曾 燕 勾憲飛 陳曉燕 許志新

(1 重慶市第七人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶市 400069，電子郵箱：demeterpow@163.com；2 重慶市涪陵區(qū)婦幼保健院產(chǎn)科，重慶市 408000；3 重慶市中醫(yī)院婦科，重慶市 400000；4 重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，重慶市 400016)

妊娠糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)是一種常見的妊娠期并發(fā)癥，影響全球約25%的孕婦[1-2]。GDM嚴(yán)重影響母嬰健康，其不僅是胎兒致死率、致殘率增高的重要原因，還增加孕婦發(fā)生子癇、產(chǎn)后大出血及難產(chǎn)等并發(fā)癥或不良預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)[3]。此外，GDM患者及其子代遠(yuǎn)期更易發(fā)生2型糖尿病或肥胖等代謝紊亂疾病[4]。而在妊娠期間母體對(duì)胰島素的敏感性會(huì)隨著妊娠進(jìn)展而逐漸降低，為維持正常的血糖水平，機(jī)體對(duì)胰島素的需求量將顯著增加[5]，故母體的胰島B細(xì)胞數(shù)量增多及功能增強(qiáng)，以分泌更多的胰島素應(yīng)對(duì)母體升高的血糖濃度[6-7]。因此，大量學(xué)者認(rèn)為胰島B細(xì)胞的數(shù)量減少及功能障礙與GDM的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[3，6-7]。

胃饑餓素是胃黏膜層α細(xì)胞分泌的一種內(nèi)源性活性肽，由28個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子量為33 000，其作為生長(zhǎng)激素促分泌素的內(nèi)源性配體，能夠顯著刺激生長(zhǎng)激素促分泌激素的釋放[8]。既往大量研究證實(shí)，GDM患者體內(nèi)的胃饑餓素表達(dá)顯著降低，其可能與母體胰島素抵抗的發(fā)生具有相關(guān)性[9-11]，但胃饑餓素在GDM患者胎兒體內(nèi)的表達(dá)情況及其對(duì)胰島B細(xì)胞功能的影響卻尚未明確。因此本研究通過(guò)觀察胃饑餓素在GDM患者與正常妊娠孕產(chǎn)婦血清及其臍帶血中的表達(dá)差異，分析胃饑餓素水平與GDM患者血糖、胰島素代謝指標(biāo)的相關(guān)性，并進(jìn)一步探討胃饑餓素對(duì)胰島B細(xì)胞功能的影響，為闡明GDM及相關(guān)代謝疾病的發(fā)生和發(fā)展提供新的理論基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床標(biāo)本來(lái)源 選取2018年4月至2019年4月于重慶市第七人民醫(yī)院婦產(chǎn)科住院分娩的50例GDM孕產(chǎn)婦(GDM組)，并選取同時(shí)期正常妊娠的50例孕產(chǎn)婦作為對(duì)照組。GDM的診斷符合第9版《婦產(chǎn)科學(xué)》[12]中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，即在妊娠第24～28周空腹口服75 g葡萄糖進(jìn)行OGTT，達(dá)到空腹血糖≥5.1 mmol/L、服糖后2 h血糖≥10.0 mmol/L、服糖后3 h血糖≥8.5 mmol/L中任意一項(xiàng)即可診斷為GDM。所有孕產(chǎn)婦均為單胎妊娠且經(jīng)陰道分娩。排除合并心腦血管、肺、肝、腎等疾病者，合并甲狀腺等內(nèi)分泌疾病者及妊娠前確診為糖尿病者。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書，本研究已通過(guò)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批。

