方艷惠，馬彩娟，張純麗，翟嘉威，朱巧英，劉 茵，趙喜娃

1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院東院區(qū)婦科，河北 石家莊 050011；2.晉州同濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 石家莊 052260

子宮頸癌［1-2］是女性常見的腫瘤之一，高危型人乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染是其主要致病因素［3］，盡管有強(qiáng)大的致癌潛力，但研究發(fā)現(xiàn)HPV感染本身并不足以引起腫瘤惡性變化［4］。隨著研究的深入，已證實(shí)包括miRNA在內(nèi)的其他因子也與子宮頸癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［5］，因此探究子宮頸癌的具體分子機(jī)制至關(guān)重要。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類內(nèi)源的非編碼RNA。miRNA的失調(diào)與多種人類癌癥有關(guān)，在子宮頸癌中，多種miRNA處于失調(diào)狀態(tài)，并參與調(diào)控子宮頸癌發(fā)病機(jī)制。Wang等［6］研究發(fā)現(xiàn)，miR-449a在子宮頸癌組織和細(xì)胞中表達(dá)降低并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化、預(yù)后不良密切相關(guān)。一項(xiàng)研究［7］發(fā)現(xiàn)，miR-10b在子宮頸癌組織中表達(dá)降低，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，隨著子宮頸癌進(jìn)展其表達(dá)下降明顯，同時(shí)miR-10b低水平與具有侵襲性的腫瘤表型顯著相關(guān)。目前，越來越多的證據(jù)表明miRNAs表達(dá)異常與子宮頸癌病理進(jìn)程相關(guān)。MiR-496已被發(fā)現(xiàn)在諸多人類癌癥中起促/抑癌基因的作用，進(jìn)而參與癌癥發(fā)展過程［8-9］，但在子宮頸癌中的作用機(jī)制鮮見報(bào)道。本研究旨在觀察體外轉(zhuǎn)染miR-496對(duì)子宮頸癌細(xì)胞的影響，并通過分析其與SFMBT1的（通過TargetScan預(yù)測(cè)為miR-496潛在靶基因）相互關(guān)系，揭示miR-496在子宮頸癌中的作用及其機(jī)制。

1 資料和方法

1.1 研究樣本采集

子宮頸癌的癌組織標(biāo)本和癌旁組織標(biāo)本來自河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院接受手術(shù)的81例子宮頸癌患者。本研究所涉及標(biāo)本患者均簽署知情同意書，并獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

HeLa細(xì)胞使用含10%胎牛血清，l00 U/mL青霉素和100 g/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中CO2體積分?jǐn)?shù)為5%，溫度為37 ℃。轉(zhuǎn)染前24 h將細(xì)胞接種于6孔板，將子宮頸癌細(xì)胞系分為對(duì)照組、SFMBT1處理組、miR-496 mimics處理組和miR-496+SFMBT1處理組，隨后按照轉(zhuǎn)染試劑說明書對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

通過miRNA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)miR-496在SFMBT1的3’-UTR上的潛在結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建了野生型SFMBT13’-UTR（SFMBT1-wt）質(zhì)粒和突變型SFMBT13’-UTR（SFMBT1-mut）質(zhì)粒，隨后，將SFMBT1-wt或者SFMBT1-mut和miR-496 mimic或NC模擬物共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞48 h，隨后測(cè)量細(xì)胞中的熒光素酶活性。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）

使用TRIzol從細(xì)胞系或組織中提取總RNA，miR-496的表達(dá)水平以U6為內(nèi)參，GAPDH為SFMBT1表達(dá)內(nèi)參，按照RTFQ-PCR試劑盒說明書進(jìn)行PCR，每個(gè)樣本重復(fù)3次。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)

提取子宮頸癌或癌旁組織、細(xì)胞蛋白，測(cè)定蛋白濃度，與12%SDS-PAGE分離蛋白后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉37 ℃封閉。加入SFMBT1一抗，溫育。洗膜后加入二抗。ECL液暗室發(fā)光顯影，定影。

