張學(xué)成，關(guān)曉輝

1.吉林市中心醫(yī)院消化科，吉林 吉林 132000；2.北華大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，吉林 吉林 132000

胃癌發(fā)病率和死亡率高，是具有高度侵襲性和轉(zhuǎn)移性的惡性腫瘤之一［1］。手術(shù)治療、化療、靶向治療是目前治療胃癌的有效方法［2］。胃癌具有高轉(zhuǎn)移和侵襲的特征，因此晚期患者的治療效果不佳［3］。所以，加深對(duì)胃癌的認(rèn)識(shí)，在分子水平上探討發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)顯得尤為重要。

環(huán)狀RNA（circRNA）因其不易被核酸外切酶降解的特性而備受關(guān)注，能在體內(nèi)保持穩(wěn)定，具有作為疾病診斷標(biāo)志物的巨大潛力［4］。近年來(lái)，研究［5］發(fā)現(xiàn)circRNA可以作為癌癥的啟動(dòng)因子，例如circ-UMAD1在甲狀腺癌患者的血清中表達(dá)相對(duì)較高，具有較高的生物標(biāo)志物潛能。Circ_0003829在口腔鱗癌中表達(dá)降低，受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析circ_0003829在口腔鱗癌中具有較高的敏感性，可以作為口腔鱗癌診斷的生物標(biāo)志 物［6］。同樣，circRNA也可以作為胃癌的啟動(dòng)因子，例如circ_0005556、circ-RNF111都可以促進(jìn)胃癌的發(fā)展［7-8］。Circ_0007142作為最新發(fā)現(xiàn)的circRNA，被鑒定為結(jié)直腸癌的致癌基因，能促進(jìn)結(jié)直腸癌的進(jìn)展［9］，但在胃癌中的作用目前還沒(méi)有被揭示。

經(jīng)研究［10］發(fā)現(xiàn)，circRNA可以作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA，海綿化microRNA，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游靶基因，參與疾病的發(fā)展。在食管癌中circ_0008717通過(guò)調(diào)控miR-203/Slug來(lái)促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移［11］。microRNA是一類短鏈RNA，屬于非編碼RNA的一個(gè)亞類，經(jīng)常被視為抑癌基因并結(jié)合上游circRNA來(lái)進(jìn)行研究，Xu等［12］在關(guān)于結(jié)直腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)circRNA DSCAM-AS1通過(guò)miR-137/Notch1促進(jìn)癌癥發(fā)展，miR-137可以逆轉(zhuǎn)DSCAM-AS1對(duì)結(jié)直腸癌的促進(jìn)作用。Ma等［13］認(rèn)為血清中miR-647的降低與胃癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。但circ_0007142結(jié)合miR-647在胃癌中的作用尚未被證實(shí)，另外有研究［14］發(fā)現(xiàn)，miR-647的下游存在靶基因CC族趨化因子受體8（CC chemokine receptor 8，CCR8），抗CCR8治療可以有效地抑制小鼠結(jié)腸癌腫瘤的生長(zhǎng)。此外也有研究［15］表明胃淋巴瘤中CCR8表達(dá)上調(diào)。

根據(jù)以上發(fā)現(xiàn)，本研究探討circ_0007142吸附miR-647調(diào)控CCR8在胃癌發(fā)展過(guò)程中的生物學(xué)作用，旨在為胃癌的靶向治療提供新的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系與材料

GES-1細(xì)胞、AGS細(xì)胞、SNU-16細(xì)胞、GES-1細(xì)胞專用培養(yǎng)基、AGS細(xì)胞專用培養(yǎng)基均購(gòu)自寧波明舟生物科技有限公司。TRlzol分離試劑、高容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）試劑盒、7500 Fast RTFQ-PCR系統(tǒng)、LipofectamineTM3000試劑、PVDF膜均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。熒光原位雜交（fluorescencein situhybridization，F(xiàn)ISH）實(shí)驗(yàn)試劑盒購(gòu)自上海歌凡生物科技有限公司。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司。pmirGLO雙螢光素酶報(bào)告基因載體質(zhì)粒、HEK-293T細(xì)胞均購(gòu)自BioVector中國(guó)質(zhì)粒載體菌株細(xì)胞株基因保藏中心。RIP試劑盒購(gòu)自廣州吉賽生物科技股份有限公司。Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自上海前塵生物科技有限公司。Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司。熒光顯微鏡購(gòu)自徠卡顯微系統(tǒng)（上海）有限公司。0.1%結(jié)晶紫染色、0.5%結(jié)晶紫染色、RIPA裂解液均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 臨床組織與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

