韓奕奕 楊曉君 馬穎清 張維誼 王 霞 豐東升

（上海市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心， 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心 （上海）， 上海 201708）

嗜冷菌 （psychrotrophic microorganisms） 廣泛存在于自然界中。 我國NY/T 1331—2007 《乳與乳制品中嗜冷菌、 需氧芽孢及嗜熱需氧芽孢數(shù)的測定》 中定義嗜冷菌為 “在6.5℃條件下， 需氧培養(yǎng)10 d， 在MPC 瓊脂平板上形成可計數(shù)菌落的細菌、酵母和霉菌”[1]。 國際乳品聯(lián)合會 （IDF） 將 7℃及以下依然能生長繁殖的微生物定義為低溫菌； 在20℃及以下能生長繁殖， 且10～15℃為最適生長溫度的微生物定義為嗜冷菌[2]。 生乳中嗜冷菌的來源較廣， 菌株類型較多， 其中以假單胞菌、 微球菌和產(chǎn)堿桿菌數(shù)量居多[3～4]。 假單胞菌屬主要存在于土壤、 淡水、 海水和許多植物體中； 微球菌分布較為廣泛， 以空氣、 水、 設(shè)備及動物體表居多； 產(chǎn)堿桿菌主要存在于水、 飼料及糞便中[5～6]。 在嗜冷菌的污染環(huán)節(jié)中， 接觸傳播是最主要的傳播途徑， 如擠奶工手的衛(wèi)生、 藥浴杯污染、 水清洗乳頭污染、運輸及儲存設(shè)備的不清潔及消毒不嚴(yán)格等均容易造成嗜冷菌數(shù)量快速增長[7]。

生乳從收集到加工需要存放一段時間， 為了更好地控制微生物， 防止生鮮乳變質(zhì)， 低溫成為了保存和運輸過程中必不可少的條件[8]。 低溫能夠抑制生乳中大部分微生物的活性， 但其中的嗜冷菌仍能在低溫環(huán)境中繁殖[9～10]。 嗜冷菌在生乳沒有及時冷卻、 冷卻溫度不達要求或儲存時間過長時， 就會大量繁殖， 并產(chǎn)生能分解脂肪、 蛋白質(zhì)的耐熱脂肪酶、 蛋白酶， 可導(dǎo)致原料乳在熱滅菌后產(chǎn)生沉淀、凝膠， 變苦[10]， 使乳及乳制品風(fēng)味、 品質(zhì)降低， 保質(zhì)期縮短， 造成產(chǎn)品品質(zhì)缺陷[11～12]。 隨著冷藏設(shè)備的廣泛應(yīng)用， 嗜冷菌逐漸成為影響乳制品保質(zhì)期的主要因素[13]。 因此對生乳中嗜冷菌的控制目前越來越受到乳品生產(chǎn)企業(yè)的關(guān)注和重視。

目前， 我國還未對生乳中嗜冷菌設(shè)置限量要求。 GB 19301－2010 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 生乳》中僅對菌落總數(shù)作了明確規(guī)定 （2.0×106CFU/mL以下為合格乳）[14]。 國外對生乳中微生物指標(biāo)要求更加嚴(yán)格， 歐美等國規(guī)定生鮮乳中微生物菌落數(shù)在1.0×105CFU／mL 以下， 同時嗜冷菌數(shù)控制在 1.0×103CFU/mL 以下為合格乳， 從而有效控制原料奶中某些嗜冷菌合成產(chǎn)物耐高溫酶的含量[15～16]。 在乳品企業(yè)實際生產(chǎn)中， 根據(jù)原料乳品質(zhì)等級， 嗜冷菌限量值一般保持在 1.0×103CFU/mL 以下[17]。 從 2005年起， 上海地區(qū)已將嗜冷菌作為生乳質(zhì)量安全監(jiān)控的指標(biāo)之一， 列入生乳按質(zhì)論價計價體系中[18]， 并于2020 年作為生乳按質(zhì)論價收購的檢測指標(biāo)之一，其中規(guī)定嗜冷菌數(shù)≤103CFU/mL 時， 每千克奶價增加 0.03 元； ＞103且≤104CFU/mL 不獎不罰；＞104且≤105CFU/mL 則每千克扣 0.05 元； ＞105CFU/mL則每千克扣0.10 元。

預(yù)測微生物學(xué)是食品微生物學(xué)中的一個研究領(lǐng)域， 旨在提供數(shù)學(xué)模型來預(yù)測食品環(huán)境中的微生物行為[19～20]。 張宏偉等[21]對秋季低溫儲存原料乳進行預(yù)測微生物學(xué)研究， 使用Gompertz 模型建立4～14℃儲存的秋季原料乳中總菌落和嗜冷菌的生長動力模型。 本文以上海地區(qū)生乳為研究對象， 應(yīng)用預(yù)測微生物學(xué)建立嗜冷菌在不同溫度下的生長動力學(xué)模型， 此模型能夠有效地預(yù)測出生乳在生產(chǎn)加工、儲藏和運輸過程中嗜冷菌的變化情況， 為生乳中嗜冷菌的風(fēng)險評估以及乳品安全生產(chǎn)加工和流通過程提供研究基礎(chǔ)和理論依據(jù)， 為乳品生產(chǎn)企業(yè)建立微生物風(fēng)險管理措施提供科學(xué)依據(jù)。