1.2 細(xì)胞系及主要試劑 胰島B細(xì)胞MIN6購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。RPMI-1640、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyClone公司(批號(hào)：AD15505803、AD14201137)；β-巰基乙醇、L-谷氨酰胺、青鏈霉素混合液均為100 U/mL購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(批號(hào)：EZ1300F509、EZ0415D216、EZ419F107)；細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)(cell counting kit-8，CCK-8)試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-fluorescein isothiocyanate，Annexin V-FITC)/碘化丙啶凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天(批號(hào)：D77041、D253071)；大鼠抗小鼠胃饑餓素單克隆抗體、大鼠抗小鼠B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)X蛋白(B-cell lymphoma-2 associated X protein，Bax)單克隆抗體、人胃饑餓素酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abcam公司(批號(hào)：ab10953、ab07409、ab50121)；兔抗小鼠活化型合半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase,Cleaved-Caspase-3)單克隆抗體、大鼠抗小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)購(gòu)自美國(guó)CST公司(批號(hào)：40718T、20933T)；兔抗小鼠蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)多克隆抗體，兔抗小鼠磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-Akt)多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Selleckchem公司(批號(hào)：S1104、S1219)；辣根過(guò)氧化物酶(hoseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗兔或抗大鼠IgG二抗購(gòu)自武漢博士德(批號(hào)：AR1075)；SYBR Premix Ex Taq試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司(批號(hào)：RR309AB)；Opti-MEM購(gòu)自美國(guó)Gibco公司(批號(hào)：30152-D417)；TRIzol、二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司(批號(hào)：129340、746286)；小鼠胰島素ELISA試劑盒(美國(guó)Andygene公司，批號(hào)：043-S5261B)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；胃饑餓素過(guò)表達(dá)慢病毒載體(LV-胃饑餓素)和陰性對(duì)照慢病毒載體(LV-NC)由上海凱基生物科技有限公司構(gòu)建；PCR引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣本采集及血糖檢測(cè):所有研究對(duì)象均禁食8～10 h，于次日采集其肘靜脈血5 mL，并于胎兒娩出且斷臍后采集臍帶血3 mL。將收集到的外周靜脈血與臍帶血于室溫下2 200 r/min離心5 min，取上層血清，采用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)空腹血糖及臍帶血葡萄糖水平，應(yīng)用放射免疫法測(cè)定空腹胰島素(fasting insulin,FINS)及臍帶血胰島素水平。計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)指數(shù)，HOMA-IR指數(shù)=(空腹血糖×FINS)/22.5。常規(guī)測(cè)量?jī)山M研究對(duì)象產(chǎn)前身高及體重，并計(jì)算其體質(zhì)指數(shù)，體質(zhì)指數(shù)=體重(kg)/身高2(m2)。

1.3.2 外周血及臍帶血胃饑餓素水平檢測(cè)：按照ELISA試劑盒使用說(shuō)明方法檢測(cè)兩組孕產(chǎn)婦外周血及臍帶血血清中胃饑餓素表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及慢病毒轉(zhuǎn)染：(1)細(xì)胞培養(yǎng)。常規(guī)復(fù)蘇胰島B細(xì)胞MIN6后，使用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素、100 μg/mL L-谷氨酰胺及5 μL/mL β-巰基乙醇的RPMI-1640培養(yǎng)液于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。待MIN6細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)融合至80%時(shí)，使用0.25%的胰酶進(jìn)行消化傳代。(2)分組方法。將細(xì)胞分為7組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組，即正常培養(yǎng)且無(wú)任何特殊處理的MIN6細(xì)胞；LV-NC組，即正常培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染LV-NC的MIN6細(xì)胞(RPMI-1640葡萄糖濃度為5.0 mmol/L)；LV-胃饑餓素組，即正常培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染LV-胃饑餓素的MIN6細(xì)胞(RPMI-1640葡萄糖濃度為5.0 mmol/L)；高糖組，即采用葡萄糖濃度為20.0 mmol/L的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)的MIN6細(xì)胞；高糖+LV-NC組，即采用高糖(葡萄糖濃度為20.0 mmol/L)培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染LV-NC 24 h后的MIN6細(xì)胞；高糖+LV-胃饑餓素組，即采用高糖(葡萄糖濃度為20.0 mmol/L)培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)的感染LV-胃饑餓素慢病毒24 h后的MIN6細(xì)胞；高糖+LY294002組，即應(yīng)用終濃度為25 μmol/L的磷脂酰基醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)抑制劑LY294002(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：EZ1018D031)10 μM進(jìn)行預(yù)處理30 min后再經(jīng)高糖(葡萄糖濃度為20.0 mmol/L)培養(yǎng)液培養(yǎng)的MIN6細(xì)胞。上述各組細(xì)胞置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(3)轉(zhuǎn)染方法。轉(zhuǎn)染前24 h，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MIN6細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)消化后計(jì)數(shù)，按1×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種至6孔板中，并加入200 μL預(yù)先使用Opti-MEM稀釋的慢病毒液(感染復(fù)數(shù)=30)，同時(shí)加入12.5 μg終質(zhì)量濃度為5 μg/mL的Polybrene(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：EZ7409A231)，充分混勻后于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄除原培養(yǎng)液，更換為上述新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)原條件培養(yǎng)72 h后，用4 μg/mL的嘌呤霉素進(jìn)行篩選10 d，取穩(wěn)定感染后的細(xì)胞采用實(shí)時(shí)熒光PCR及蛋白質(zhì)印跡法分別檢測(cè)胃饑餓素mRNA及蛋白的表達(dá)。