從北華大學(xué)附屬醫(yī)院獲取2018年3月—2020年4月就診的胃癌患者的癌組織與鄰近癌旁正常組織48組（距離原發(fā)灶邊緣4.0～6.5 cm），其中男性患者25例，女性患者23例，TNM分期為：Ⅰ～Ⅱ期患者28例，Ⅲ期患者20例。參與該研究的所有患者承諾之前從未接受過(guò)任何放療及化療，并簽署知情同意書。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守北華大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的要求。獲取的組織存放于液氮中進(jìn)行保存。20只SPF級(jí)BALB/c無(wú)菌裸小鼠，5周齡，質(zhì)量為（19±2）g，購(gòu)自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

本研究使用人正常胃黏膜細(xì)胞GES-1和人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、SNU-16進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，GES-1細(xì)胞使用RPMI-1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青霉素鏈霉素混合液進(jìn)行培養(yǎng)，AGS、SNU-16細(xì)胞使用F-12培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青霉素及鏈霉素混合液進(jìn)行培養(yǎng)。所有細(xì)胞在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的環(huán)境中培養(yǎng)，1 d后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。

當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)到70%左右融合度，按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染，siRNA質(zhì)粒載體、miRNA抑制劑、miRNA過(guò)表達(dá)載體均來(lái)自上海吉瑪基因有限公司，體外實(shí)驗(yàn)分組為si-NC、si-cicr_0007142、miR-647 NC、miR-647 mimic、si-cicr_0007142+inhibitor NC、si-cicr_0007142+miR-647 inhibitor、miR-647 mimic+vector、miR-647 mimic+OE-CCR8；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分組為si-NC、si-cicr_0007142。制備細(xì)胞懸液，植入96孔板中，使用LiopfectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，步驟按照試劑盒出廠說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4 RTFQ-PCR

根據(jù)試劑盒要求使用TRIzol試劑提取樣本中的總RNA，并對(duì)RNA的濃度、純度進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)高容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒的要求將總RNA合成第一鏈cDNA。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司提供（表1）。最后根據(jù)RTFQ-PCR試劑盒要求，在7500 Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)上進(jìn)行檢測(cè)。相對(duì)表達(dá)量使用2-ΔΔCt計(jì)算，U6將miRNA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，GAPDH將circRNA和CCR8標(biāo)準(zhǔn)化。

表1 RTFQ-PCR引物序列Tab.1 RTFQ-PCR primer sequences

1.5 FISH實(shí)驗(yàn)

樣本在4%多聚甲醛室溫下固定30 min，DEPC水洗并干燥，30%H2O2+純甲醇對(duì)樣本進(jìn)行處理，再滴加0.25%的HCl溶液，15 min后用DEPC水洗。樣本加入蛋白酶K反應(yīng)20 min，用0.1 mol/L甘氨酸洗液終止反應(yīng)。PBS水洗后用4%PFA多聚甲醛進(jìn)行再固定，5×SSC水洗后加入預(yù)雜交液65 ℃反應(yīng)1 h。加入500 ng/mL digoxigenin-labeled probe探針，暗室中65 ℃溫育48 h，用封閉液溫育30 min，加入生物素化鼠抗地高辛抗體，37 ℃溫育1 h，加入FITC 標(biāo)記抗體，暗室下37 ℃溫育 30 min，DAPI染核，封片，熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

