錢 倩，梁 雪，魏有東

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科/重慶市神經(jīng)病學(xué)重點實驗室，重慶 400016)

帕金森病(PD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的進行性退化疾病。運動性癥狀主要表現(xiàn)為靜息性震顫、肌肉強直、運動緩慢及步態(tài)姿勢異常；非運動性癥狀主要表現(xiàn)為抑郁、精神癥狀、睡眠障礙、認知功能下降、自主神經(jīng)功能紊亂等。PD的病因和發(fā)病機制尚不明確，多數(shù)認為該病與中樞神經(jīng)系統(tǒng)多巴胺能神經(jīng)元的退行性喪失和α-突觸核蛋白異常沉積形成的路易體有關(guān)[1]，致病因素通常被認為與基因遺傳、環(huán)境影響、氧化衰老有關(guān)，然而疾病的發(fā)生和病程進展可能與神經(jīng)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、酶反應(yīng)途徑等相關(guān)。目前，PD的診斷主要依賴于典型的臨床癥狀，早期無特異性的臨床特點，常難以與其他神經(jīng)退行性疾病或運動障礙性疾病區(qū)別，診斷困難。當疾病進展到中晚期，大部分多巴胺能神經(jīng)元受損、多巴胺遞質(zhì)含量減少，治療效果欠佳甚至無效[2]，并出現(xiàn)各種并發(fā)癥，患者的生活質(zhì)量嚴重下降，對個人、家庭及社會都是沉重的負擔。因此，尋找特異性高的生化指標作為早期PD的輔助診斷是必要的。

神經(jīng)炎癥反應(yīng)在PD的發(fā)病機制中起著重要作用，這個過程的發(fā)生常伴隨PD患者多巴胺能神經(jīng)元的丟失。既往研究在PD患者或動物模型的病理尸檢中發(fā)現(xiàn)大量小膠質(zhì)細胞被激活并聚集在變性的神經(jīng)元周圍，膠質(zhì)細胞被活化時，大量的炎性因子、神經(jīng)毒素等被釋放，并通過一系列受體結(jié)合或信號通路對神經(jīng)元產(chǎn)生毒害作用[3]。Fractalkine是神經(jīng)元和小膠質(zhì)細胞通過其傳導(dǎo)調(diào)節(jié)炎癥的一種誘導(dǎo)劑[4]，是一種由神經(jīng)元分泌的、有373個氨基酸的蛋白，以膜結(jié)合和可溶性形式存在。膜結(jié)合Fractalkine可作為表達Fractalkine受體(CX3CR1)的白細胞的黏附分子[5-6]，可溶性Fractalkine具有促進小膠質(zhì)細胞極化的作用，具有抗炎和神經(jīng)保護作用，可減少神經(jīng)細胞凋亡[7]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，F(xiàn)ractalkine由神經(jīng)元表達，并通過小膠質(zhì)細胞向受體發(fā)送信號，可直接引起神經(jīng)炎癥[8]。

目前Fractalkine和神經(jīng)退行性變的相關(guān)性一直存在爭議。有研究表明，中斷Fractalkine信號對某些疾病狀態(tài)(淀粉樣病變和卒中)是有益的，而對其他神經(jīng)退行性疾病(PD、肌萎縮性側(cè)索硬化癥和Tau蛋白病)是有害的[9-11]。已有研究證明激活Fractalkine對阿爾茨海默病和PD的動物模型具有神經(jīng)保護作用[12-13]。由于Fractalkine可能通過調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥引起PD神經(jīng)退行性改變，但暫未有相關(guān)實驗證實，本研究擬通過相關(guān)實驗測定PD患者Fractalkine表達水平，評估兩者的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對象 選取2020年5—7月在重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診就診和住院的原發(fā)性PD患者40例。納入標準如下：根據(jù)歐洲神經(jīng)病學(xué)協(xié)會聯(lián)盟(EFNS)和運動障礙協(xié)會歐洲分會(MDS-ES)推薦診斷原發(fā)性PD。入組患者中男22例，女18例；病程2個月至17年，平均(3.9±4.1年)；年齡48～81歲，平均(65.5±7.9歲)。同時納入了40例年齡、性別匹配的健康對照者，男21例，女19例，這些健康對照來自于同一登記期間的健康體檢部門。入組標準為年齡50～80歲的健康人群。對所有入組者進行全面的病史詢問，系統(tǒng)的體格檢查和相關(guān)的量表評定。對所有研究對象均進行血常規(guī)檢查，排除炎性疾病。全部入組對象均為生活在重慶地區(qū)的中國漢族人，同意采血檢測，被納入研究前均提供了書面知情同意。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準，符合倫理原則。

