賀光云 侯 雪 閆志農(nóng) 周 熙 韓 梅 邱世婷 李 瑩羅 蘋 覃蜀迪

（1. 四川省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所， 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室 （成都）， 成都 610066； 2. 四川省綠色食品發(fā)展中心， 成都 610041）

農(nóng)產(chǎn)品地理標志是指標示農(nóng)產(chǎn)品來源于特定地域， 產(chǎn)品品質(zhì)和相關(guān)特征主要取決于自然生態(tài)環(huán)境和歷史人文因素， 并以地域名稱冠名的特有農(nóng)產(chǎn)品標志， 是一種質(zhì)量品質(zhì)屬性和文化標志[1]。 農(nóng)產(chǎn)品地理標志與無公害農(nóng)產(chǎn)品、 綠色食品、 有機農(nóng)產(chǎn)品為傳統(tǒng) “三品一標”， 是國家安全優(yōu)質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品公共品牌， 農(nóng)產(chǎn)品地理標志突出的是農(nóng)產(chǎn)品品牌，“三品” 強調(diào)的是農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全[2]。 2021 年， 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部啟動實施農(nóng)業(yè)生產(chǎn) “三品一標”（品種培優(yōu)、 品質(zhì)提升、 品牌打造和標準化生產(chǎn)） 提升行動， 更高層次、 更深領(lǐng)域推進農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展。

茶葉， 作為一種兼具獨特風味特征和有益人體健康的農(nóng)產(chǎn)品， 其品質(zhì)由其內(nèi)含物質(zhì)所決定， 而茶葉的生化成分和滋味品質(zhì)與茶樹的生長環(huán)境和氣候條件等因素密切相關(guān)， 因此， 茶葉品質(zhì)存在明顯的地域差異和很強的“風土”特征[3～5]。 茶葉是我國特色地理標志性產(chǎn)品， 具有區(qū)域資源優(yōu)勢和深厚的文化底蘊。 2021 年3 月1 日， 《中歐地理標志協(xié)定》正式生效， 預示著中歐雙方更多特色優(yōu)質(zhì)名品將進入彼此市場， 為中歐企業(yè)提供知識產(chǎn)權(quán)保護， 也為我國地理標志農(nóng)產(chǎn)品提升知名度、 開拓海外市場提供新的機遇。 我國首批100 個入選地理標志產(chǎn)品中有28 個茶葉， 占比幾近三成， 其中四川的 “蒲江雀舌”“峨眉山茶”及“納溪特早茶” 榜上有名[6]。 產(chǎn)地是消費者選購茶葉的重要依據(jù)之一， 產(chǎn)地溯源可保證茶葉的真實性， 保護消費者利益， 促進品牌培育與保護， 防止產(chǎn)地造假、 以次充好等現(xiàn)象， 為維護茶葉市場秩序提供技術(shù)支持。 目前， 穩(wěn)定同位素、 礦物元素、 稀土元素、 近紅外光譜及代謝組學等分析技術(shù)與化學計量學模型結(jié)合是茶葉產(chǎn)地溯源的有效手段。 液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) （LC－MS）因其高通量和高靈敏度優(yōu)勢已成為代謝組學最常用的分析技術(shù)[7～10]。

本研究采用超高效液相色譜－四極桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜 （UPLC－QTOF－MS） 技術(shù)， 結(jié)合多元統(tǒng)計分析， 對四川省雅安、 宜賓和綿陽3 個產(chǎn)區(qū)綠茶進行產(chǎn)地溯源研究。 利用 MarkerView 1.3.1 和SIMCA 14.1 軟件對數(shù)據(jù)進行主成分分析與判別分析 （PCA－DA） 及雙向正交偏最小二乘－判別分析 （O2PLS－DA）， 對不同產(chǎn)區(qū)綠茶構(gòu)建分類模型， 探明不同產(chǎn)地茶葉化學成分是否存在顯著性差異， 并對模型預測能力進行評價。 結(jié)合VIP 分析和t檢驗， 篩選出50 個具有統(tǒng)計學差異的化合物（VIP＞1，p＜0.01）。 本研究旨在為茶葉的產(chǎn)地溯源和質(zhì)量評價提供理論依據(jù)。