構(gòu)建circ_0007142與CCR8基因的野生型片段，命名為circ_0007142-WT、CCR8-WT，將野生型基因片段使用內(nèi)切酶位點(diǎn)SpeⅠ和Hind Ⅲ擴(kuò)增插入到pmirGLO雙螢光素酶報(bào)告基因載體上。在circ_0007142-WT、CCR8-WT的野生型片段上設(shè)計(jì)種子序列的互補(bǔ)序列突變位點(diǎn)，命名為circ_0007142-MUT、CCR8-MUT，利用限制性內(nèi)切酶與T4 DNA連接酶將突變型基因片段擴(kuò)增插入到pmirGLO載體上。將這些報(bào)告質(zhì)粒與miR-647 NC或miR-647 mimic使用LipofectamineTM3000試劑共轉(zhuǎn)染到HEK-293T細(xì)胞中，48 h后收集細(xì)胞并進(jìn)行充分裂解，離心后取上清液加入熒光素酶反應(yīng)試劑，再加入細(xì)胞裂解液，最后測(cè)量螢火蟲熒光素酶活性，并以腎素?zé)晒馑孛富钚詾闃?biāo)準(zhǔn)化參考。以上詳細(xì)步驟均按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.7 RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RNA-binding protein immunoprecipitation，RIP）實(shí)驗(yàn)

應(yīng)用RIP試劑盒驗(yàn)證circ_0007142與miR-647、CCR8與miR-647的靶向關(guān)系。將細(xì)胞使用PBS水洗以后，裂解，收集裂解液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，最后使用RTFQ-PCR檢測(cè)circ_0007142、miR-647、CCR8的豐度。詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟按照RIP試劑盒出廠說(shuō)明書進(jìn)行嚴(yán)格操作。

1.8 Transwell實(shí)驗(yàn)

將冷凍的Matrigel基質(zhì)膠融化，加入無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，稀釋液添加到transwell小室的上室，以5×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度植入到上室的 24孔板中，并添加無(wú)血清培養(yǎng)基，下室則添加含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基，37 ℃下溫育24 h，多聚甲醛固定細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下觀察細(xì)胞侵襲數(shù)量。

1.9 克隆形成實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞植入6孔板，每孔5×103個(gè)細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，每3 d更換新培養(yǎng)基。培養(yǎng)結(jié)束后經(jīng)PBS洗滌、乙醇固定后，使用0.5%結(jié)晶紫進(jìn)行染色。最后在顯微鏡下觀察細(xì)胞集落形成數(shù)量。

1.10 Western blot檢測(cè)

RIPA裂解液將細(xì)胞分離提取蛋白，加入PMSF調(diào)整濃度，使用BCA定量試劑盒按照說(shuō)明書要求檢測(cè)蛋白濃度；蛋白在10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，然后將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，再加入5%脫脂牛奶進(jìn)行封閉。加入一抗vimentin（1∶2 000）、E-cadherin（1∶500）、N-cadherin（1∶500）、GAPDH（1∶1 000）與膜4 ℃過(guò)夜溫育，使用TBST進(jìn)行沖洗，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗IgG（1∶ 1 000），室溫下溫育1 h。加入ECL使蛋白信號(hào)可視化，在Image J軟件上進(jìn)行分析。

1.11 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)

石蠟切片并脫蠟至水，加入3%H2O2溫育以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。蒸餾水和PBS沖洗，微波抗原修復(fù)，血清封閉后加入一抗CCR8，4 ℃溫育過(guò)夜，PBS沖洗后加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫溫育30 min后PBS沖洗，DAB顯色，自來(lái)水沖洗、脫水、透明并封片，顯微鏡下拍照。借助Image J軟件對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析，計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)率。

1.12 裸小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)

BALB/c裸小鼠被安置在無(wú)菌環(huán)境中飼養(yǎng)。對(duì)癌細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染si-NC、si-circ_0007142，之后再將細(xì)胞注射到裸小鼠右側(cè)皮下，每隔4 d測(cè)量1次皮下腫瘤體積。35 d以后，注射異氟醚麻醉裸小鼠，斷頸處死，取出腫瘤后拍照、測(cè)量體積并稱重。

