李 剛 劉亞?wèn)| 徐 昕 張 鵬 熊 敏 田大為

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬國(guó)藥東風(fēng)總醫(yī)院1 運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)科，2 手外足踝顯微外科，3 骨關(guān)節(jié)外,4 脊柱外科，十堰市 442008，電子郵箱：liy9592@163.com)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是最常見的風(fēng)濕免疫性疾病，好發(fā)于50歲左右的女性[1]。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎屬于自身免疫系統(tǒng)疾病，患者的骨關(guān)節(jié)組織以及滑膜組織受到破壞，最終可喪失勞動(dòng)能力[2]。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制是免疫細(xì)胞浸潤(rùn)后促進(jìn)白細(xì)胞聚集并分泌炎性介質(zhì)，最后導(dǎo)致血管翳形成、滑膜增生以及骨關(guān)節(jié)受損。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是多因素導(dǎo)致的疾病，其中遺傳因素、環(huán)境因素(寒冷、潮濕)以及長(zhǎng)期抽煙是其主要的發(fā)病因素，早期不積極治療會(huì)使疾病加重，并增加并發(fā)癥發(fā)病率[3]。

成骨細(xì)胞由內(nèi)外骨膜與骨髓基質(zhì)中的間充質(zhì)始祖細(xì)胞分化而來(lái)，能夠特異性分泌多種生物活性物質(zhì)，對(duì)骨的形成和重建產(chǎn)生影響[4]。目前認(rèn)為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與多種細(xì)胞因子的異常表達(dá)相關(guān)，包括微小RNA(microRNA,miRNA)家族。miRNA-34a屬于miRNA家族成員之一，有研究顯示，其在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜組織或滑膜細(xì)胞中表達(dá)明顯升高[4]。本研究探討沉默miRNA-34a對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠癥狀改善和血清炎癥因子水平的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：無(wú)特定病原體級(jí)SD健康大鼠60只，購(gòu)自深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司[動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(粵)2020-0220]，鼠齡3～7(5.0±1.6)個(gè)月，體質(zhì)量200～240(220.0±16.0)g，所有大鼠均在無(wú)菌的干凈籠子里喂養(yǎng)，飲用水和食物均經(jīng)高溫及高壓消毒，飼養(yǎng)溫度為24℃，每天恒溫光照12 h。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑：水合氯醛(上海士鋒生物科技有限公司，貨號(hào)：EB05980)；大鼠抗小鼠白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)抗體(上海振譽(yù)生物科技有限公司，貨號(hào)：CSB-E08055r-1)；Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)抗體(上海恒斐生物科技有限公司，貨號(hào)：K002172P)；核因子κB抑制蛋白α(nuclear factor κB inhibitor α，IκBα)抗體(武漢益普生物科技有限公司，貨號(hào)：ATA31699)；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)抗體(廈門研科生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：IQP-163P)；細(xì)胞間黏附因子1(intercellular adhesion factor 1，ICAM-1)抗體(北京孚博生物科技有限公司，貨號(hào)：EBP11753)；蘇木精-伊紅染色劑(北京伊塔生物科技有限公司，貨號(hào)：YT8681)，TRIzol試劑(北京伊塔生物科技有限公司，貨號(hào)：YT2188),PCR試劑盒(上海撫生實(shí)業(yè)有限公司，貨號(hào)：FS01P1954)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 慢病毒載體構(gòu)建：大鼠miRNA-34a的序列查找和設(shè)計(jì)均由GenePharma公司完成。重組的LV-miRNA-34a和LV-Sponge(抑制載體)慢病毒表達(dá)載體由GenePharma公司合成，并經(jīng)測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證；之后行慢病毒滴度測(cè)定(病毒滴度為108TU/mL)，重組慢病毒制備完成后置于-80℃保存。

