蘇銀池 高 娜 岳婷婷 李靜茹 連真真 閆 磊

（1. 河南省種牛遺傳性能測定中心， 鄭州 450000； 2. 河南省奶牛生產(chǎn)性能測定有限公司， 鄭州 450000；3. 河南省奶牛生產(chǎn)性能測定中心， 鄭州 450000）

四環(huán)素類抗生素是由放線菌產(chǎn)生的一類抗生素， 高濃度時具有殺菌作用， 因對原蟲、 衣原體、霉形體、 螺旋體、 革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都具有抑制作用， 因此又被稱為廣譜抗生素[1～5]。 該類抗生素主要包括土霉素、 四環(huán)素、 多西環(huán)素和金霉素等。 目前， 四環(huán)素類抗生素已經(jīng)被廣泛應用于動物疾病的預防和治療上以及作為添加劑添加到飼料中[6～10]。 我國《飼料藥物添加劑使用規(guī)范》 對豬、雞等動物飼料中允許添加的土霉素和金霉素含量規(guī)格進行了規(guī)范[11]， 但是由于四環(huán)素類抗生素易溶于水， 而且在環(huán)境中不容易降解， 食用了含有四環(huán)素類抗生素的飼料或者接受了四環(huán)素類抗生素治療的奶牛， 雖然一部分藥物會產(chǎn)生效用并分解， 但是大部分藥物會隨著糞便、 牛奶和尿液排放出來。 人飲用了含有四環(huán)素藥物殘留的牛奶后， 藥物在肝臟、牙齒和骨骼中容易產(chǎn)生積累， 當積累到一定程度便會造成過敏反應、 影響腸道菌群和導致胎兒畸形等危害[12～17]。 因此農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于 2018 年出臺了 《獸用抗菌藥使用減量化行動試點工作方案 （2018－2021 年）》， 以期在有限時間內(nèi)盡可能減少藥物作為飼料添加劑用于養(yǎng)殖過程中的飼養(yǎng)模式[18]。

目前檢測四環(huán)素類抗生素藥物常用的方法有分光光度法、 化學發(fā)光法、 免疫法、 毛細管電泳法、薄層色譜法、 液相色譜法和液質聯(lián)用法等[19～23]。傳統(tǒng)的分光光度法、 化學發(fā)光法、 毛細管電泳法、薄層色譜法操作快捷簡便， 但靈敏度很低[24～25]；免疫學檢測靈敏度較強， 也更加快速[26～27]， 但是由于非特異性吸附， 容易出現(xiàn)假陽性或者假陰性。 以上方法普遍存在基質效應過高、 靈敏度過低的問題。隨著科技的進步， 光譜、 色譜等技術被越來越多地用于生產(chǎn)實踐中[28]。 液相色譜－串聯(lián)質譜法 （LCMS/MS） 由于其良好的色譜分離能力以及質譜的高靈敏度和選擇性， 能夠對多種四環(huán)素類藥物同時進行化學組分定量和定性分析， 且由于其智能化和機械性操作， 處理后的多個樣品能夠完全機械化上機進樣， 省時省力[29]。 但目前的方法提取過程、 儀器型號復雜多樣， 且國家標準方法中還沒有專門針對生鮮乳中四環(huán)素類藥物殘留檢測的液質方法。 因此， 本文在傳統(tǒng)方法基礎上， 研究建立生鮮乳中四環(huán)素類藥物殘留的液質聯(lián)用檢測方法， 旨在為生鮮乳中四環(huán)素類藥物殘留的檢測提供參考。

一、 材料與方法

（一） 實驗材料

1.試劑耗材。 對照品： 鹽酸四環(huán)素 （純度96.2%）、 鹽酸土霉素 （純度 96.0%）、 鹽酸金霉素（純度92.5%）、 鹽酸多西環(huán)素 （純度98.7%） 均購自 Dr.Ehrenstorfer GmbH； 甲醇、 乙腈和甲酸 （色譜純， 德國默克集團）； 乙二胺四乙酸二鈉 （分析純， 天津市大茂化學試劑廠）。 固相萃取柱： Agela Cleanert PEP－2 SPE （200 mg， 6 mL）。