“不要再說(shuō)啦，她的虧，我這一生吃夠了，再不要在我面前提她！”說(shuō)罷，蔣浩德起身要走，身體搖晃了兩下，紫云一把抱住他。他回過(guò)神來(lái)，眼睛直直地望著紫云，感受到來(lái)自女人的體溫，差點(diǎn)窒息。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件完成統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，體外實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次，所得結(jié)果用表示；兩組間符合正態(tài)分布則采用t檢驗(yàn)，多組間采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Circ_0007142在胃癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)

通過(guò)RTFQ-PCR檢測(cè)circ_0007142在胃癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，胃癌組織中circ_0007142顯著高表達(dá)（P＜0.05，圖1A）。與GES-1細(xì)胞相比，胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、SNU-16中circ_0007142的表達(dá)都顯著升高（P均＜0.05，圖1B），其中AGS細(xì)胞的表達(dá)（3.47±0.29）比SNU-16（2.98±0.21）高，因此本研究選擇AGS細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)。ROC曲線分析顯示，circ_0007142可作為胃癌診斷的一個(gè)重要指標(biāo)（AUC=0.859 8，P<0.000 1，圖1C）。通過(guò)分析circ_0007142的表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性可見(jiàn)，circ_0007142高表達(dá)與TNM分期和腫瘤浸潤(rùn)深度相關(guān)（P均<0.05，表2）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，circ_0007142高表達(dá)可能與胃癌發(fā)展相關(guān)。

表2 Circ_0007142的表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征關(guān)系Tab.2 Relationship between expression of circ_0007142 and clinicopathological features in patients with gastric cancer

圖1 RTFQ-PCR檢測(cè)circ_0007142的表達(dá)Fig.1 RTFQ-PCR was adopted to detect the expression of circ_0007142

2.2 敲減circ_0007142抑制胃癌細(xì)胞的克隆形成、侵襲和EMT

通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)、transwell、Western blot檢測(cè)探討circ_0007142表達(dá)水平對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。結(jié)果表明，與si-NC組相比，si-circ_0007142組細(xì)胞的集落形成與侵襲均被抑制（P均<0.05，圖2A、B）。與si-NC組相比，si-circ_0007142組細(xì)胞中vimentin與N-cadherin的蛋白水平均下調(diào)，而E-cadherin的蛋白水平上調(diào)（均P<0.05，圖2C）。以上實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，敲減circ_0007142的表達(dá)能夠抑制胃癌細(xì)胞的集落形成能力與侵襲，并且抑制EMT的形成，進(jìn)而參與胃癌的進(jìn)展。

圖2 敲減circ_0007142的表達(dá)能夠抑制胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為Fig.2 Knockdown of circ_0007142 expression inhibits the malignant biological behavior of gastric cancer cells

2.3 在胃癌細(xì)胞中，circ_0007142可以吸附miR-647

FISH實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，circ_0007142在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均有表達(dá)，但主要定位于細(xì)胞質(zhì)（圖3A）。Circular RNA Interactome（https://circinteractome.nia.nih.gov/index.html）網(wǎng)站中發(fā)現(xiàn)miR-647與circ_0007142存在結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)設(shè)計(jì)了circ_0007142的突變位點(diǎn)（圖3B），之后通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因和RIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了miR-647和circ_0007142之間的靶向作用關(guān)系，結(jié)果顯示，與circ_0007142-WT+miR-647 NC組相比，circ_0007142-WT+miR-647 mimic組細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低（P<0.05），而circ_0007142-MUT+miR-647 NC組與circ_0007142-MUT+miR-647 mimic組的熒光素酶活性無(wú)顯著變化（P>0.05）。RIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與miR-647 NC組相比，circ_0007142在miR-647 mimic組的Ago2抗體上富集更多，circ_0007142與miR-647的靶向關(guān)系得到證實(shí)（圖3C、D）。通過(guò)RTFQ-PCR發(fā)現(xiàn)miR-647在胃癌組織中表達(dá)較正常組織降低（P＜0.05，圖3E），此外，miR-647在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)較正常細(xì)胞同樣降低（P＜0.05，圖3F），胃癌組織中miR-647的表達(dá)與circ_0007142呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.7514，P＜0.000 1，圖3G），且敲減circ_0007142能夠誘導(dǎo)miR-647的表達(dá)（P＜0.05，圖3H）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明circ_0007142可以作為分子海綿吸附miR-647而發(fā)揮作用。

