何峰，趙興昌，梁清洋，謝克恭，唐毓金，劉佳★

（1.右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色；2.安徽省明光市人民醫(yī)院 骨科，安徽 明光；3.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 百色）

0 引言

Cre-loxP[1]系統(tǒng)是一種條件性基因敲除（Conditional Knockout,CKO）技術(shù)，Cre 表示一種特異性位點(diǎn)重組酶，loxP就是一小段DNA 序列，大約長(zhǎng)34 bp。Cre 重組酶能介導(dǎo)兩個(gè)34 bp 的loxP 之間的位點(diǎn)特異性重組，使loxP 位點(diǎn)間的序列位點(diǎn)或基因被刪除。CKO 與全身性基因敲除（Knockout,KO）法不同，靶基因只局限在某一特定的細(xì)胞、組織、器官或生長(zhǎng)的某一特定階段，這種技術(shù)最大優(yōu)勢(shì)就是具有時(shí)空可控性和組織特異性[2]。經(jīng)過十多年的快速發(fā)展，這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)可以方便地為我們實(shí)現(xiàn)對(duì)小鼠特定發(fā)育階段或特定組織中的靶基因隨意編輯了。最近幾年，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用Cre-loxP 基因敲除技術(shù)造模研究膝骨關(guān)節(jié)炎（Knee Osteoarthritis,KOA）[3]明顯增加。隨著社會(huì)老齡化，KOA 的病人越來越多，至2020 年已經(jīng)成為導(dǎo)致老年人慢性殘疾的第四大罪魁禍?zhǔn)住OA 對(duì)人類膝關(guān)節(jié)威脅之大已成為廣大骨科醫(yī)生的共識(shí)，它屬于隨年齡增長(zhǎng)緩慢退變性疾病。當(dāng)前經(jīng)過調(diào)查國(guó)內(nèi)外大量相關(guān)文獻(xiàn)，綜合表明KOA 的發(fā)生是一個(gè)長(zhǎng)期復(fù)雜的過程，其最終共同的病理特點(diǎn)主要是膝關(guān)節(jié)的軟骨及軟骨下骨組織無菌性炎癥反應(yīng)、軟骨細(xì)胞凋亡破壞和軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的不斷丟失伴有骨贅增生。運(yùn)用新發(fā)現(xiàn)的基因做CKO 小鼠模型對(duì)于KOA 信號(hào)通路的研究有著重要意義[4]，也是Cre-loxP 基因敲除技術(shù)在KOA 的研究上有著無可比擬的優(yōu)勢(shì)所在，同時(shí)也拓展了我們對(duì)于KOA 的干預(yù)思路。近年來Cre-loxP 基因敲除技術(shù)發(fā)展日趨成熟，對(duì)生物體內(nèi)的靶點(diǎn)進(jìn)行基因敲除有助于更清楚地研究其功能，對(duì)臨床治療同樣意義非凡。

1 Cre-loxP 基因編輯技術(shù)

1.1 Cre-loxP 發(fā)展歷程

在上世紀(jì)80 年代，科學(xué)家們首次成功分離并在體外培養(yǎng)出了胚胎干細(xì)胞，Thompsson 等人在分子水平上利用相同來源的基因片段重新互補(bǔ)組合，即為基因敲除技術(shù)的核心所在。利用新產(chǎn)生的DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)功能截然不同，某些片段的功能可能丟失的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)出了基因敲除小鼠模型。2007年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)[5]授予了在基因修飾和老鼠胚胎干細(xì)胞技術(shù)研究領(lǐng)域取得重大突破的三位科學(xué)家，他們的研究成果就是發(fā)現(xiàn)了特殊的基因修飾技術(shù)和鼠胚胎干細(xì)胞分離技術(shù)，之后在這項(xiàng)技術(shù)上創(chuàng)造出了“基因敲除”。初期的基因敲除技術(shù)也就說通常所說的全身基因敲除（KO），后來經(jīng)過技術(shù)改進(jìn)逐漸發(fā)展為CKO。目前實(shí)際應(yīng)用比較多的是Cre-Loxp 技術(shù)和CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat,CRISPR）[6]/Cas9（相關(guān)蛋白核酸酶9）（CRISPR associated nuclease 9,Cas 9）技術(shù)[7]，還有最新的ZFN 和TAILEN 技術(shù)。