1.2.2 分組及建模：按照隨機(jī)數(shù)字表法將60只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、過(guò)表達(dá)組、沉默組，各15只。其中模型組、過(guò)表達(dá)組、沉默組根據(jù)高燕萍等[5]方法建立類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型。通過(guò)腹腔注射0.2～0.5 mL/100 g 10%水合氯醛將大鼠麻醉后，以仰臥位將大鼠的頭部和四肢固定在手術(shù)臺(tái)上。消毒大鼠尾根部后注射0.2 mL熱殺死(160℃～180℃，2 h)結(jié)核分枝桿菌(5 mg/mL；上海臻科生物科技有限公司)，最后用消毒棉球壓住注射部位，防止藥物滲出。注射處無(wú)液體外漏后，把大鼠放進(jìn)籠中讓其自然蘇醒和活動(dòng)。建模后對(duì)大鼠進(jìn)行關(guān)節(jié)指數(shù)評(píng)分，關(guān)節(jié)指數(shù)評(píng)分>4分說(shuō)明建模成功。關(guān)節(jié)指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[5]，0～4分分別為無(wú)腫脹、指關(guān)節(jié)稍腫、關(guān)節(jié)輕度紅腫、關(guān)節(jié)中度紅腫和輕度功能障礙、關(guān)節(jié)重度紅腫接近畸形，16分為最高分?jǐn)?shù)。建模成功后，于沉默組大鼠雙后肢骨關(guān)節(jié)處注射含10 μL LV-Sponge抑制載體的慢病毒懸液，于過(guò)表達(dá)組大鼠雙后肢骨關(guān)節(jié)處注射含10 μL LV-miRNA-34a表達(dá)載體的慢病毒懸液，空白組、模型組大鼠不做任何處理，干預(yù)7 d后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 前足跖腫脹度、關(guān)節(jié)組織評(píng)分：采用玻璃容器法測(cè)定大鼠左側(cè)前足跖腫脹度情況，首先將直徑2 cm、高8～10 cm的玻璃試管固定在鐵架臺(tái)上，注入適量的水。然后在大鼠前足跖關(guān)節(jié)處畫一刻度線，作為大鼠前足跖入水刻度的標(biāo)志。試驗(yàn)時(shí)將大鼠前足跖踝關(guān)節(jié)刻度線以下的足跖沒(méi)入水中，水面自然升高，此時(shí)在水面的最高處畫一刻度線，然后取出大鼠前足跖踝關(guān)節(jié)，用1 mL注射器向玻璃試管內(nèi)加水至大鼠前足跖足跖入水后所畫的刻度線，所加入的水的體積便是大鼠前足跖的體積。雙后肢關(guān)節(jié)組織評(píng)分，0～4分分別為正常、輕度紅腫、中等程度紅腫、嚴(yán)重腫脹、關(guān)節(jié)畸形。

1.2.4 TNF-α、IL-1β、ICAM-1水平的檢測(cè)：常規(guī)采集大鼠尾部空腹靜脈血液4 mL置于無(wú)抗凝劑的一次性真空采血管中備用，標(biāo)本置于37℃孵箱孵育，待血液完全凝固后3 000 r/min離心10 min分離血清，置于-20℃保存待測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)血清TNF-α、IL-1β、ICAM-1水平。將血清樣本置于室溫復(fù)溫后，取出試劑盒，標(biāo)記酶標(biāo)板，制作標(biāo)準(zhǔn)品，以1 ∶2的稀釋液稀釋樣品；在反應(yīng)孔上依次加入稀釋好的待測(cè)血清及標(biāo)準(zhǔn)品，100 μL/孔，放于37℃恒溫孵育箱中濕育2 h；用專用洗滌液將反應(yīng)板清洗3次后，加入抗體工作液(按1 ∶100倍稀釋)，100 μL/孔，置于37℃恒溫孵育箱中濕育45 min；繼續(xù)清洗反應(yīng)板4次后，在反應(yīng)孔內(nèi)加入3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺溶液，100 μL/孔，置于37℃恒溫孵育箱中濕育45 min后在反應(yīng)孔內(nèi)加入終止液(100 μL/孔)以終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上讀取450 nm處波長(zhǎng)(參考波長(zhǎng)570～630 nm)的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TNF-α、IL-1β、ICAM-1水平。

1.2.5 切片及染色:采用斷頭法處理大鼠，取大鼠雙后肢關(guān)節(jié)滑膜組織，使用40 mL/L多聚甲醛固定后常規(guī)石蠟包埋、切片，厚度為3 μm，之后行蘇木精-伊紅染色，使用光學(xué)顯微鏡觀察大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)變化。