圖3 Circ_0007142可以作為分子海綿吸附miR-647Fig.3 Circ_0007142 absorbs the expression of miR-647 as a molecular sponge

2.4 miR-647抑制劑可以部分挽救沉默circ_0007142對(duì)胃癌細(xì)胞的作用

對(duì)circ_0007142通過(guò)miR-647調(diào)控胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為進(jìn)行研究，結(jié)果表明si-circ_0007142轉(zhuǎn)染對(duì)胃癌細(xì)胞的克隆形成、侵襲和EMT有抑制作用，但該作用被miR-647 inhibitor部分挽救（P均＜0.05，圖4A～C）。

圖4 各組細(xì)胞克隆形成、侵襲和EMT相關(guān)因子表達(dá)Fig.4 Clone formation,invasion and expressions of EMT related factors in each group of cells

2.5 CCR8是miR-647的下游靶點(diǎn)且在胃癌組織和細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)

在TargetScan（http://www.targetscan.org/vert_71/）數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)CCR8與miR-647存在結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)設(shè)計(jì)CCR8的突變位點(diǎn)（圖5A）。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，與CCR8-WT+miR-647 NC組相比，CCR8-WT+miR-647 mimic組細(xì)胞的熒光素酶活性下調(diào)（P<0.05），CCR8-MUT+miR-647 NC組與CCR8-MUT+miR-647 mimic組的熒光素酶活性差異無(wú)顯著變化（P＞0.05）。RIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與miR-647 NC組相比，CCR8在miR-647 mimic的Ago2抗體上富集更多（P<0.05）。CCR8與miR-647的互作用關(guān)系被證實(shí)（圖5B、C）。結(jié)合GEPIA（http://gepia）數(shù)據(jù)庫(kù)與UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)CCR8在胃癌組織中高表達(dá)（圖5D、E）。RTFQ-PCR和免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示與網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果一致，CCR8在胃癌組織中的表達(dá)高于正常組織（P＜0.05，圖5F、G），在胃癌細(xì)胞中也得到同樣的結(jié)果（P均＜0.05，圖5H），相關(guān)性分析顯示，CCR8的mRNA表達(dá)與miR-647表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.000 1，圖5I）。RTFQ-PCR檢測(cè)干預(yù)miR-647的表達(dá)對(duì)CCR8的影響，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-647能夠顯著抑制CCR8的表達(dá)（P<0.05，圖5J）。相對(duì)于inhibitor NC組，敲減miR-647的表達(dá)能夠誘導(dǎo)CCR8表達(dá)增強(qiáng)，但該作用被 si_circ_0007142部分挽救（P均<0.05，圖5K）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，CCR8是miR-647的下游靶點(diǎn)，circ_0007142能夠作為分子海綿吸附miR-647進(jìn)而調(diào)控CCR8的表達(dá)。

圖5 CCR8是miR-647的下游靶基因且其表達(dá)受circ_0007142的調(diào)控Fig.5 CCR8 was a downstream target gene of miR-647 and its expression was regulated by circ_0007142

2.6 過(guò)表達(dá)CCR8可以部分挽救上調(diào)miR-647對(duì)胃癌細(xì)胞的作用

通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)、transwell、Western blot實(shí)驗(yàn)分析CCR8是否能影響miR-647調(diào)控的胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-647 mimic能夠抑制胃癌細(xì)胞的克隆形成、侵襲和EMT，但該作用被OE-CCR8部分挽救（P均＜0.05，圖6）。

圖6 各組細(xì)胞克隆形成、侵襲和EMT相關(guān)因子表達(dá)Fig.6 Clone formation,invasion and expressions of EMT related factors in each group of cells

2.7 敲減circ_0007142可以抑制裸小鼠體內(nèi)成瘤能力

本研究通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證circ_0007142對(duì)胃癌的作用。在小鼠體內(nèi)注射轉(zhuǎn)染了si-NC、si-circ_0007142的癌細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)si-circ_0007142組腫瘤的體積和重量均比si-NC組低（P＜0.05，圖7A～C）。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明，敲減circ_0007142可以抑制裸小鼠體內(nèi)成瘤能力。本研究機(jī)制圖見(jiàn)圖7D。