1.3.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力：收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的待測(cè)MIN6細(xì)胞，常規(guī)消化細(xì)胞后接種至96孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度至2×104個(gè)/孔,并向每孔加入200 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別于12 h、24 h、36 h、48 h時(shí)向每孔加入10 μL CCK-8試劑后繼續(xù)原條件培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)：HBS-1101)檢測(cè)每孔于490 nm處的吸光度值，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

1.3.5 Annexin V-FITC法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況：收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的待測(cè)MIN6細(xì)胞，2 200 r/min離心5 min，棄上清，使用4℃預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液洗滌細(xì)胞2次，2 min/次，按上述方法離心后收集細(xì)胞沉淀，用195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞密度至7×105個(gè)/mL。依次加入5 μL Annexin V-FITC及10 μL碘化丙啶染色液，輕輕搖晃離心管以充分混勻后，室溫下避光孵育30 min。300目濾膜過(guò)濾細(xì)胞團(tuán)塊后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD Bioscience公司，型號(hào)：FACSCalibur)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.3.6 胰島素釋放試驗(yàn)：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)照組、LV-NC組與LV-胃饑餓素組的MIN6細(xì)胞，使用含低糖(3.3 mmol/L)或高糖(16.7 mmol/L)的RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別進(jìn)行處理1 h。取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，3 400 r/min離心10 min后按照胰島素ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)上清液中的胰島素含量。實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.3.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR：取LV-胃饑餓素組、LV-NC組及對(duì)照組MIN6細(xì)胞，采用TRIzol法提取待測(cè)細(xì)胞總RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)純度與濃度后，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Thermo公司，批號(hào)：01116837)說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系：0.5 μg RNA模板，1 μL引物，4 μL 5×反應(yīng)緩釋液，1 μL RiboLock RNase抑制劑，2 μL 10 mM dNTP Mix，1 μL RevertAid M-MuLVRT，無(wú)RNA酶水補(bǔ)充至20 μL。再按照實(shí)時(shí)熒光PCR試劑說(shuō)明書及預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的反應(yīng)時(shí)間與溫度進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，反應(yīng)體系為：10 pmol引物、10 μL 2×Taq Master Mix、3 μL的cDNA模板和10 μL ddH2O，共25 μL體系。反應(yīng)條件為95℃(10 min)預(yù)變性后，變性95℃(7 s)→退火60℃(20 s)→72℃(38 s)，40個(gè)循環(huán)周期。胃饑餓素上游引物：5′-GCAGCAGCGGCTTCACA-3′，下游引物：5′-ACATCCAAACAGGAGCGTCAT-3′；GAPDH上游引物：5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游引物：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。 以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算胃饑餓素 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.8 蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)：取方法1.3.3中的各組MIN6細(xì)胞，使用4℃預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液洗滌細(xì)胞3次，2 min/次，加入RIPA細(xì)胞裂解液及蛋白酶抑制劑提取細(xì)胞中總蛋白。采用二喹啉甲酸法進(jìn)行蛋白定量，將蛋白樣品加入5×上樣緩沖液(體積比為1 ∶4)，并于沸水中加熱變性10 min。取30 μg的蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳以分離蛋白，采用濕轉(zhuǎn)法將分離的蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，5%的脫脂奶粉于室溫下封閉2 h后,分別加入Akt(1 ∶500)、p-Akt(1 ∶300)、Bax(1 ∶800)、Cleaved-Caspase-3(1 ∶800)、胃饑餓素(1 ∶500)、GAPDH(1 ∶1 500)一抗，4℃搖床孵育過(guò)夜。洗滌緩沖液清洗3次，5 min/次，以HRP標(biāo)記的二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h，以洗滌緩沖液清洗3次，5 min/次。最后均勻滴加化學(xué)發(fā)光液發(fā)光液后，使用凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照，Image J軟件測(cè)定條帶灰度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參GAPDH的比值作為其相對(duì)含量。以上實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0和GraphPad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Spearman法分析胃饑餓素水平與相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)間的相關(guān)性。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組孕產(chǎn)婦的臨床資料比較 兩組孕產(chǎn)婦的年齡、分娩時(shí)孕周、產(chǎn)前血壓、產(chǎn)前體質(zhì)指數(shù)、胎盤質(zhì)量、新生兒體重、新生兒性別比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，而GDM組孕產(chǎn)婦的空腹血糖、FINS、HOMA-IR指數(shù)、臍帶血葡萄糖、臍帶血胰島素、臍帶血 HOMA-IR指數(shù)均高于對(duì)照組(均P<0.05)，見表1。

