張浩 王擁軍 桑敬偉 張文 楊衛(wèi)兵 高雁卿 張紫機(jī)

(1安陽(yáng)市人民醫(yī)院骨科，河南 安陽(yáng) 455000；2中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外科)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSCs)是一類具有多向分化潛能的干細(xì)胞，在特定環(huán)境下可誘導(dǎo)分化成為成骨細(xì)胞，調(diào)控骨的生長(zhǎng)發(fā)育。因hBMSCs具有來(lái)源廣泛、易分離培養(yǎng)和分化潛能大等特點(diǎn)，被認(rèn)為是治療骨質(zhì)疏松等骨組織損傷修復(fù)的理想種子細(xì)胞〔1〕。然而，如何使hBMSCs單向成骨分化一直是制約臨床修復(fù)效率的關(guān)鍵。微小RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼小RNA，可與相關(guān)靶基因3′UTR區(qū)結(jié)合抑制其翻譯進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、凋亡和分化等多種生物學(xué)過(guò)程。研究〔2～4〕證實(shí)，miRNA在hBMSCs成骨分化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，miR-224在hBMSCs成骨分化過(guò)程中低表達(dá)，但其具體的作用及調(diào)控機(jī)制尚不清楚〔5〕。因此，本研究通過(guò)體外培養(yǎng)hBMSCs并誘導(dǎo)其成骨分化后，采用常規(guī)生物學(xué)手段上調(diào)miR-224表達(dá)，觀察其對(duì)hBMSCs成骨分化的影響，并通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)相關(guān)靶基因，探討其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人hBMSCs、誘導(dǎo)成骨分化的DMEM培養(yǎng)液、hBMSCs培養(yǎng)液ORICellTM和Opti-MEM培養(yǎng)液購(gòu)自中國(guó)賽業(yè)生物公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子(Runx)2、骨鈣素(OCN)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、SMAD同源物(Smad4)一抗和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。miR-224模擬物(mimics)、miR-control、Smad4 siRNA干擾序列和陰性對(duì)照序列均購(gòu)自上海吉?jiǎng)P公司，脂質(zhì)體2000購(gòu)于美國(guó)Introvigen公司。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNA抽提試劑盒和電化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司，堿性磷酸酶(ALP)活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物公司。雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

1.2hBMSCs培養(yǎng) 采用ORICellTM培養(yǎng)液將hBMSCs培養(yǎng)在含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中，每3 d換1次培養(yǎng)基。待細(xì)胞幾乎鋪滿培養(yǎng)瓶底時(shí)，加入0.25%胰酶消化，以1∶3比例傳代。實(shí)驗(yàn)使用第5代細(xì)胞。

1.3hBMSCs成骨分化的誘導(dǎo) 取6孔板，每孔接種100 μl濃度為105個(gè)/ml的hBMSCs，常規(guī)條件下培養(yǎng)24 h后，加入由10%胎牛血清、0.2 mmol/L抗壞血酸、1%谷氨酰胺、10 nmol/L地塞米松和10 mmol/L β-磷酸甘油構(gòu)成的誘導(dǎo)成骨分化的DMEM培養(yǎng)液，每3 d換液1次的，誘導(dǎo)培養(yǎng)12 d。分別在第0、3、6、9和12 d收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將未分化的hBMSCs以每孔105個(gè)細(xì)胞接種24孔板，常規(guī)條件下培養(yǎng)24 h后，換成無(wú)血清的Opti-MEM培養(yǎng)基，采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將miR-224 mimics(終濃度為50 nmol/L)及陰性對(duì)照(終濃度為50 nmol/L)轉(zhuǎn)至未分化的hBMSCs中。轉(zhuǎn)染6 h后，換成成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。Smad4 siRNA干擾序列和陰性對(duì)照序列的轉(zhuǎn)染過(guò)程同上。