圖7 敲減circ_0007142可以抑制裸小鼠體內(nèi)成瘤能力Fig.7 Knockdown of circ_0007142 inhibits tumorigenesis in nude mice

3 討 論

胃癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等都參與其中，在高通量測(cè)序技術(shù)與生物信息學(xué)分析高速發(fā)展的今天，對(duì)circRNA在疾病中作用的研究已經(jīng)成為一大熱點(diǎn)。EMT伴隨上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)被抑制、間充質(zhì)表型標(biāo)志物vimentin與N-cadherin表達(dá)被促進(jìn)，這個(gè)過(guò)程使細(xì)胞具有轉(zhuǎn)移和侵襲的能力，對(duì)于癌癥原發(fā)灶轉(zhuǎn)移有重要的意義［16］。

CircRNA在胃癌中關(guān)于EMT和侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制已有研究，Jin等［17］經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，沉默circ_0101145的表達(dá)通過(guò)調(diào)節(jié)miR-548c-3p/LAMC2軸抑制肝癌EMT。Circ_0007142作為本次的研究對(duì)象，曾被發(fā)現(xiàn)在肺腺癌和結(jié)直腸癌中均可促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［18-19］。本研究發(fā)現(xiàn)，circ_0007142在胃癌組織中呈高表達(dá)，并且功能實(shí)驗(yàn)顯示，沉默circ_0007142可以抑制癌細(xì)胞的集落形成、侵襲和EMT，并且在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中沉默circ_0007142能抑制腫瘤的生長(zhǎng)與EMT。通過(guò)之前研究得知，circRNA可以與miRNA競(jìng)爭(zhēng)式結(jié)合，下調(diào)miRNA的表達(dá)。借助生物學(xué)信息網(wǎng)站尋找circ_0007142的下游靶點(diǎn)，進(jìn)一步選中miR-647，并使用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證二者的靶向關(guān)系。miR-647之前被報(bào)道在胃癌耐藥細(xì)胞中低表達(dá)，miR-647過(guò)表達(dá)可以降低胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力［20］。Cao 等［21］通過(guò)研究認(rèn)為miR-647在體內(nèi)和體外均對(duì)胃癌的發(fā)展有抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-647在胃癌組織中低表達(dá)，并與circ_0007142的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，沉默circ_0007142對(duì)胃癌細(xì)胞的作用也可以被miR-647抑制劑部分逆轉(zhuǎn)。

分析miR-647的下游靶基因發(fā)現(xiàn)，CCR8與miR-647之間具有相互作用。趨化因子是一類信號(hào)蛋白，可以誘導(dǎo)細(xì)胞定向趨化，參與血細(xì)胞發(fā)育、血管形成、細(xì)胞凋亡等過(guò)程，在腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移、炎癥感染等過(guò)程中都發(fā)揮著重要作用［22］。在對(duì)浸潤(rùn)性膀胱癌的研究中發(fā)現(xiàn)，CCR8水平高與免疫耐受相關(guān)，高水平的CCR8預(yù)示著預(yù)后差，化療效果差［23］。Li等［24］通過(guò)研究得出結(jié)論，CCR8可以作為預(yù)測(cè)胃腸道間質(zhì)瘤的生物標(biāo)志物，其高表達(dá)與惡性程度、不良預(yù)后相關(guān)。基于此，本研究在生物學(xué)網(wǎng)站中檢索到CCR8在胃癌組織中高表達(dá)，借助實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)CCR8在胃癌組織中高表達(dá)。并且發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織中，CCR8與miR-647的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，過(guò)表達(dá)CCR8可以部分抵制上調(diào)miR-647帶來(lái)的影響。

基于以上分析，本次研究證明circ_0007142可能會(huì)通過(guò)miR-647/CCR8軸參與胃癌的發(fā)展，為胃癌的預(yù)防與治療探索到新的有潛力的診斷標(biāo)志物。