一、 材料與方法

（一） 儀器與試劑Nexera X2 型超高效液相色譜儀， 日本島津公司； SCIEX Triple TOF?5600高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)， 美國 SCIEX 公司； WH－3 微型渦旋混合儀， 上海路西分析儀器有限公司。

甲醇、 乙腈和甲酸均為色譜純， 美國Fisher Scientific 公司。

（二） 樣品采集及處理本實驗所用綠茶樣品分別為宜賓早茶、 北川茶葉和蒙頂山茶地理標志產(chǎn)品， 分別采自四川省宜賓市屏山縣、 綿陽市北川縣和雅安市名山區(qū)， 采摘時間為2020 年3－4 月， 每組10 個樣品分別采自3 個茶園， 共計30 個樣品。

樣品的提取模擬日常飲茶方式， 以茶湯為分析目標[11～12]。 稱取 2.0 g 茶葉置于 500 mL 燒瓶中， 加入 300 mL 開水 （80℃）， 浸泡 30 min。 取 1mL 茶湯， 過 0.22 μm 濾膜后進行 UPLC－QTOF－MS 分析， 每個樣品做3 個平行。

（三） 儀器條件色譜條件： Kinetex 2.6 μm Biphenyl 色譜柱 （2.1 mm×100 mm， 100A）； 流動相： 水相為0.1%甲酸水溶液 （A 相）， 有機相為甲醇 / 乙 腈 （V/V＝30/70， B 相 ）； 流 速 ： 0.40 mL/min； 進樣量： 5 μL； 柱溫： 40℃。 梯度洗脫程序： 0～4 min， 3%B； 4～6 min， 3%B→5%B；6～10 min， 5%B→20%B； 10～15 min， 20%B→50% B； 15 ～16 min， 50%B →60% B； 16 ～18 min， 95%B； 18～20 min， 3%B。

質(zhì)譜條件： 采用電噴霧離子源 （ESI） 在負離子模式下進行全掃描， 一級質(zhì)譜質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 000， 二級質(zhì)譜質(zhì)量掃描范圍m/z50 ～1 000， 在每個循環(huán)內(nèi)同時進行10 個MS/MS 掃描；噴霧電壓為－4 500 V； 工作氣為氮氣， 霧化氣、 輔助加熱氣和氣簾氣壓力分別為 50、 50、 35 psi； 離子源溫度 450℃； 錐孔電壓 （DP） －80V； 離子釋放延遲， 67 V； 離子釋放寬度， 25 V； MS/MS 模式下的碰撞能量為 （40±20） V。

（四） 數(shù)據(jù)處理與多元統(tǒng)計學分析使用MarkerView 1.3.1 軟件進行數(shù)據(jù)預處理。 處理參數(shù)設置如下： 時間范圍0.4～17.5 min； 質(zhì)譜范圍m/z100～1 000； 保留時間窗口 0.2 min； 質(zhì)量偏差0.01； 最小強度 1% ； 變化峰強度閾值 100； 去除少于3 個樣本中出現(xiàn)的峰， 最大峰數(shù)目8 000， 除去同位素峰， 對數(shù)據(jù)進行分組并進行峰面積歸一化完成對數(shù)據(jù)的標準化處理， 提取到7 192 個峰。 首先利用 MarkerView 1.3.1 軟件中的PCA 數(shù)據(jù)處理方法進行分析， 并進行分組t檢驗。 同時， 將提取到的峰值數(shù)據(jù)集導入SIMCA 14.1 軟件進行PCADA 和 O2PLS－DA 分析。