表1 兩組孕產(chǎn)婦臨床資料的比較

2.2 兩組孕產(chǎn)婦外周血和臍帶血胃饑餓素水平 GDM組外周血和臍帶血胃饑餓素表達(dá)水平均低于對(duì)照組(P<0.05)。見表2。Spearman相關(guān)分析顯示，對(duì)照組、GDM組孕產(chǎn)婦外周血胃饑餓素表達(dá)水平均與臍帶血胃饑餓素表達(dá)水平呈正相關(guān)(rs=0.434，P<0.001；rs=0.628，P<0.001)。

表2 兩組孕產(chǎn)婦外周血及臍帶血胃饑餓素水平的比較(x±s，pg/mL)

2.3 GDM孕產(chǎn)婦外周血及臍帶血胃饑餓素水平與糖代謝相關(guān)指標(biāo)之間的相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)分析顯示，GDM孕產(chǎn)婦外周血胃饑餓素水平與空腹血糖、FINS及HOMA-IR指數(shù)均呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.481，P<0.001；rs=-0.352，P=0.036；rs=-0.412，P<0.001)，臍帶血胃饑餓素水平亦與空腹血糖、FINS及HOMA-IR均呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.602，P<0.001；rs=-0.317，P<0.001；rs=-0.289，P<0.001)。

2.4 慢病毒感染后胰島B細(xì)胞胃饑餓素mRNA及蛋白的表達(dá) 與對(duì)照組相比，LV-胃饑餓素組細(xì)胞的胃饑餓素 mRNA與蛋白相對(duì)表達(dá)水平均增加(均P<0.05)，而LV-NC組細(xì)胞的胃饑餓素mRNA與蛋白相對(duì)表達(dá)水平的變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表3及圖1。

表3 3組胰島B細(xì)胞胃饑餓素mRNA及蛋白的相對(duì)表達(dá)水平(x±s)

圖1 3組胰島B細(xì)胞中胃饑餓素蛋白的表達(dá)情況

2.5 過(guò)表達(dá)胃饑餓素對(duì)高糖誘導(dǎo)的胰島B細(xì)胞增殖的影響 培養(yǎng)48 h時(shí)，與對(duì)照組相比，高糖組、高糖+LV-NC組及高糖+LV-胃饑餓素組胰島B細(xì)胞增殖能力均降低(P<0.05)；而與高糖組相比，高糖+LV-胃饑餓素組胰島B細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)(P<0.05)，高糖+LV-NC組的細(xì)胞增殖能力變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 4組胰島B細(xì)胞增殖能力的比較(x±s，吸光度值)