1.1.2排除標準 (1)PD綜合征或繼發(fā)性PD；(2)患有嚴重全身性疾病(如腫瘤、慢性心力衰竭、慢性阻塞性肺疾病、肝炎、腎炎)或傳染病的患者；(3)有卒中、顱腦手術(shù)或外傷、阿爾茨海默病、運動神經(jīng)元疾病或其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病史；(4)局部或全身性感染性疾病患者(如肺部感染、尿路感染、膿毒癥、顱內(nèi)感染等)；(5)近半年有手術(shù)、外傷等應(yīng)激性因素，近3個月有服用非甾體類抗炎藥物，近2個月有酗酒，近1個月服用過中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制藥物、神經(jīng)活性物質(zhì)；(6)患有內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)疾病(如甲狀腺功能亢進和減退、糖尿病等)；(7)患有精神分裂、癲癇、抑郁等神經(jīng)精神疾病。

1.2方法 記錄所有受試者的性別、年齡、病程、工作等一般資料，早晨空腹抽取PD患者和健康對照者肘正中靜脈血液4 mL，于4 ℃環(huán)境下保存轉(zhuǎn)移，并及時使用離心機2 000 rpm離心20 min，取上清液獲得快速血清樣本，然后將其凍存于-80 ℃的溫度下。使用商用的Fractalkine酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒測量，試劑盒由武漢伊萊瑞特生物科技有限公司提供，根據(jù)制造商的說明進行檢測。

1.3疾病評估量表 采集血樣時采用統(tǒng)一PD分級量表(UPDRS)和改良的Hoehn-Yahr(H-Y)分級量表對患者進行評估。采用UPDRS總分評估PD患者的嚴重程度，評分在開期進行。采用改良的H-Y分級量表評估為1、1.5、2、2.5、3、4、5級，將PD患者分為早期(≤2.5級)和中晚期(>2.5級)。采集血樣10個月后，再次隨訪評估PD患者的UPDRS評分和H-Y分級，將UPDRS總分或H-Y分級結(jié)果升高的分為預(yù)后不佳組，UPDRS總分和H-Y分級結(jié)果降低或不變的分為預(yù)后良好組。所有量表由兩名觀察員評估，通過討論解決差異。

2 結(jié) 果

2.13組一般臨床資料比較 早期PD組、中晚期PD組和健康對照組的性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。早期PD組平均病程與中晚期PD組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。早期PD組UPDRS評分與中晚期PD組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組一般臨床資料比較

2.23組血清Fractalkine表達水平比較 早期PD組的血清Fractalkine表達水平[(0.68±0.91)ng/mL]明顯低于中晚期PD組[(6.95±9.40)ng/mL]、健康對照組[(3.45±6.00)ng/mL]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；中晚期PD組和健康對照組血清Fractalkine表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。這些結(jié)果可在散點圖中更直觀地體現(xiàn)，見圖1。

圖1 3組血清Fractalkine表達水平的散點圖

2.3血清Fractalkine表達水平與UPDRS評分、H-Y分級的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析顯示，PD患者血清Fractalkine表達水平與UPDRS評分呈正相關(guān)(r=0.331，P<0.05)；與H-Y分級無明顯線性相關(guān)性(r=0.182，P>0.05)。

2.4PD患者預(yù)后良好組和預(yù)后不佳組血清Fractalkine表達水平比較 采集血樣10個月后，再次隨訪評估PD患者的UPDRS評分和H-Y分級，共隨訪39例患者(其中1例因意外死亡退出隨訪組)，其中預(yù)后良好組26例、預(yù)后不佳組13例。兩組患者性別、年齡、病程比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。預(yù)后良好組血清Fractalkine表達水平[(2.63±4.72)ng/mL]與預(yù)后不佳組[(3.93±9.38)ng/mL]比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.579，P>0.05)。

表2 預(yù)后良好組和預(yù)后不佳組患者一般資料比較

3 討 論

Fractalkine也叫CX3C趨化因子配體1(CX3CL1)，是一種重要的趨化因子，其通過與CX3CR1結(jié)合調(diào)節(jié)黏附和趨化因子，直接或間接地在神經(jīng)膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元之間的交流中發(fā)揮中樞神經(jīng)系統(tǒng)的關(guān)鍵作用[14]。Fractalkine/CX3CR1軸通過控制炎性細胞因子的釋放和突觸可塑性來調(diào)控神經(jīng)疾病中小膠質(zhì)細胞的激活、神經(jīng)元存活和突觸功能。Fractalkine/CX3CR1軸具有多種功能，可以發(fā)揮神經(jīng)保護或神經(jīng)毒性作用，這決定了某些神經(jīng)疾病的發(fā)病機制[15]。Fractalkine/CX3CR1軸在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用仍存在爭議，仍需進一步研究來決定其是否可以作為某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療靶點。