1.2 Cre-loxP 系統(tǒng)作用機(jī)制

首先經(jīng)由基因打靶技術(shù)在基因組的靶位點(diǎn)上插入兩個(gè)同向排列的1oxP 短片段基因，此時(shí)的靶基因尚未達(dá)到被敲除的目的，相關(guān)小鼠的表型仍同野生型一樣。Cre 基因的特點(diǎn)是能夠表達(dá)一種特別重要的酶叫做Cre 重組酶，編輯了不同Cre 重組酶的各種組織特異性的小鼠就是Cre 轉(zhuǎn)基因工具鼠，它的重要作用就是產(chǎn)生類似剪刀的切除功能，它能特異性識(shí)別1oxP 系列，在loxP 指引下能準(zhǔn)確切除目標(biāo)基因兩端同向1oxP 區(qū)間內(nèi)的一整段基因片段，還能使敲除后的片段環(huán)化，余下的兩條鏈重新連接；最后將設(shè)計(jì)好的“l(fā)oxP-floxed”小鼠與Cre 轉(zhuǎn)基因工具鼠雜交，雜交后產(chǎn)生的子代小鼠中將有一部分體內(nèi)同時(shí)攜帶“l(fā)oxP-floxed”靶基因和Cre 基因，它就是CKO 小鼠模型。在這個(gè)過程中，正是Cre 基因?yàn)槲覀冞_(dá)到了在特定組織或器官敲除靶基因的目的，因?yàn)橹灰袰re 重組酶的編碼序列置于某種特定基因啟動(dòng)子下，它就能在特定的目標(biāo)組織或器官中表達(dá)，凡是表達(dá)了Cre 的細(xì)胞，兩個(gè)同向排列的1oxP 間的靶基因都會(huì)被切除，這樣就實(shí)現(xiàn)了靶基因在何時(shí)何地發(fā)生敲除的可控性。Cre-loxP 系統(tǒng)作用機(jī)制[8]見圖1。

圖1 Cre-loxP 系統(tǒng)作用機(jī)制簡(jiǎn)圖

1.3 Cre-loxP 與其他基因編輯技術(shù)的比較

Cre-loxP CKO 較其他基因敲除技術(shù)的優(yōu)勢(shì)之處在于可以運(yùn)用一種靶基因編輯的“l(fā)oxP-floxed”小鼠與不同Cre 工具鼠搭配，達(dá)到靈活運(yùn)用研究靶基因在不同組織器官中的發(fā)生機(jī)制和影響，還能避免重要靶基因被敲除后小鼠的過早死亡現(xiàn)象。

基因誘捕技術(shù)是在小鼠基因敲除相關(guān)研究領(lǐng)域中又一重大發(fā)現(xiàn)。原理是通過一定的技術(shù)手段先隨機(jī)破壞靶基因，那么其對(duì)應(yīng)的功能也就喪失了，從而實(shí)現(xiàn)大規(guī)?；蚯贸呗浴＿\(yùn)用這項(xiàng)技術(shù)不但節(jié)約成本而且快速有效[9]；但也有很多弊端，如在基因誘捕過程中發(fā)生載體的部分片段丟失；還有可能隨機(jī)發(fā)生一大段基因的誤刪除等情況。

CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)有多點(diǎn)編輯效率高、可操縱性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，但存在脫靶、錯(cuò)配的情況，只有進(jìn)一步提高安全性和降低操作成本才能被廣泛應(yīng)用。