2.6 過(guò)表達(dá)胃饑餓素對(duì)高糖誘導(dǎo)的胰島B細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組相比，高糖組、高糖+LV-NC組及高糖+LV-胃饑餓素組胰島B細(xì)胞的凋亡率均降低(P<0.05)；而與高糖組相比，高糖+LV-胃饑餓素組胰島B細(xì)胞的凋亡率降低(P<0.05)，高糖+LV-NC組的細(xì)胞凋亡率變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表5及圖2。

表5 4組胰島B細(xì)胞凋亡率的比較(x±s，%)

圖2 4組胰島B細(xì)胞的凋亡情況

2.7 過(guò)表達(dá)胃饑餓素對(duì)胰島B細(xì)胞胰島素分泌功能的影響 在低糖的條件下，低糖+LV-胃饑餓素組的胰島素釋放能力較低糖組明顯增加(P<0.05)，而低糖+LV-NC組無(wú)明顯改變(P>0.05)；在高糖的條件下，高糖+LV-胃饑餓素組的胰島素釋放能力亦較高糖組明顯增加(P<0.05)，而高糖+LV-NC組與高糖組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表6。

表6 各組胰島B細(xì)胞胰島素含量(x±s，μg/mL)

2.8 過(guò)表達(dá)胃饑餓素對(duì)高糖條件下胰島B細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，高糖組、高糖+LV-NC組、高糖+LV-胃饑餓素組及高糖+LY294002組胰島B細(xì)胞的p-Akt/Akt蛋白比值(Akt磷酸化水平)降低，而Bax及Cleaved-Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)水平增加(P<0.05)；與高糖組、高糖+LV-NC組和高糖+LY294002組相比，高糖+LV-胃饑餓素組胰島B細(xì)胞的Akt磷酸化水平增加，Bax及Cleaved-Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低(P<0.05)，見表7及圖3。

表7 胰島B細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

圖3 各組胰島B細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

3 討 論

近年來(lái)，胃饑餓素作為既往具有GDM病史患者發(fā)生2型糖尿病的重要危險(xiǎn)因素而逐漸得到重視[13]。胃饑餓素是主要由人體胃腸消化系統(tǒng)分泌的一種生物性多肽，其在下丘腦、心臟、胰腺細(xì)胞、肺及胎盤組織等其他組織中也有少量表達(dá)[14-16]。在體內(nèi)，胃饑餓素作為一種促進(jìn)食欲的多肽，不僅能夠促進(jìn)食物的攝入和體重的增加，還能控制能量的代謝和胰島素的分泌，因此胃饑餓素在胰島素抵抗、肥胖及糖尿病等胰島素相關(guān)疾病的發(fā)生中具有重要作用[17-18]。而關(guān)于胃饑餓素與GDM的關(guān)系，既往大量研究已證實(shí)，GDM患者血清及胎盤組織中胃饑餓素的表達(dá)顯著降低，且胃饑餓素水平與GDM患者的血糖、三酰甘油等糖脂代謝指標(biāo)及HOMA-IR指數(shù)呈負(fù)相關(guān)[9-11]，但目前關(guān)于胃饑餓素在GDM患者臍帶血中表達(dá)的研究甚少。

本研究結(jié)果顯示，GDM組外周血、臍帶血胃饑餓素表達(dá)水平均低于對(duì)照組(P<0.05)，提示胃饑餓素可能參與GDM的發(fā)生，這與既往研究結(jié)果[10-11，19]相似。此外，對(duì)照組、GDM組孕產(chǎn)婦外周血胃饑餓素表達(dá)水平均與臍帶血胃饑餓素表達(dá)水平呈正相關(guān)(P<0.05)，這說(shuō)明妊娠母體胃饑餓素水平變化可能影響胎兒體內(nèi)胃饑餓素的表達(dá)。進(jìn)一步分析胃饑餓素與糖代謝指標(biāo)的相關(guān)性，結(jié)果顯示GDM孕產(chǎn)婦外周血、臍帶血中的胃饑餓素表達(dá)水平均與其空腹血糖水平、胰島素水平及HOMA-IR指數(shù)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，這表明胃饑餓素可能參與GDM患者及其胎兒的胰島素抵抗，且能影響兩者的血糖代謝過(guò)程。