1.2.6 成骨細(xì)胞增殖和凋亡檢測(cè)：(1)細(xì)胞增殖檢測(cè)。將大鼠在體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇中浸泡3～5 min，取頭蓋骨，清除骨膜、血管等軟組織，磷酸緩沖鹽溶液清洗后剪成1 mm×1 mm的小塊，0.25%胰蛋白酶37℃消化20 min，0.1%Ⅱ型膠原酶中37℃震蕩，取細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心10 min將沉淀的細(xì)胞塊加入培養(yǎng)液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后分裝與25 mL培養(yǎng)瓶中，置于顯微鏡下觀察后放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后貼壁2.0～3.0 d換液1次，待長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶時(shí)開始傳代。取各組大鼠的成骨細(xì)胞，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，將成骨細(xì)胞分別接種于96孔板，2 000個(gè)/孔，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，每孔均加入完全培養(yǎng)基，在37℃、含5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，在培養(yǎng)終止前4 h向每孔細(xì)胞中加入20 μL 5 mg/mL的四甲基偶氮唑鹽溶液，4 h后吸去培養(yǎng)液，加入100 μL的二甲基亞砜，振蕩器震蕩5 min后讀取酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率=(細(xì)胞組的吸光度/空白孔的吸光度-1)×100%。(2)細(xì)胞凋亡檢測(cè)。將各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大鼠成骨細(xì)胞傳代后，取第2代成骨細(xì)胞接種至6孔板中(接種密度為5×107/L)，并將其置于飽和濕度、37℃、含5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 d、48 d和72 d后，加入0.25%濃度的胰蛋白酶進(jìn)行消化，2 000 r/min離心5 min后收取細(xì)胞，隨即使用磷酸緩沖鹽溶液洗滌3 min，再重復(fù)洗滌2次，再次以2 000 r/min離心5 min后收集細(xì)胞，加入1 mL碘化丙啶染液后在常溫、避光的環(huán)境中放置1 h并用特異熒光標(biāo)記，在鞘液包裹下高速流動(dòng)，流動(dòng)期間會(huì)發(fā)射出光子，嚴(yán)格按照流式細(xì)胞儀檢測(cè)方法，利用發(fā)光信號(hào)測(cè)量?jī)x檢測(cè)光子數(shù)值，檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.7 TLR4、IκBα mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)：取各組大鼠雙后肢關(guān)節(jié)組織，加入1 mL TRIzol后研磨為粉末狀，按照試劑盒說(shuō)明書提取大鼠關(guān)節(jié)組織中總RNA，采用Eppendorf 核酸蛋白分析儀鑒定及測(cè)定RNA濃度和純度，應(yīng)用GeneAmp PCR System 9700核酸擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，試劑盒購(gòu)自納昂達(dá)(南京)生物科技有限公司(批號(hào)：232-964-5)反應(yīng)條件為37℃ 15 min、85℃ 5 s，將獲得的cDNA放于4℃保存。以cDNA為模板，以β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參，配置20 μL反應(yīng)體系，包括上下游引物各0.4 μL、1 μL cDNA模板、10 μL SYBR Green，加蒸餾水至20μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s、95℃ 5 s、60℃ 31 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。使用美國(guó)生產(chǎn)的ABI 7300型PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算TLR4、IκBα mRNA表達(dá)水平。使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列，β-肌動(dòng)蛋白引物為上游5′-CTGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3′，下游5′-CGCAACTAAGTCATAGTCCGCC-3′；TLR4的上游引物5′-ACTTGGACCTTTCCAGCAAC-3′，下游引物5′-TTTAAATGCACCTGGTTGGA-3′；IκBα的上游引物5′-AATACCCCTCTCCATC,下游引物5′-CAGCACCCAAAGTCAC。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，方差齊的計(jì)量資料比較采用單因素分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊則使用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠前足跖腫脹度和關(guān)節(jié)組織評(píng)分的比較 與空白組比較，模型組、過(guò)表達(dá)組、沉默組大鼠足跖腫脹度、關(guān)節(jié)組織評(píng)分均升高(均P<0.05)，過(guò)表達(dá)組、模型組、沉默組大鼠足跖腫脹度、關(guān)節(jié)組織評(píng)分依次降低(均P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠前足跖腫脹度和關(guān)節(jié)組織評(píng)分的比較(x±s)

2.2 各組大鼠血清炎因子水平的比較 與空白組比較，其他3組大鼠血清TNF-α、IL-1β、ICAM-1水平升高(均P<0.05)；過(guò)表達(dá)組、模型組、沉默組大鼠血清TNF-α、IL-1β、ICAM-1水平依次降低(均P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠血清炎因子水平的比較(x±s，pg/mL)

2.3 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織的病理學(xué)變化 空白組大鼠關(guān)節(jié)間隙圓滑清晰，關(guān)節(jié)間隙中無(wú)炎癥細(xì)胞；模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨和成骨組織破壞；過(guò)表達(dá)組關(guān)節(jié)滑膜組織中可見有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，組織內(nèi)增生明顯；沉默組關(guān)節(jié)滑膜組織中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，軟骨和成骨組織破壞程度明顯減輕。見圖1。

空白組 模型組 過(guò)表達(dá)組 沉默組

2.4 各組大鼠成骨細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)增殖率和凋亡率的比較 各時(shí)間點(diǎn)，與空白組相比，其他3組成骨細(xì)胞增殖率降低，凋亡率升高；過(guò)表達(dá)組、模型組、沉默組大鼠成骨細(xì)胞增殖率依次升高，凋亡率依次降低(均P<0.05)。見表3。

表3 4組大鼠成骨細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)增殖率和凋亡率的比較(x±s，%)

2.5 各組大鼠關(guān)節(jié)組織TLR4、IκBα mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較 與空白組比較，其他3組大鼠關(guān)節(jié)組織TLR4、IκBα mRNA相對(duì)表達(dá)水平升高，過(guò)表達(dá)組、模型組、沉默組大鼠關(guān)節(jié)組織TLR4、IκBα mRNA相對(duì)表達(dá)水平依次降低(均P<0.05)。見表4。