雖然目前Cre-loxP CKO 技術(shù)被應(yīng)用較多，但也存在諸多尚待解決的問題如小鼠的擴(kuò)繁過程繁瑣；Flox 純合并且Cre雜合的小鼠模型獲得周期太長(zhǎng)；得到批量模型動(dòng)物付出的成本較高；Cre 重組酶在體內(nèi)造成嚴(yán)重的細(xì)胞毒作用等。

總之，Cre-loxP CKO 基因敲除技術(shù)為我們研究探索靶基因在體內(nèi)的功能打開了另一扇門，利用Cre-loxP 系統(tǒng)來生產(chǎn)特定基因敲除小鼠仍是目前一種強(qiáng)大且已成熟的策略。

2 膝骨關(guān)節(jié)炎

膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）對(duì)人類膝關(guān)節(jié)威脅之大已為廣大骨科醫(yī)生所認(rèn)同，國(guó)際骨科大會(huì)曾多次討論過該課題。KOA 最常發(fā)生于中老年人群，呈現(xiàn)病程長(zhǎng)、進(jìn)展慢的特點(diǎn)，晚期對(duì)膝關(guān)節(jié)破壞嚴(yán)重。病理特征為軟骨細(xì)胞被持續(xù)破壞而數(shù)量減少，軟骨下骨暴露且硬化重建。至2020 年已經(jīng)成為導(dǎo)致老年人慢性殘疾的第四大罪魁禍?zhǔn)?。?dāng)前經(jīng)過調(diào)查國(guó)內(nèi)外大量相關(guān)文獻(xiàn)，綜合表明KOA 的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的長(zhǎng)期綜合作用導(dǎo)致的結(jié)果，是多因素疊加后相互影響所致的疾病，但是進(jìn)展是緩慢且漸進(jìn)的，其最終共同的病理特點(diǎn)主要都是無菌性炎癥反應(yīng)、軟骨細(xì)胞凋亡破壞和軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的不斷丟失伴有骨贅增生。其中基質(zhì)是指關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞之外的部分，它的減少是占據(jù)主導(dǎo)地位的，因?yàn)檐浌羌?xì)胞外基質(zhì)直接營(yíng)養(yǎng)軟骨細(xì)胞，它發(fā)生了分解代謝，則軟骨細(xì)胞生存困難，于是軟骨降解而最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎。

3 Cre-loxP 技術(shù)在KOA 相關(guān)基因研究中的應(yīng)用

探索KOA 相關(guān)基因的致病機(jī)制已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，近5 年來關(guān)于利用CKO 小鼠來作為KOA 研究模型的文獻(xiàn)數(shù)量呈逐年上漲的趨勢(shì)。在PUBMED 對(duì)2015年1月1日至2020年6月30日的文獻(xiàn)以關(guān)鍵詞mouse/mice 和osteoarthritis/OA 檢索，有40 篇用到基因敲除小鼠，排除了8篇不完全相關(guān)文獻(xiàn)，余下的24 篇[相關(guān)基因：TNFα、GRK5、Smo、HTRA1、microRNA-485-5p、Elf3、IkappaBzeta、Fyn、ERRγ、CCL2/CCR2、Crtac1、HSPG-2、Dio2、BATF、TCF7L2、JNK-2、BMAL1、HSP70、TRPA1、Notch、Bach1、Drosha、ECS、（HIF）-2a] 是關(guān)于研究誘導(dǎo)型KOA 基因的，8 篇（相關(guān)基因：Sost、FGFR3、IL-4、Enpp1、A2AR、Matn1、MTs、DUSP1）是關(guān)于研究預(yù)防型KOA 基因的。