2. 儀器與設備。 超高效液相色譜－串聯(lián)三重四極桿質譜聯(lián)用儀 （1290 Infinity Ⅱ－6460 Triple Quad， 安捷倫公司， 美 國）； 超純 水儀 （FIMA03180E， Millipore synergy， 美國）； 電子天平（ME204E102， Mettler Toledo， 瑞士）； 電子天平（SSartorius， 德國）。

3. 溶液配制。 （1） 標準儲備液： 準確稱取適量鹽酸四環(huán)素、 鹽酸土霉素、 鹽酸金霉素、 鹽酸多西環(huán)素標準品， 分別用甲醇溶解并定容至100 mL，配制成濃度為0.1 mg/mL 的標準儲備液， 冷凍保存。 （2） 混合標準工作液： 根據(jù)需要， 用初始流動相將標準儲備液稀釋成系列濃度的標準工作液。（3）Mcllvaine 緩沖溶液： 將 1 000 mL 0.1 mol/L 檸檬酸溶液與625 mL 0.2 mol/L 磷酸氫二鈉溶液混合， 用氫氧化鈉或鹽酸調節(jié)pH 至4.0。 Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液： 稱取60.5 g 乙二胺四乙酸二鈉溶于上述配制好的Mcllvaine 緩沖溶液中， 必要時可超聲。

（二） 實驗方法

1. 色譜條件。 色譜柱為 C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）； 柱溫為 30℃； 進樣體積為 20 μL； 流動相A 為0.1%甲酸水， B 為乙腈， 梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫程序

2. 質譜參數(shù)。 離子源為 ESI； 離子化模式為正離子模式； 干燥氣溫度為350℃； 干燥氣流速為11 L/min； 干燥氣壓力為40psi； 毛細管電壓為4 000V。

3.提取與凈化。 （1） 提取。 稱取混合均勻的生鮮乳 5 g 于 50 mL 離心管中， 加入 0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine 提取液溶解并定容至50 mL， 渦旋振蕩混合均勻， 超聲提取10 min， 轉移至聚丙烯離心管中， 0～4℃條件下， 6 000 r/min 離心 10 min， 用快速濾紙過濾， 待凈化。 （2） 凈化。 準確吸取 10 mL 濾液以 1 滴 /s 的速度過 HLB 柱 （使用前依次用5 mL 甲醇和5 mL 水進行預處理）， 待樣液完全流出后， 依次用5 mL 水和5%甲醇水溶液淋洗，棄去全部流出液。 最后用8 mL 的甲醇+乙酸乙酯（V∶V＝1∶9） 進行洗脫， 收集洗脫液， 將洗脫液在40℃下用氮氣吹干， 用初始流動相1 mL 復溶，濾膜過濾， 供超高效液相色譜－質譜聯(lián)用儀測定。

二、 結果與討論

（一） 質譜條件優(yōu)化采用ESI 源 （電噴霧離子源） 對四環(huán)素、 土霉素、 金霉素和多西環(huán)素的標準溶液進行掃描， 通過優(yōu)化解離電壓， 讓準離子分子[M+H]+豐度達到最大， 通過優(yōu)化碰撞電壓， 使子離子的豐度最大化， 選擇干擾小和豐度大的離子作為定性離子和定量離子。 4 種化合物的一級、 二級質譜圖見圖1～圖4， 優(yōu)化后的質譜參數(shù)見表2。

表2 質譜參數(shù)

圖1 四環(huán)素一級、二級質譜圖

圖2 土霉素一級、二級質譜圖

圖3 金霉素一級、二級質譜圖

圖4 多西環(huán)素一級、二級質譜圖

（二） 液相色譜條件優(yōu)化化合物采用正離子模式進行掃描， 在軟電離過程， 化合物需要獲得H+， 因此本實驗采用以0.1%的甲酸和乙腈為流動相， 進行梯度洗脫。 為了獲得良好的化合物峰形，并且讓化合物之間得到良好的分離， 本文對梯度洗脫條件進行優(yōu)化。 4 種化合物的混合標準溶液的總離子流圖見圖5， 從圖中可以看出， 4 種化合物得到很好的分離， 峰尖峭， 且峰形對稱， 無雜質干擾。