表4 4組大鼠關(guān)節(jié)組織中TLR4和IκBα mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

3 討 論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種以炎性滑膜炎為主要特征的疾病，以手、足多關(guān)節(jié)、侵襲性的小關(guān)節(jié)炎癥為主要表現(xiàn)，常伴隨著關(guān)節(jié)外器官受累，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和關(guān)節(jié)功能喪失[6-7]，病因較為復(fù)雜。成骨細(xì)胞是骨形成過(guò)程中一種至關(guān)重要的細(xì)胞，主要負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌以及礦化。成骨細(xì)胞主要通過(guò)成骨細(xì)胞的增殖、細(xì)胞外基質(zhì)的成熟、細(xì)胞外基質(zhì)的礦化以及成骨細(xì)胞的凋亡4個(gè)方面影響骨形成，其功能的活躍程度以及活躍狀態(tài)與骨形成密切相關(guān)[8-9]。在正常的機(jī)體生理?xiàng)l件下，成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成及破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收之間相互影響，使骨細(xì)胞的修復(fù)和重建處于動(dòng)態(tài)平衡，這可有效維持機(jī)體正常的骨量以及骨密度。發(fā)生類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎后，機(jī)體的骨形成和骨吸收之間的動(dòng)態(tài)平衡被破壞，導(dǎo)致骨結(jié)構(gòu)、密度出現(xiàn)異常[10-11]。

miRNA-34a在細(xì)胞衰老、細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡中有著重要作用，還可以調(diào)節(jié)T、B淋巴細(xì)胞的分化，參與自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制。研究顯示，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型中，miRNA-34a受到抑制時(shí)，滑膜細(xì)胞凋亡率降低，且低于正常大鼠[12]。本研究建立類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型后，觀察沉默miRNA-34a對(duì)癥狀緩急以及成骨細(xì)胞的影響，結(jié)果顯示，沉默miRNA-34a后可明顯抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠前足跖腫脹，緩急關(guān)節(jié)癥狀，抑制成骨細(xì)胞凋亡，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖。

TNF-α是炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞因子，主要通過(guò)激活成骨細(xì)胞和促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖來(lái)促進(jìn)炎癥反應(yīng)，從而參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[13]。TNF-α還可以直接作用于成骨細(xì)胞，激活骨細(xì)胞產(chǎn)生蛋白酶和前列腺素E2進(jìn)一步保護(hù)軟骨不受侵蝕和破壞[14]。研究表明，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的血清和關(guān)節(jié)液中TNF-α均高表達(dá)[15]。IL-1β存在于單核細(xì)胞與軟骨細(xì)胞內(nèi)，可以促進(jìn)炎癥發(fā)展和激活骨細(xì)胞，是影響類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)生和發(fā)展的主要細(xì)胞因子[16]。欒仲秋等[17]研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的軟骨細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，對(duì)細(xì)胞凋亡有重要的調(diào)節(jié)作用；抑制IL-1β表達(dá)可以有效保護(hù)骨組織不受破壞，同時(shí)還可以抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。ICAM-1屬于免疫球蛋白，主要參與免疫監(jiān)督和炎癥反應(yīng)[18]。研究表明，ICAM-1與炎癥細(xì)胞的黏附和浸潤(rùn)有密切關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，沉默miRNA-34a后，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠血清TNF-α、IL-1β、ICAM-1水平降低，提示沉默miRNA-34a表達(dá)可以抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠體內(nèi)的炎性反應(yīng)。

TLR4屬于Toll樣受體，分布于各組織細(xì)胞內(nèi)，在淋巴組織中表達(dá)最高[19]。TLR4可以選擇性地識(shí)別病原體，然后激活機(jī)體產(chǎn)生抗體[20]。近年來(lái)有研究顯示，TLR4在免疫炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，可以刺激骨細(xì)胞釋放促炎因子，且發(fā)病早期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者/大鼠關(guān)節(jié)滑膜中TLR4蛋白表達(dá)水平上升[21]。IκBα主要存在于真核細(xì)胞，控制著細(xì)胞分化和凋亡等過(guò)程，IκBα缺乏可導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生[22]。在成骨細(xì)胞內(nèi)，miRNA-34a受特異性因子調(diào)節(jié)，這導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞增殖能力降低，且可以調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的分化[23]。本研究結(jié)果顯示，沉默miRNA-34a后，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)組織中TLR4、IκBα mRNA表達(dá)水平降低，這提示沉默miRNA-34a可能通過(guò)抑制TLR4/IκBα信號(hào)通路從而發(fā)揮促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡的作用。

綜上所述，沉默miRNA-34a可以抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，并緩解關(guān)節(jié)癥狀，機(jī)制可能與其下調(diào)TLR4/IκBα信號(hào)通路從而促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。