1.5qRT-PCR檢測(cè)miR-224表達(dá) RNA抽提試劑盒提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)由美國(guó)Invitrogen公司合成的miR-224引物(上游：5′-GCGAGGTCAAGTCACTAGTGGT-3′和下游5′-CGAGAAGCTTGCATCACCAGAGAACG-3′)和U6引物(上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′和下游5′-AACGCTTCACGAATTT-GCGT-3′)進(jìn)行PCR定量分析，以U6作內(nèi)參，檢測(cè)miR-224的表達(dá)。

1.6ALP活性檢測(cè) 收集成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的hBMSCs，采用ALP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ALP活性，根據(jù)公式：ALP活性=測(cè)定管吸光度值/總蛋白克數(shù)。

1.7Runx2、OCN和Smad4蛋白檢測(cè) 收集成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的hBMSCs，磷酸緩沖液洗滌后，以加蛋白酶抑制劑的放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白。采用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒對(duì)蛋白濃度定量后，以4∶1比例將蛋白樣品與5×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液混合，沸水浴變性后，進(jìn)行凝膠電泳。待蛋白分離結(jié)束后，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。常溫下以含5%脫脂奶粉封閉液封閉1 h后，加入特異性一抗4℃下孵育過(guò)夜，封閉液洗滌后，HRP標(biāo)記的二抗常溫孵育1 h。暗室內(nèi)加入ECL試劑顯影曝光，以GAPDH為內(nèi)參，檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況。

1.8熒光素酶實(shí)驗(yàn) 由上海吉?jiǎng)P公司構(gòu)建Smad4 3′-UTR野生型(含Smad4 3′-UTR目的片段)和Smad4 3′-UTR突變型(含Smad4 3′-UTR突變體)質(zhì)粒。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hBMSCs隨機(jī)分為野生型Smad4+miR-224 mimics組、野生型Smad4+miR-control組、突變型Smad4+miR-224 mimics組和突變型Smad4+miR-control組，使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染miR-224 mimic及Smad4 3′-UTR野生型或突變型，轉(zhuǎn)染48 h后，使用雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶活性。

1.9數(shù)據(jù)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1hBMSCs的成骨分化能力 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)0、3、6、9和12 d，ALP活性由(0.11±0.02)U/g依次上升為(0.23±0.03)U/g、(0.45±0.03)U/g、(0.67±0.05)U/g和(0.89±0.06)U/g。與0 d相比，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，hBMSCs 的ALP活性顯著升高(P<0.05)，且在12 d時(shí)達(dá)到最大。在0～12 d的5個(gè)成骨培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)下OCN蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.13±0.02、0.21±0.02、0.28±0.03、0.36±0.02和0.43±0.03；Runx2蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.25±0.02、0.33±0.03、0.39±0.02、0.46±0.03和0.58±0.03。與0 d相比，OCN和Runx2蛋白的表達(dá)水平也均隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯升高(P<0.05)?？梢姡琱BMSCs的成骨分化能力良好。見圖1。

圖1 hBMSCs成骨分化能力的檢測(cè)

2.2hBMSCs成骨分化過(guò)程中miR-224和Smad4的表達(dá) qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-224的相對(duì)表達(dá)水平從0 d的1.00±0.06到第3天降為0.88±0.06，第6天降為0.74±0.05，第9天降為0.55±0.03，至12 d降至最低，為0.43±0.03；可見，miR-224在hBMSCs成骨分化過(guò)程中的表達(dá)水平隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低(P<0.05)；Western印跡法檢測(cè)結(jié)果(圖2)顯示，在0～12 d的5個(gè)成骨培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)下，Smad4蛋白的相對(duì)表達(dá)量(0.26±0.03、0.35±0.02、0.44±0.03、0.53±0.04和0.72±0.05)則隨成骨誘導(dǎo)時(shí)間的增加而顯著升高(P<0.05)。

圖2 hBMSCs成骨分化過(guò)程中Smad4的表達(dá)