一、 材料與方法

（一） 樣品的采集生乳取自上海地區(qū)規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場。 所有采樣容器均為無菌容器， 樣品采集后0～4℃冷藏保存后送實驗室檢測。

（二） 材料與儀器嗜冷菌菌種： 由日常生乳樣品中分離培養(yǎng)獲得； 乳平板計數(shù)瓊脂 （MPC 瓊脂， 北京陸橋技術(shù)股份有限公司）； 2， 3， 5－三苯基氯化四氮唑 （TTC， 國藥集團化學(xué)試劑有限公司）； 滅菌處理生乳： 經(jīng)過65℃下30 min 滅菌處理的生乳； 其他試劑均為分析純。

AIRTECH超凈工作臺 （蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）； 低溫培養(yǎng)箱 IPP400 （德國 Memmert 公司），6.5℃； LPVortexMixer 漩渦混合器 （美國 Thermo 公司）； HV－110高壓滅菌鍋 （日本HIRAYAMA 公司）。

（三） 實驗方法

1. 樣品處理。 從事先準(zhǔn)備好的生乳嗜冷菌分離培養(yǎng)平板上挑取適量嗜冷菌， 通過對比麥?zhǔn)媳葷峁軡岫龋?制備濃度約為0.5 麥?zhǔn)蠞舛?（相當(dāng)于1.5×108CFU/mL） 的嗜冷菌菌液， 通過無菌水逐級稀釋， 隨后將不同濃度的嗜冷菌菌液移取到滅菌生乳中， 使其終濃度分別為 10～102、 102～103、 103～104、 104～105CFU/mL， 并用平板計數(shù)法測定其嗜冷菌數(shù) （即為初始濃度）， 以模擬不同嗜冷菌初始濃度的生乳試樣。

2. 測定方法。 遵照 NY/T 1331－2007 《乳與乳制品中嗜冷菌、 需氧芽孢及嗜熱需氧芽孢數(shù)的測定》， 對不同初始嗜冷菌濃度的生乳樣品在不同儲存溫度和時間下的嗜冷菌數(shù)量進行測定。

3. 不同溫度下生長曲線的測定。 將不同初始嗜冷菌濃度的生乳樣品分別放置于4、 6.5、 10、14、 18℃下培養(yǎng)， 每 3 h 取樣測試。 各溫度、 濃度梯度的生乳樣品， 根據(jù)其嗜冷菌污染情況， 選擇3個適宜的稀釋度， 每個稀釋度移取1 mL 樣液至無菌培養(yǎng)皿， 在6.5℃下培養(yǎng)10 d， 每個稀釋度做2個平行， 本次嗜冷菌生長曲線實驗共測試54 h。

4. 模型的建立。 預(yù)測微生物學(xué)是運用微生物學(xué)和統(tǒng)計學(xué)進行數(shù)學(xué)建模， 評估食品的安全性［22～26］。微生物生長動力學(xué)模型以數(shù)學(xué)公式的形式描繪了微生物的生長曲線， 很好地表達了微生物從生長到衰亡的過程中微生物數(shù)目 （細菌總數(shù)或當(dāng)前存活細菌總數(shù)） 與生長時間的動態(tài)變化關(guān)系。 現(xiàn)有的微生物生長模型有 Logistic 模型、 Gompertz 模型、Baranyi 模型、 Huang 模型[27]等， 各模型是通過不同的分析方式對微生物生長初始經(jīng)歷遲緩期、 對數(shù)生長期， 直至穩(wěn)定期的生長過程進行歸納總結(jié)后建立的。 Logistic 模型基本表達式見公式 （1）：

式（1）中，t為時間（h），Nmax為微生物最大生長量（CFU/mL），μmax為微生物最大生長速率 （h－1），λ為遲滯期時長 （h）， exp 為高等數(shù)學(xué)里以自然對數(shù)e 為底的指數(shù)函數(shù)。 應(yīng)用Origin 軟件繪圖， 使用Logistic 函數(shù)模型建立牛乳中嗜冷菌的初級生長動力學(xué)模型。

二、 結(jié)果與分析

（一） 嗜冷菌生長動力學(xué)模型的建立圖1～圖4 分別為不同初始嗜冷菌濃度的生乳在不同儲存溫度條件下的生長模型， 結(jié)果顯示， 不同初始嗜冷菌濃度的生長規(guī)律相同， 均是10℃的生長速率最高， 14℃和18℃的生長速率相近， 遲緩期到對數(shù)生長初期18℃的生長速率略高于14℃， 但對數(shù)生長中后期到穩(wěn)定期變?yōu)?4℃的生長速率略高于18℃， 4℃的生長速率最低， 這說明溫度控制在4℃能較好地抑制嗜冷菌的生長。 圖5～圖9 為不同溫度下， 不同初始嗜冷菌濃度的生乳中嗜冷菌的生長曲線， 結(jié)果表明， 初始嗜冷菌濃度越低， 達到穩(wěn)定期后的嗜冷菌總數(shù)也越低。