1.6 H-E染色

將石蠟切片放入染缸內(nèi)，進(jìn)行脫蠟。先用蘇木精染液浸泡10 min，洗去浮色；用伊紅染液浸泡2 min，然后用蒸餾水速洗30 s。用70%的乙醇浸泡30 s；然后再用80%乙醇、95%乙醇（Ⅰ）及 95%乙醇（Ⅱ）各浸泡1 min；最后用無水乙醇（Ⅰ）和無水乙醇（Ⅱ）各浸泡2 min。切片放入二甲苯（Ⅰ）與二甲苯（Ⅱ）中各浸泡3 min。將透明后的切片從染色缸中取出，切片一面朝上，平放在鋪有吸水紙的桌面上，用吸水紙吸盡切片周圍的透明液，然后用小玻璃棒蘸取一滴中性快干膠滴于材料上，用鑷子取一片蓋玻片，讓蓋玻片一側(cè)接觸快干膠后再慢慢平放在快干膠上，完成封固。將封好的切片平放于溫箱中，待干燥后，即可在顯微鏡下觀察。

1.7 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

將組織切片脫蠟入水，微波加熱法修復(fù)抗原，溫度94 ℃左右，10～15 min，自然冷卻至室溫。加入5%的正常羊血清封閉，37 ℃溫育60 min。棄去血清，滴加1∶500比例稀釋的SFMBT1抗體，4 ℃過夜。棄一抗，PBS沖洗 3次，滴加熒光素標(biāo)記的二抗，37 ℃避光溫育 60 min。棄二抗，PBS沖洗3次，防淬滅封片劑封片，4 ℃避光保存。熒光顯微鏡觀察拍照。

1.8 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）實(shí)驗(yàn)

96孔板每孔鋪HeLa細(xì)胞，每孔200 μL細(xì)胞懸液。細(xì)胞在轉(zhuǎn)染72 h后，按照CCK-8試劑盒操作說明書于每孔加入10 μL CCK-8溶液，于37 ℃培養(yǎng)箱中溫育1 h，450 nm波長下進(jìn)行吸光度（D）檢測(cè)。

1.9 Transwell實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染后，收集每組細(xì)胞，Matrigel基質(zhì)膠于 4 ℃條件下過夜，次日Matrigel基質(zhì)膠對(duì)transwell 小室進(jìn)行預(yù)包被，將細(xì)胞密度調(diào)為1×106個(gè)/mL，然后將200 μL細(xì)胞懸液接種于上室，在下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，隨后恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取出小室后，將小室置于95%乙醇中固定5 min；在0.5%結(jié)晶紫染色液中染色10 min后，用PBS漂洗去除未結(jié)合細(xì)胞的染色液。用棉簽輕拭去小室濾膜上層的細(xì)胞，在顯微鏡下觀察濾膜下層細(xì)胞。

1.10 構(gòu)建子宮頸癌裸小鼠移植瘤模型

本研究中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)批準(zhǔn)，選取BALB/c裸小鼠12只，6～8周，體重19～23 g。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞消化后，1 200 r/min離心3 min，定量的PBS緩沖液及培養(yǎng)基將細(xì)胞吹打濃度至5×106個(gè)/mL，接種前，細(xì)胞置于冰上保存。所有裸小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（6只）和miR-496組（6只）。將以PBS緩沖液混懸的細(xì)胞和以完全培養(yǎng)基混懸的細(xì)胞分別接種在裸小鼠的左后肢腋下及右后肢腋下，以每個(gè)接種部位0.2 mL皮下注射。每3 d用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長徑（b）、短徑（a），計(jì)算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線，腫瘤體積計(jì)算公式：V=a2×b×0.5。21 d后，頸椎脫臼處死小鼠，剪開腫瘤生長處的皮膚，取出腫瘤并稱重。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以表示，兩組數(shù)據(jù)間的比較采用t檢驗(yàn)，3組及以上的比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮頸癌組織中SFMBT1的表達(dá)

免疫熒光結(jié)果顯示SFMBT1蛋白在子宮頸癌組織中的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖1A）。采用RTFQ-PCR、Western blot檢測(cè)SFMBT1在子宮頸癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，相比癌旁組織，子宮頸癌組織中SFMBT1的mRNA表達(dá)水平（1.69±0.23vs1.00±0.12）以及蛋白水平（1.73±0.28vs1.00±0.15）均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖1）。

