因子TNF-α及IL-6的檢測(cè)結(jié)果相一致，進(jìn)一步提示蘇-7能抵抗炎癥過(guò)程，促進(jìn)組織損傷修復(fù)。

TSP-1是一種由衰老細(xì)胞產(chǎn)生的多種生物學(xué)功能的三聚體糖蛋白，組織器官中TSP-1的升高提示組織損傷的發(fā)生。陶潛等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)，TSP-1是血管抑制因子，TSP-1的表達(dá)與卵巢間質(zhì)微血管密度(MDV)呈負(fù)相關(guān)。TSP-1高表達(dá)可能在卵巢巧克力囊腫卵巢間質(zhì)微血管網(wǎng)損傷及間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。本研究結(jié)果表明蘇-7能保護(hù)大鼠卵巢，其機(jī)制可能是蘇-7通過(guò)抑制TSP-1形成；另外有研究報(bào)道，TSP-1參與顆粒細(xì)胞凋亡〔9〕，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了TSP-1參與顆粒細(xì)胞凋亡這一結(jié)果；提示TSP-1可能通過(guò)參與卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡過(guò)程，抑制TGF-β1激活，卵巢間質(zhì)微血管網(wǎng)損傷及間質(zhì)纖維化的發(fā)生等而影響卵泡的正常生長(zhǎng)發(fā)育及促進(jìn)卵泡閉鎖。而蘇-7可能通過(guò)降低TSP-1而促進(jìn)卵巢組織損傷修復(fù)，促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)發(fā)育，抵抗卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡，減少卵泡閉鎖，抑制卵巢間質(zhì)的纖維化，促進(jìn)卵巢組織的修復(fù)而起到卵巢功能保護(hù)作用。

蘇-7通過(guò)抑制TNF-α、IL-6、CFH水平增高，抑制機(jī)體炎癥性損傷并保護(hù)機(jī)體器官功能；通過(guò)上調(diào)TGF-β1而促進(jìn)顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及促進(jìn)卵泡發(fā)育成熟，增加竇狀卵泡數(shù)，并促進(jìn)排卵從而提高大鼠的妊娠率。一方面通過(guò)提高SOD表達(dá)而提高卵巢組織抗氧化能力，抵抗化療至卵巢氧化應(yīng)激狀態(tài)而抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡及卵泡閉鎖，另一方面通過(guò)增加抗凋亡因子，降低促凋亡因子而防止顆粒細(xì)胞過(guò)早凋亡而抵制卵泡閉鎖，從而增加健康卵泡數(shù)目來(lái)保護(hù)化療大鼠卵巢儲(chǔ)備，改善卵巢功能。