這些新篩選的基因是目前骨性關(guān)節(jié)炎研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，系統(tǒng)歸類最新發(fā)現(xiàn)的CKO 基因?qū)τ谶M(jìn)一步研究它們?cè)贙OA中的作用機(jī)制是必要的。本文中基因符號(hào)的單詞書寫形式因?yàn)闆]有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，所以只能根據(jù)它的來源文獻(xiàn)確定，故而這些符號(hào)與官方文書中的寫法可能有所不同，所有統(tǒng)計(jì)的文獻(xiàn)中關(guān)于CKO 基因的研究效果評(píng)價(jià)都是建立在與野生型小鼠的效果對(duì)照比較而得出的結(jié)論，具有客觀性。但是其真實(shí)效果還應(yīng)該得到進(jìn)一步擴(kuò)大認(rèn)證才可最終確定，這樣才更具有科學(xué)的說服力。但是，經(jīng)過仔細(xì)研究文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)其中部分文獻(xiàn)對(duì)于Sost 這個(gè)基因的功能研究還存在爭(zhēng)議。Veronesi F 等人[10]研究后得出這樣一個(gè)結(jié)論，認(rèn)為對(duì)KOA 無影響基因中就包括Sost 基因。而Li J 等人[11]卻在自己的研究結(jié)論中闡明Sost 是KOA 的一個(gè)保護(hù)型基因。為了解決這一爭(zhēng)議問題還需更深入地開展研究以證實(shí)其確切功能。

4 Cre-loxP 技術(shù)在KOA 領(lǐng)域的應(yīng)用前景

4.1 信號(hào)通路的研究

Cre-loxP 技術(shù)在動(dòng)物體內(nèi)水平研究基因功能是一種高效的方法，而且也是研究目的基因表達(dá)變化和調(diào)控機(jī)制信號(hào)通路的有效手段。近些年來世界許多骨科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室都在基因?qū)用鎳L試研究KOA 相關(guān)的基因及其信號(hào)傳導(dǎo)通路，已通過此項(xiàng)技術(shù)發(fā)現(xiàn)了較多影響KOA 的信號(hào)通路。如Wnt/β-catenin、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian Target Of Rapamycin,mTORC）信號(hào)通路等。如果在對(duì)這些重要信號(hào)通路的研究中發(fā)現(xiàn)可以解決KOA 治療的靶點(diǎn)，對(duì)臨床來說意義重大。

4.2 KOA 動(dòng)物模型的建立

我們知道KOA 是一種與年齡相關(guān)的退行性疾病，想要更好地研究KOA 發(fā)病機(jī)制及防治辦法，前提條件是建立接近自然病理狀態(tài)的動(dòng)物KOA 模型，這樣才能獲得對(duì)病理機(jī)制和臨床治療研究的更為準(zhǔn)確的結(jié)果。目前國(guó)際KOA 研究領(lǐng)域構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型主要是Cre-loxP 條件基因敲除小鼠，它與經(jīng)典的動(dòng)物模型相比有明顯的優(yōu)勢(shì)，如對(duì)于KOA 研究除了這種模型小鼠在基因修飾方面無可比擬的優(yōu)勢(shì)以外，小鼠的遺傳背景清晰、混雜因素少、疾病可復(fù)制性好、總體可控及操作相對(duì)簡(jiǎn)單等好處都是顯而易見。但是，目前購(gòu)買轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的價(jià)格昂貴，飼養(yǎng)時(shí)對(duì)環(huán)境及飲食要求高，成本增加。而且建立較大體型的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)尚未突破，目前小鼠因體積較小造成手術(shù)操作難度加大、以及基因檢測(cè)鑒定程序繁瑣過程復(fù)雜等，這些無疑都限制了它的廣泛應(yīng)用。相信隨著對(duì)Cre-loxP 技術(shù)更深入地研究，KOA 模型動(dòng)物的培育技術(shù)會(huì)不斷改進(jìn)，成本也會(huì)逐漸下降，操作過程也會(huì)更加簡(jiǎn)單方便，相信這項(xiàng)技術(shù)一定會(huì)為KOA 的深入研究做出更大貢獻(xiàn)。