圖1 子宮頸癌組織中SFMBT1的表達(dá)變化Fig.1 The expression of SFMBT1 in cervical cancer tissues

2.2 TargetScan篩選miR-496的靶基因及調(diào)控

采用TargetScan篩選miR-496的潛在靶基因，結(jié)果顯示，SFMBT1的3’-UTR上具有潛在的結(jié)合位點(diǎn)與miR-496形成互補(bǔ)結(jié)合（圖2A）。通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)，pMIR-SFMBT1-wt+miR-NC組、pMIR-SFMBT1-wt+miR-496組HeLa細(xì)胞熒光素酶活性分別為17.68±1.81、13.34±1.51，P<0.01）；pMIR-SFMBT1-mut+miR-NC組、pMIR-SFMBT1-mut+miR-496組HeLa細(xì)胞熒光素酶活性分別為19.16±2.04、17.78±1.84，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.43，圖2B）；提示miR-496 mimics可抑制pMIRSFMBT1-wt熒光素酶活性，而對(duì)pMIR-SFMBT1-mut熒光素酶活性無影響。

圖2 SFMBT1是miR-496潛在靶基因Fig.2 SFMBT1 is a potential target gene of miR-496

將miR-496 mimics轉(zhuǎn)染進(jìn)HeLa細(xì)胞后，RTFQPCR結(jié)果顯示HeLa細(xì)胞中miR-496的表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高（7.15±0.78vs1.00±0.14，P＜0.01，圖3A），提示 miR-496 mimics轉(zhuǎn)染成功，然后采用RTFQ-PCR和Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染成功后SFMBT1表達(dá)的變化，結(jié)果顯示，相比對(duì)照組，miR-496過表達(dá)的細(xì)胞中SFMBT1的mRNA表達(dá)和蛋白水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.81±0.07vs1.00±0.15，0.26±0.02vs1.00±0.14，P＜0.01，圖3B、C）。

圖3 miR-496負(fù)調(diào)控SFMBT1表達(dá)Fig.3 miR-496 negatively regulated the expression of SFMBT1

2.3 miR-496和SFMBT1對(duì)HeLa細(xì)胞生物行為的調(diào)控

用CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果顯示，相比對(duì)照組，SFMBT1處理組增殖能力提高（2.78±0.13vs2.01±0.09）而miR-496處理組中D值明顯降低（1.39±0.10vs2.01±0.09），進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miR-496+SFMBT1處理組的D值明顯高于miR-496 mimics處理組（2.35±0.19vs1.39±0.10）。采用transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的遷移和侵襲能力，結(jié)果顯示，相比對(duì)照組，miR-496 mimics處理組中遷移（40.50±3.17vs28.42±1.21）和侵襲（15.03±1.67vs25.71±2.56）細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯降低，而SFMBT1處理組相對(duì)升高（39.64±1.78vs28.42±1.21和37.45±2.89vs25.71±2.56），進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miR-496+SFMBT1處理組遷移（33.21±2.66vs19.28±1.50）和侵襲（30.11±2.73vs15.03±1.67）細(xì)胞計(jì)數(shù)較miR-496處理組明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖4）。

圖4 miR-496和SFMBT1對(duì)HeLa細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控Fig.4 Regulation of biological behavior of HeLa cells by miR-496 and SFMBT1

2.4 miR-496在子宮頸癌裸小鼠移植瘤模型中的作用

選取BALB/c裸小鼠12只，隨機(jī)分為對(duì)照組（6只）和miR-496組（6只），HeLa細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-NC或miR-496 mimics并皮下注射到裸小鼠的右后肢腋部，每只裸小鼠接種細(xì)胞數(shù)為2×106個(gè)，構(gòu)建子宮頸癌裸小鼠移植瘤模型。21 d后顯示，miR-496組裸小鼠中不同時(shí)間點(diǎn)的移植瘤體積明顯低于對(duì)照組（圖5A），同時(shí)miR-496組腫瘤重量明顯降低（0.44±0.08vs0.25±0.04，P<0.01，圖5B）。采用H-E染色和免疫熒光檢測(cè)各組裸小鼠腫瘤組織中病變程度、SFMBT1表達(dá)和Ki-67增殖指數(shù)，結(jié)果顯示，miR-496組裸小鼠中病變程度、SFMBT1表達(dá)和Ki-67增殖指數(shù)均明顯低于對(duì)照組（圖5C），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。表明miR-496在子宮頸癌裸小鼠移植瘤模型中能抑制子宮頸癌病變及細(xì)胞增殖。