二、 結(jié)果與討論

（一） UPLC-QTOF-MS 分析采用 UPLCQTOF－MS 技術(shù)[13]在負離子模式下分析了四川省宜賓、 綿陽、 雅安3 個產(chǎn)區(qū)綠茶的代謝產(chǎn)物， 得到總離子流圖 （TIC 圖， 見圖 1）。 在該條件下樣品得到了良好的色譜分離及較強的離子強度峰。 從圖1中可以看出， 樣品的離子峰主要出現(xiàn)在0.4～17.5 min， 其中8～12 min 離子峰較為集中。 總體看來，除了保留時間約2 min、 5 min 和10 min 處離子峰強度在雅安和綿陽產(chǎn)綠茶中高于宜賓產(chǎn)綠茶外， 3個產(chǎn)地茶葉的出峰數(shù)量和相對豐度觀察不到其他明顯差異。 因此， 需要進一步通過多元統(tǒng)計方法對數(shù)據(jù)進行挖掘與分析。

圖1 不同產(chǎn)地綠茶的總離子流圖

（二） 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

1. 分類模型建立。 UPLC－QTOF－MS 原始譜圖經(jīng)過分段積分、 濾噪、 峰匹配、 標準化和歸一化處理后得到包括7 192 個峰變量、 保留時間及峰面積構(gòu)成的數(shù)據(jù)集。 采用MarkerView 1.3.1 軟件進行PCA－DA 分析[14]， 選擇 Pareto 方法對數(shù)據(jù)進行縮放， 模型得分圖見圖2（a）。 可以看出 3 個產(chǎn)地茶葉樣品點各自聚集在不同區(qū)域， 宜賓產(chǎn)綠茶樣品主要分布在主成分1 的負半軸和主成分2 的中間位置，而綿陽產(chǎn)綠茶主要分布在主成分1 的中間和主成分2 的正半軸， 雅安產(chǎn)綠茶分布在主成分1 的正半軸和主成分2 的負半軸。 主成分1 和2 的貢獻率分別為50.5%和49.5%， 累計貢獻率達到100%， 說明前2 個主成分就能夠充分反映原始數(shù)據(jù)信息， 只是樣品的聚集程度不夠理想。

PLS－DA 分析屬于有監(jiān)督的模式識別方法，其有效降低組內(nèi)個體差異對模型的影響， 突出樣本組間差異， 有利于尋找差異性代謝物[15]。 將數(shù)據(jù)集進行 PLS－DA 分析， 結(jié)果見圖 2（b）。 可以看出， 3個產(chǎn)地茶葉基本實現(xiàn)有效區(qū)別， 雅安地區(qū)茶葉樣本聚集程度最好， 而來自綿陽和宜賓的茶葉樣本可能是因為采樣區(qū)域跨度較大， 得分圖中樣品點仍然比較分散。 該模型的 R2X （cum） ＝0.573， R2Y （cum）＝0.774， Q2（cum） ＝0.763， R2和 Q2均＞0.5， 說明模型已具有較強的解釋能力和預測能力。

O2PLS－DA 分析是經(jīng)典的最小二乘法CLS 和OPLS 的結(jié)合， O2PLS－DA 建立一個線性隱藏變量模型， 在分別代表類型數(shù)據(jù)的X 和Y 矩陣之間的2 個方向上進行預測， 進一步提高了模型的解釋功能， 具有更優(yōu)越的預測性能[16]。 為了提高分類識別效果， 進一步對數(shù)據(jù)進行O2PLS－DA 分析， 模型得分圖見圖 2（c）。 可以看出， 3 個產(chǎn)地茶葉樣本分離和聚集程度均大大提高。 R2和Q2為數(shù)據(jù)模型質(zhì)量參數(shù)， 數(shù)值越接近1 說明模型的擬合效果和預測能力越好[17]。 該模型中 R2X （cum） ＝0.958， R2Y（cum） ＝0.923， Q2（cum） ＝0.912， 說明模型具有優(yōu)異的預測能力。

從圖2 中還可以看出， 在3 種模型下宜賓產(chǎn)綠茶和雅安產(chǎn)綠茶樣品之間的距離均最遠， 表明這2個產(chǎn)地綠茶間代謝物差異性最大， 而綿陽產(chǎn)綠茶與二者之間的代謝物差異相對較小。