圖1 初始濃度為10～102CFU/mL 的生乳在不同儲存溫度條件下嗜冷菌生長情況

圖2 初始濃度為102～103CFU/mL 的生乳在不同儲存溫度條件下嗜冷菌生長情況

圖3 初始濃度為103～104CFU/mL 的生乳在不同儲存溫度條件下嗜冷菌生長情況

圖4 初始濃度為104～105CFU/mL 的生乳在不同儲存溫度條件下嗜冷菌生長情況

圖5 4℃下不同初始嗜冷菌濃度的生乳中嗜冷菌的生長情況

圖6 6.5℃下不同初始嗜冷菌濃度的生乳中嗜冷菌的生長情況

圖7 10℃下不同初始嗜冷菌濃度的生乳中嗜冷菌的生長情況

圖8 14℃下不同初始嗜冷菌濃度的生乳中嗜冷菌的生長情況

圖9 18℃下不同初始嗜冷菌濃度的生乳中嗜冷菌的生長情況

（二） 曲線的擬合表1 為嗜冷菌生長動力學(xué)模型方程及擬合度， 使用Logistic 模型建立的上海地區(qū)生乳中嗜冷菌生長動力學(xué)模型的R2＞0.99， 表明建立的4～18℃儲存的生乳中嗜冷菌的生長動力學(xué)模型是合適的， 該模型可有效模擬上海地區(qū)生乳中嗜冷菌的生長情況。

表1 嗜冷菌生長動力學(xué)模型方程及擬合度

三、 嗜冷菌生長動力學(xué)模型的應(yīng)用

（一） 上海地區(qū)生乳中嗜冷菌實測情況2019－2020 年度每旬對上海及周邊地區(qū)奶牛養(yǎng)殖場運送至乳品加工企業(yè)的生乳中嗜冷菌進行監(jiān)測， 共計檢測樣品3 413 批次， 測得生乳中嗜冷菌濃度范圍在320～1.5×106CFU/mL， 均值為 1.25×104CFU/mL，中位數(shù)為880 CFU/mL。

（二） 模型的應(yīng)用生乳儲存開始時細菌的濃度對其繁殖速度有重要影響， 在較低儲存溫度下生乳中嗜冷菌是主要增長的微生物[28]， 雖然嗜溫微生物生長緩慢， 但是嗜冷菌仍然相對較快地生長[29]。低溫對嗜冷菌的抑制效果取決于生乳最初被污染的程度， 生乳儲存溫度對產(chǎn)品的質(zhì)量有重要影響[30]。

運用前文建立的模型， 結(jié)合嗜冷菌中脂肪和蛋白分解酶的研究， 可對生鮮乳中嗜冷菌的限量標(biāo)準(zhǔn)進行研究。 另外也可以利用模型計算生乳的安全運輸時間， 或者是為保證收奶時達到相應(yīng)的限量要求， 可推算牧場需控制生乳中嗜冷菌的數(shù)量范圍。以生乳中嗜冷菌檢出的中位值880 CFU/mL 為例，全程4℃儲存條件下運輸樣品， 假設(shè)從奶牛養(yǎng)殖場送至生產(chǎn)加工點平均花費時間約為20 h， 通過代入4℃嗜冷菌生長動力學(xué)模型中計算得出， 奶牛養(yǎng)殖場的生乳中嗜冷菌的初始濃度應(yīng)控制在100 CFU/mL 以內(nèi)； 反之按乳品加工企業(yè)內(nèi)控指標(biāo)嗜冷菌數(shù)＜104CFU/mL 的要求， 假設(shè)奶牛養(yǎng)殖場生乳中嗜冷菌初始濃度為103CFU/mL， 生鮮乳儲運溫度控制在 0～7℃內(nèi)， 則應(yīng)用初始濃度為 103～104CFU/mL 的模型方程計算， 需保證19 h 內(nèi)到達乳品加工廠開展生產(chǎn)加工才能符合內(nèi)控要求。

四、 結(jié)論

本文研究了溫度對生乳中嗜冷菌生長動力學(xué)的影響， 模擬在不同儲存溫度下的嗜冷菌生長情況，使用Logistic 模型建立4～18℃儲存的生乳中嗜冷菌的生長動力學(xué)模型， 模型相關(guān)系數(shù)均＞0.99， 可以用來預(yù)測微生物生長情況。 以上海及周邊地區(qū)的奶牛養(yǎng)殖場的生乳為實例， 在實際生產(chǎn)中可以通過嗜冷菌的初始濃度推算出嗜冷菌的數(shù)量及運輸距離和時間。 研究所建立的模型可為奶牛養(yǎng)殖場、 乳品生產(chǎn)加工企業(yè)及相關(guān)監(jiān)管部門開展生乳中嗜冷菌監(jiān)管及限量安全風(fēng)險評估提供科學(xué)基礎(chǔ)。