PD的主要病理特征是黑質(zhì)致密區(qū)多巴胺能神經(jīng)元的丟失，但神經(jīng)炎癥也是PD的病理特征之一，其中就涉及Fractalkine/CX3CR1軸對中樞神經(jīng)系統(tǒng)中某些炎性細胞因子的相關(guān)調(diào)節(jié)[16]。既往研究表明Fractalkine可降低6-OHDA介導(dǎo)的PD模型大鼠的神經(jīng)毒性、小膠質(zhì)細胞激活和神經(jīng)元壞死，而Fractalkine過表達可抑制α-synuclein誘導(dǎo)的PD模型大鼠神經(jīng)退行性變[17]。由于激活CX3CR1可防止小膠質(zhì)細胞毒性，因此在相關(guān)PD動物模型實驗中，發(fā)現(xiàn)阻斷CX3CR1的小鼠組比對照組具有更廣泛的神經(jīng)細胞損失。預(yù)先給予抗CX3CR1中和抗體可抑制小膠質(zhì)細胞激活、多巴胺能神經(jīng)元丟失和行為缺陷[18]。外源性Fractalkine可以促進黑質(zhì)小膠質(zhì)細胞的激活和多巴胺能神經(jīng)元的變性[19-20]。Fractalkine/CX3CR1軸在PD的發(fā)病機制中可能具有自我保護作用，因此可能作為PD治療的潛在靶點。本實驗擬通過檢測PD患者的血清Fractalkine表達水平，評估Fractalkine和PD的相關(guān)性，進一步探討Fractalkine在PD發(fā)病機制中的作用。

本研究我們使用ELISA方法分別檢測早期、中晚期PD患者及健康對照者血清中的Fractalkine表達水平并進行對比分析，評估血清Fractalkine表達水平與UPDRS評分之間的關(guān)系，進一步了解兩者的相關(guān)性。隨訪PD患者10個月后的UPDRS評分和H-Y分級，評估血清Fractalkine表達水平與預(yù)后的相關(guān)性。

我們通過改良的H-Y分級量表將PD患者分為早期(≤2.5級)和中晚期(>2.5級)。結(jié)果表明，早期PD組的血清Fractalkine表達水平明顯低于健康對照組和中晚期PD組(P<0.05)，然而，中晚期PD組血清Fractalkine表達水平與健康對照組之間沒有顯著差異(P>0.05)。線性回歸分析用于檢測PD患者血清Fractalkine表達水平與UPDRS評分之間的關(guān)系，而UPDRS評分被廣泛用于評估PD患者的嚴重程度，PD患者血清Fractalkine表達水平與UPDRS評分呈正相關(guān)(P<0.05)，與H-Y分級無顯著線性相關(guān)(P>0.05)。表明，早期PD患者的血清Fractalkine表達水平明顯降低，但在一定范圍內(nèi)，隨著病情的惡化，PD患者血清Fractalkine表達水平呈上升趨勢。

實驗表明Fractalkine表達水平在早期PD患者的血清中降低，這可能是由于某些神經(jīng)保護機制的作用，F(xiàn)ractalkine可以通過與CX3CR1結(jié)合來下調(diào)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中炎性物質(zhì)(如白細胞介素-1β、白細胞介素-6和腫瘤壞死因子α等)的表達[21]，并減少多巴胺能神經(jīng)元的損失和促炎性細胞因子的釋放。然而實驗表明隨著病情進展至中晚期，F(xiàn)ractalkine的表達水平較疾病早期有升高趨勢，對此可能的解釋是此時大量Fractalkine已經(jīng)與CX3CR1結(jié)合，CX3CR1缺乏會導(dǎo)致神經(jīng)保護機制失去作用，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中某些物質(zhì)的毒性作用沒能受到抑制反而增強，導(dǎo)致進一步的神經(jīng)炎癥和多巴胺能神經(jīng)元丟失，F(xiàn)ractalkine因未被進一步消耗，血清表達水平較前升高并維持相對平衡狀態(tài)，因此中晚期PD組血清Fractalkine表達水平和健康對照組差異不大。

PD患者預(yù)后良好組與預(yù)后不佳組血清Fractalkine表達水平無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，表明血清Fractalkine表達水平對于PD患者的預(yù)后評估無明顯意義，這可能是由于樣本量太小及隨訪時間相對較短，需要進一步擴大樣本量和延長隨訪時間來評估兩者的相關(guān)性和意義。

本研究結(jié)果顯示，PD患者血清Fractalkine表達水平與病情嚴重程度呈正相關(guān)(P<0.05)，因此表明檢測血清Fractalkine表達水平對早期PD的輔助診斷可能有一定價值。但本研究也證實中晚期PD組和健康對照組的血清Fractalkine表達水平?jīng)]有顯著差異(P>0.05)，血清Fractalkine表達水平對該疾病預(yù)后評估無特別意義。因此，需進一步實驗研究Fractalkine/CX3CR1軸的機制，為PD的臨床診治提供一定理論支持。