圖2 不同產(chǎn)地綠茶的多元統(tǒng)計分析

采用置換檢驗 （permutation test） 對模型的可靠性進行驗證[18]， 置換檢驗次數(shù)為200 次， 結(jié)果見圖3。 從圖3 中可以看出， 原始模型的預測能力（即Q2值） 大于左邊任何一個Y 變量隨機排列模型的 Q2值， 宜賓、 綿陽、 雅安綠茶的 Q2分別為（0.0， －0.308）、 （0.0， －0.302） 和 （0.0， －0.305），在y 軸上的截距均＜0， 表明模型沒有出現(xiàn)過擬合，可靠性較好。

圖3 不同產(chǎn)地綠茶的O2PLS－DA 置換檢驗結(jié)果多元統(tǒng)計分析

2. 差異代謝物篩選。 產(chǎn)地溯源研究的關(guān)鍵是篩選出能表征地域信息的有效溯源指標， 建立判別模型。 O2PLS－DA 模型的變量投影重要性 （variable importance in the project， VIP） 在代謝組學研究中是一個常用的判斷差異性代謝物的標準， 其值代表了物質(zhì)對組間分離的貢獻， VIP＞1 表明此物質(zhì)為可能的潛在差異性代謝物[19]。 本研究首先采用VIP 值篩選出對組間區(qū)分貢獻大的變量， 再結(jié)合t檢驗中p值 （＜0.01） 對差異性成分進行逐步過濾，原始代謝物的數(shù)量逐步減少， 將初步篩選的離子質(zhì)荷比輸入PeakView 1.3.1 軟件中提取相應的離子峰， 選擇峰型好、 響應高、 二級質(zhì)譜圖質(zhì)量良好的離子峰， 最終獲得50 個具有統(tǒng)計學差異的化合物（VIP＞1，p＜0.01）[20]， 其質(zhì)荷比 （m/z）、 保留時間（RT） 及 統(tǒng)計學 信 息見 表 1。 初 步 判 斷 ，m/z289.0712、 305.0658、 441.0829 及 457.0782 分別為（－）－表兒茶素、 （－）－表沒食子兒茶素、 （－）－兒茶素沒食子酸酯、 （－）－表沒食子兒茶素沒食子酸酯及其異構(gòu)體， 可見， 兒茶素類在不同產(chǎn)地綠茶間代謝差異顯著[21～22]， 可以作為綠茶產(chǎn)地溯源的部分指標， 其他差異組分的結(jié)構(gòu)鑒定及代謝機理有待進一步研究。

表1 50 個統(tǒng)計學差異的化合物 （VIP＞1， p＜0.01）

續(xù)表1

將篩選出的50 個差異成分作為特征變量建立統(tǒng)計模型 O2PLS－DA， 結(jié)果見圖 4。 可以看出 3個產(chǎn)區(qū)的綠茶樣品可以有效區(qū)分， 模型的典型相關(guān)系數(shù) R2X（cum）＝0.983， R2Y（cum）＝0.887， 說明98.3%的變量可解釋88.7%的組間差異， Q2（cum）＝0.849， 表明該模型具有較好的預測能力[17]。

圖4 不同產(chǎn)地綠茶基于50 個差異成分的O2PLS-DA得分圖

三、 結(jié)論

本研究基于茶葉的生化成分和滋味品質(zhì)與茶樹的生長環(huán)境和氣候條件等因素的密切關(guān)聯(lián)， 采用UPLC－QTOF－MS 分析技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計方法，建立了四川省雅安、 宜賓和綿陽3 個產(chǎn)區(qū)綠茶的產(chǎn)地溯源方法。 分別通過主成分分析與判別分析（PCA－DA） 及雙向正交偏最小二乘－判別分析（O2PLS－DA） 對不同產(chǎn)區(qū)綠茶構(gòu)建分類模型， 典型相關(guān)系數(shù)及置換檢驗 （permutation test） 表明O2PLS－DA 模型具有優(yōu)異的預測能力。 結(jié)合VIP分析和t檢驗， 初步篩選出50 個存在統(tǒng)計學差異的化合物 （VIP＞1，p＜0.01）。 有關(guān)差異代謝物的結(jié)構(gòu)鑒定及代謝機理有待進一步研究。 本研究建立的分類模型為茶葉的產(chǎn)地溯源和質(zhì)量評價提供理論基礎和科學依據(jù)。