2.3上調(diào)miR-224表達(dá)抑制hBMSCs向成骨細(xì)胞分化 將miR-224 mimics轉(zhuǎn)至hBMSCs后，qRT-PCR檢測(cè)miR-224的表達(dá)水平明顯升高(1.00±0.05 vs 5.53±0.12，P<0.05)。同時(shí)，ALP活性〔(0.85±0.06)U/g vs (0.37±0.03)U/g，P<0.05〕、OCN蛋白(0.39±0.04 vs 0.15±0.02)和Runx2蛋白(0.52±0.05 vs 0.32±0.03)的表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。如圖3可見，上調(diào)miR-224表達(dá)抑制hBMSCs向成骨細(xì)胞分化。

圖3 上調(diào)miR-224表達(dá)對(duì)hBMSCs向成骨細(xì)胞分化的影響

2.4miR-224靶向Smad4抑制hBMSCs向成骨細(xì)胞分化 以miRGEN軟件預(yù)測(cè)miR-224的靶基因發(fā)現(xiàn)，Smad4是miR-224的一個(gè)潛在靶基因。miR-224與Smad4有相關(guān)的綁定位點(diǎn)〔6〕，見圖4A。為了驗(yàn)證miR-224與Smad4間的靶向關(guān)系，以Western印跡檢測(cè)Smad4蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-224后Smad4蛋白的表達(dá)明顯下降(0.68±0.05 vs 0.46±0.03，P<0.05)，見圖4B。同時(shí)，根據(jù)熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的熒光素酶活性發(fā)現(xiàn)，與共轉(zhuǎn)染Smad4突變體和miR-224陰性對(duì)照相比，共轉(zhuǎn)染Smad4突變體和miR-224 mimics細(xì)胞的熒光素酶活性無(wú)明顯改變(1.06±0.08 vs 1.01±0.11，P>0.05)；但是，與共轉(zhuǎn)染Smad4野生型和miR-224陰性對(duì)照相比，共轉(zhuǎn)染Smad4野生型和miR-224mimics的細(xì)胞熒光素酶活性明顯降低(0.57±0.04 vs 0.35±0.02，P<0.05)?？梢姡琺iR-224可抑制Smad4的表達(dá)，進(jìn)而抑制hBMSCs向成骨細(xì)胞分化。

圖4 miR-224靶向Smad4的作用

2.5下調(diào)Smad4的表達(dá)抑制hBMSCs向成骨細(xì)胞分化 Smad4 siRNA使細(xì)胞中Smad4 蛋白表達(dá)顯著降低(0.57±0.08 vs 0.26±0.02，P<0.05)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)成骨分化相關(guān)蛋白OCN(0.45±0.03 vs 0.29±0.02)和Runx2(0.56±0.04 vs 0.40±0.03)的表達(dá)也明顯減弱(P<0.05)；此外，ALP活性也從對(duì)照的(0.83±0.05)U/g降為(0.52±0.03)U/g，差異顯著(P<0.05)。見圖5。可見，下調(diào)Smad4的表達(dá)能夠抑制hBMSCs向成骨細(xì)胞分化。