圖5 4 種化合物總離子流圖

本研究在流動相的選擇上并未使用三氟乙酸溶液， 而采用了0.1%的甲酸水作為水相。 隨著儀器精密度的增高， 對所用試劑的純度和要求也越來越高， 三氟乙酸作為一種強揮發(fā)性酸， 不僅有輕微的毒性， 且存在很強的背景干擾， 尤其是對于負離子模式下有很強的離子抑制作用， 同時會殘留污染質譜。 因此選擇0.1%的甲酸水和乙腈作為本方法的A 相和B 相， 經(jīng)優(yōu)化后按照本方法設置的流動相梯度進行試驗分離效果較好， 分離時間為7 min，比國家標準方法用時縮短了2/3。 且為了盡可能減少儀器殘留和過載， 本法降低了進樣量， 比國家標準方法進樣量減少1/3。

（三） 線性范圍根據(jù)上述的儀器條件， 對標準溶液進行測定， 以四環(huán)素類藥物的濃度為橫坐標， 響應面積為縱坐標繪制校準曲線， 如圖6 所示， 四環(huán)素、 土霉素、 金霉素和多西環(huán)素在1.0～500 ng/mL 濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系， 相關系數(shù)R2＞0.999， 回歸方程及相關系數(shù)見圖6。

圖6 4 種化合物的回歸方程及相關系數(shù)

（四） 固相萃取柱的篩選本研究在進行固相萃取凈化時所取濾液為10 mL， 若使用規(guī)格為60 mg、 3 mL 的固相萃取柱會增加柱子的負荷， 延長過柱時間。 通過對不同廠家、 不同型號以及不同規(guī)格的固相萃取柱進行篩選， 發(fā)現(xiàn)在相同的提取效率下， 使用規(guī)格為 200 mg、 6 mL 的 Agela Cleanert PEP－2 SPE 固相萃取柱時， 能夠很大程度上增加過柱速率， 縮短過柱時間， 降低成本。

（五） 準確度及精密度實驗在空白樣品中加入不同濃度的四環(huán)素、 土霉素、 金霉素和多西環(huán)素的混合標準溶液， 加入量分別 5、 10、 50 和 100 μg/kg， 每個加標量同時做6 個平行實驗， 按照上文的實驗條件進行樣品處理， 通過數(shù)據(jù)處理計算方法的回收率和相對標準偏差 （RSD）， 結果見表3。在4 個不同加標量水平條件下， 回收率在74.1%～106.8%范圍內(nèi)，RSD≤3.3%（n＝6）。 國家標準中RSD在2.2%～7.4%范圍內(nèi)， 與國家標準相比， 本方法具有更好的精密度。

表3 4 種化合物的回收率和精密度 （n＝6）

（六） 檢出限該方法的檢出限（LOD）通過信噪比 （S/N）≥3 來確定， 在空白生鮮乳樣品中加入四環(huán)素、 土霉素、 金霉素和多西環(huán)素的混合標準溶液， 使其濃度為0.5 μg/kg。 各個目標分析物的多反應監(jiān)測圖見圖7， 從圖中可以看出， 四環(huán)素、 土霉素、 金霉素和多西環(huán)素的方法檢出限為0.5 μg/kg，而國家標準方法檢出限為50 μg/kg。

（七） 定量限該方法的定量限 （LOQ） 通過信噪比（S/N）≥10 來確定， 在空白生鮮乳樣品中加入四環(huán)素、 土霉素、 金霉素和多西環(huán)素的混合標準溶液， 使其濃度為1.0 μg/kg。 各個目標分析物定量限的多反應監(jiān)測圖見圖7， 從圖中可以看出， 四環(huán)素、 土霉素、 金霉素和多西環(huán)素的方法定量限為1.0 μg/kg。

圖7 4 種化合物檢出限與定量限的多反應監(jiān)測圖

三、 結論

本文建立了超高效液相色譜串聯(lián)質譜測定生鮮乳中四環(huán)素、 土霉素、 金霉素和多西環(huán)素殘留的方法。 通過優(yōu)化儀器條件和前處理條件， 確定了該方法的檢出限為 0.5 μg/kg， 定量限為 1.0 μg/kg。 通過加標回收和平行測定實驗， 確定了準確度和精密度， 結果表明， 該方法具有靈敏度高、 特異性好、重復性高和操作簡單等優(yōu)點， 是測定生鮮乳中四環(huán)素類抗生素藥物殘留的理想方法。