圖5 miR-496在子宮頸癌裸小鼠移植瘤模型中的作用Fig.5 The role of miR-496 in cervical cancer xenograft model of nude mice

3 討 論

SFMBT1是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，研究［10-11］發(fā)現(xiàn)，其與癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及細(xì)胞增殖侵襲等相關(guān)。Liu等［12］的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，SFMBT1敲除可抑制透明細(xì)胞性腎細(xì)胞癌的增殖，抑制原位腫瘤的生長；在子宮頸癌中，SFMBT1的過表達(dá)誘導(dǎo)子宮頸癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)子宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力［13］；與以往研究結(jié)果類似，本研究通過免疫熒光等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SFMBT1在子宮頸癌組織中的表達(dá)相比對(duì)照組明顯升高，SFMBT1可能作為癌基因參與子宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究通過生信分析，證實(shí)SFMBT1可能是miR-496潛在靶基因，并驗(yàn)證了這一結(jié)論，發(fā)現(xiàn)SFMBT1可能受miR-496調(diào)控影響。為了進(jìn)一步驗(yàn)證兩者對(duì)子宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的影響，本研究從細(xì)胞和動(dòng)物水平觀察了miR-496及其靶基因SFMBT1對(duì)子宮頸癌細(xì)胞和體內(nèi)腫瘤生長的影響。

miR-496已被證實(shí)與多種癌癥發(fā)病機(jī)制相關(guān)。在非小細(xì)胞肺癌中，miR-496通過靶向腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子介導(dǎo)的PI3K/Akt信號(hào)通路抑制腫瘤發(fā)生［14］；在結(jié)腸癌中，miR-496/RASSF軸參與Wnt通路介導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移［9］，但miR-496在子宮頸癌中的作用尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-496過表達(dá)的裸小鼠中移植瘤體積和重量明顯低于對(duì)照組，表明miR-496可抑制裸小鼠瘤體的生長，提示miR-496可能具有抑制子宮頸癌的功能。

miRNA主要通過調(diào)控靶基因進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)功能［15］，因此，探究miRNA功能的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是確定其靶基因。在本研究中利用TargetScan發(fā)現(xiàn)miR-496在SFMBT1的3’-UTR上具有潛在的結(jié)合位點(diǎn)，表明SFMBT1是其潛在靶基因。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一預(yù)測(cè)，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的結(jié)果證實(shí)miR-496 mimics能抑制SFMBT1野生型3’-UTR報(bào)告基因質(zhì)粒的熒光素酶活性，但對(duì)其突變型報(bào)告基因質(zhì)粒的熒光素酶活性無明顯影響。同時(shí)，在HeLa細(xì)胞中過表達(dá)miR-496能下調(diào)SFMBT1的mRNA和蛋白的表達(dá)，表明miR-496的確能與SFMBT1的3’-UTR特異性結(jié)合并抑制其 表達(dá)。

我們進(jìn)一步通過體外實(shí)驗(yàn)分析miR-496與SFMBT1對(duì)子宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-496 mimics能抑制HeLa細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，但在細(xì)胞中同時(shí)高表達(dá)SFMBT1則能逆轉(zhuǎn)miR-496的這種抑制效果。表明miR-496是通過靶向調(diào)控SFMBT1從而抑制子宮頸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。在子宮頸癌裸小鼠移植瘤模型中，miR-496過表達(dá)也能下調(diào)SFMBT1的表達(dá)水平，并抑制細(xì)胞的增殖及腫瘤生長，進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-496在子宮頸癌中的抗腫瘤功能。

綜上所述，本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-496的低表達(dá)與子宮頸癌密切相關(guān)，miR-496可抑制子宮頸癌HeLa細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，并且能通過靶向SFMBT1抑制子宮頸癌發(fā)生、發(fā)展，抑制子宮頸癌裸小鼠移植瘤的生長。