圖5 下調(diào)Smad4的表達(dá)對(duì)BMSCs向成骨細(xì)胞分化的影響

3 討 論

miR-224作為miRNAs家族中的重要成員，可通過(guò)調(diào)控不同的靶基因或信號(hào)通路參與細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程。miR-224是一種與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切的基因，在多種腫瘤中異常表達(dá)，可發(fā)揮促癌基因或抑癌基因的作用參與細(xì)胞的生物活動(dòng)。如Wang等〔7〕研究指出，miR-224在非小細(xì)胞肺癌患者組織中表達(dá)上調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可通過(guò)靶向調(diào)節(jié)RAS相關(guān)區(qū)域蛋白(RASSF)8促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖；Lin等〔8〕發(fā)現(xiàn)，miR-224在前列腺癌組織中低表達(dá)，上調(diào)其表達(dá)可通過(guò)下調(diào)Tribbles同源蛋白(TIRB)1抑制癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。除參與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展外，miR-224還參與干細(xì)胞的分化。如Na等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-224在小鼠的精原干細(xì)胞中高表達(dá)，可通過(guò)靶向Mab-3相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(DMRT)1表達(dá)促進(jìn)精原干細(xì)胞的分化。Choy等〔10〕報(bào)道稱，小鼠胚胎干細(xì)胞神經(jīng)分化過(guò)程中miR-224異常表達(dá)，過(guò)表達(dá)的miR-224通過(guò)靶向神經(jīng)元周期晝夜蛋白-芳基烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-專一蛋白Per-Arnt-Sim(PAS)結(jié)構(gòu)域蛋白(NPAS)4延緩了早期神經(jīng)分化。hBMSCs是骨組織工程中的重要種子細(xì)胞，深入研究其定向成骨分化的機(jī)制對(duì)提高干細(xì)胞修復(fù)組織缺損具有重要意義。有學(xué)者〔5〕發(fā)現(xiàn)，miR-224在hBMSCs成骨分化過(guò)程中低表達(dá)，但其具體的作用及調(diào)控機(jī)制尚不清楚。OCN和Runx2是成骨分化的的標(biāo)志蛋白，ALP活性是反映成骨活性和成骨能力的量化衡量標(biāo)準(zhǔn)〔11，12〕。本研究結(jié)果提示miR-224在成骨分化中發(fā)揮著重要的負(fù)向調(diào)控作用。

基因在機(jī)體內(nèi)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是一個(gè)龐大而又復(fù)雜的過(guò)程，同一個(gè)miRNA可調(diào)控多個(gè)靶基因，參與細(xì)胞的生理過(guò)程，發(fā)揮不同的作用。Chen等〔13〕指出，miR-224通過(guò)靶向白細(xì)胞分化抗原(CD40L)參與調(diào)節(jié)氧化低密度脂蛋白(oxLDL)刺激的樹突細(xì)胞成熟過(guò)程和促炎性細(xì)胞因子分泌；而Liu等〔14〕發(fā)現(xiàn)miR-224可通過(guò)靶向調(diào)控?；o酶A脫氫酶(ACADM)和乙醛脫氫酶(ALDH)2基因參與乳腺上皮細(xì)胞凋亡和三酰甘油產(chǎn)生。同時(shí)，一個(gè)靶基因又受到多個(gè)miRNA的共同調(diào)控，發(fā)揮不同的功效。如Lee等〔15〕研究證實(shí)，miR-431通過(guò)靶向Smad4促進(jìn)老年骨骼肌的分化和再生；Zhang等〔16〕發(fā)現(xiàn)，miR-146b-5p可通過(guò)直接靶向Smad4促進(jìn)多能干細(xì)胞的神經(jīng)轉(zhuǎn)化；同時(shí)，Anderson等〔17〕在軟骨細(xì)胞形成過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，miR-483可靶向Smad4抑制人hBMSCs向軟骨細(xì)胞分化。李鈞等〔18〕在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，miR-125b可靶向Smad4參與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化與增殖。

腫瘤生長(zhǎng)因子(TGF)-β是骨代謝過(guò)程中重要的轉(zhuǎn)化因子，其在間質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用〔19,20〕，Smad4作為Smad家族中的重要成員，可將TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)致胞核，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的功能，參與間質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過(guò)程〔21,22〕。提示miR-224可負(fù)向調(diào)控Smad4參與hBMSCs成骨分化。同時(shí)，熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了Smad4是miR-224靶基因。證實(shí)了miR-224是通過(guò)靶向Smad4抑制了hBMSCs成骨分化。但Smad4對(duì)hBMSCs成骨分化的抑制作用明顯低于miR-224。猜測(cè)，miR-224可能還通過(guò)其他途徑參與hBMSCs成骨分化過(guò)程。

綜上，miR-224通過(guò)靶向Smad4抑制hBMSCs成骨分化。這一結(jié)果為miR-224和Smad4有望成為治療骨折愈合和骨質(zhì)疏松等骨骼疾病的藥物靶點(diǎn)提供了參考依據(jù)。同時(shí)，miR-224除了通過(guò)靶向Smad4調(diào)控hBMSCs成骨分化外，可能還存在其他的調(diào)控機(jī)制，還需進(jìn)一步研究。