研究顯示，胰島B細(xì)胞的數(shù)量減少及功能障礙與胰島素抵抗、GDM、糖尿病等代謝相關(guān)性疾病的發(fā)生和發(fā)展具有密切關(guān)系[3，6-7]。因此，本研究通過(guò)體外培養(yǎng)胰島B細(xì)胞MIN6，并通過(guò)慢病毒載體轉(zhuǎn)染以過(guò)表達(dá)胃饑餓素，從而進(jìn)一步明確高糖環(huán)境下過(guò)表達(dá)胃饑餓素對(duì)胰島B細(xì)胞功能的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LV-胃饑餓素組細(xì)胞的胃饑餓素mRNA與蛋白表達(dá)水平均增加(P<0.05)，說(shuō)明成功建立了過(guò)表達(dá)胃饑餓素的胰島B細(xì)胞系。經(jīng)高糖干預(yù)，高糖組的細(xì)胞增殖受到抑制，而凋亡率升高(P<0.05)；但與高糖組相比，高糖+LV-胃饑餓素組胰島B細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，凋亡率降低(P<0.05)。這提示過(guò)表達(dá)胃饑餓素能夠明顯減輕高糖對(duì)胰島B細(xì)胞增殖能力的抑制及促凋亡作用。此外，ELISA檢測(cè)顯示，在低糖或高糖條件下，過(guò)表達(dá)胃饑餓素的細(xì)胞的胰島素釋放能力均較低糖組或高糖組明顯增加(P<0.05)，提示無(wú)論在低糖或高糖環(huán)境中，過(guò)表達(dá)胃饑餓素均能促進(jìn)胰島B細(xì)胞分泌胰島素。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)胃饑餓素能夠改善高糖環(huán)境對(duì)胰島B細(xì)胞的功能損傷。

PI3K/Akt信號(hào)通路是與糖代謝密切相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑之一，該信號(hào)通路在胰島B細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝、增殖、凋亡等過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[20-21]。Akt是表達(dá)于多種組織及細(xì)胞中的一種絲/蘇氨酸激酶，有研究顯示Akt經(jīng)磷酸化激活后有助于胰島B細(xì)胞抵抗糖脂毒性的損傷[22]。此外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，脂肪酸能夠通過(guò)抑制Akt的磷酸化水平誘導(dǎo)胰島B細(xì)胞發(fā)生凋亡[23]。Bax是分布于細(xì)胞質(zhì)的重要促凋亡蛋白，其在接受上游傳導(dǎo)的凋亡信號(hào)后被激活并發(fā)生分子構(gòu)象的改變，隨即誘發(fā)細(xì)胞的一系列改變，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。凋亡蛋白酶Caspase-3是各種凋亡途徑的樞紐分子，也是細(xì)胞凋亡的指示劑，它的激活提示細(xì)胞已進(jìn)入凋亡早期并最終發(fā)生細(xì)胞死亡[24]。本研究結(jié)果顯示，與高糖組與高糖+LV-NC組、高糖+LY294002X組相比，高糖+LV-胃饑餓素組胰島B細(xì)胞的Akt磷酸化水平增高，Bax及Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，提示過(guò)表達(dá)胃饑餓素能夠顯著促進(jìn)高糖環(huán)境中胰島B細(xì)胞的Akt磷酸化水平，并下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Bax與Cleaved-Caspase-3的表達(dá)；而預(yù)先使用LY294002處理細(xì)胞后，胰島B細(xì)胞中Akt磷酸化水平的抑制作用更為顯著，故凋亡相關(guān)蛋白Bax及Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)明顯升高，這進(jìn)一步提示促進(jìn)PI3K/Akt信號(hào)通路的表達(dá)能有效保護(hù)胰島B細(xì)胞。

綜上所述，在GDM患者外周血及臍帶血中胃饑餓素表達(dá)均降低，且其與血糖水平和胰島素抵抗密切相關(guān)。過(guò)表達(dá)胃饑餓素能夠通過(guò)促進(jìn)PI3K/Akt信號(hào)通路的活化來(lái)改善高糖所致的胰島B細(xì)胞損傷及功能障礙。