張瑋，李華南，趙娜，駱雄飛，劉斯文，陳英英，包安，王海騰，海興華，王金貴

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院推拿科，天津 300193）

腸道黏膜通透性在非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）的發(fā)病中起到關(guān)鍵作用，且通透性的高低與NAFLD的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。目前，已有眾多研究證實(shí)[1-3]，以改善腸道黏膜通透性為干預(yù)靶點(diǎn)的治療方法均可逆轉(zhuǎn)和預(yù)防NAFLD的進(jìn)一步發(fā)展。腹部推拿治療NAFLD的臨床療效已被證實(shí)，但其機(jī)制研究尚處于探索階段，相關(guān)研究甚少。最新研究證實(shí)，肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）、肌球蛋白輕鏈磷酸化（P-MLC）及多聚體的纖維狀肌動(dòng)蛋白（F-actin）的含量及相互作用與調(diào)控腸道黏膜通透性密切相關(guān)。因此，項(xiàng)目組以MLCK、P-MLC和F-actin為切入點(diǎn)，探索腹部推拿治療NAFLD的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)的健康成年SD大鼠30只，2～3 月齡，體質(zhì)量（200±20）g，雌雄不限，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證：SCXK（京）2014-0004。

1.2 主要試劑與設(shè)備 F-actin Antibody（美國Proteintech公司），DAPI（鼎國，北京），PDAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），Western LightningChemiluminescenceReagent（美國PerkinElmer公司），Super RX感光膠片（日本FUJIFILM公司），LabWorksTM凝膠成像及分析系統(tǒng)（美國UVP公司），VE-386型轉(zhuǎn)移電泳槽（北京原平皓生物技術(shù)有限公司），倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司），熒光顯微鏡（日本SONY公司）

2 方法

2.1 造模方法 將SD大鼠進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)，1周后參考文獻(xiàn)造模方法[4]進(jìn)行大鼠的NAFLD模型復(fù)制。利用高脂飼料，每日對(duì)SD大鼠進(jìn)行灌胃處理，飼料喂養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)為10 mL/kg。正常對(duì)照組則進(jìn)行蒸餾水灌胃處理。6周后，隨機(jī)選擇3只SD大鼠，其中1只為正常大鼠，2只為造模大鼠，處死后取出肝臟，并進(jìn)行肝組織的蘇木精-伊紅（HE）染色，以判斷造模是否成功。

2.2 分組與治療 將剩余的18只模型大鼠和9只健康大鼠進(jìn)行1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)。然后采用隨機(jī)數(shù)字表法分為腹部推拿組、模型組，每組9只。剩余9只健康大鼠為正常對(duì)照組。腹部推拿組：手法施術(shù)方案來源于津沽臟腑推拿第四代傳承人王金貴教授的經(jīng)驗(yàn)方。且為保證推拿施術(shù)一致性，實(shí)驗(yàn)前會(huì)應(yīng)用YF-3手法測定儀（上海中醫(yī)藥大學(xué)和復(fù)旦大學(xué)共同研發(fā)）采集王金貴教授手法信息，待操作者手法力度、頻率波形軌跡與王金貴教授模型基本一致后，方可于實(shí)驗(yàn)大鼠身上操作。具體操作如下：模型大鼠取仰臥位，束縛于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，操作者位其左側(cè)，將并攏的右手示指、中指指腹置于大鼠腹部中央。通過腕關(guān)節(jié)有節(jié)律的旋轉(zhuǎn)，帶動(dòng)示指和中指依次施術(shù)于模型大鼠的腹部。手法操作的轉(zhuǎn)動(dòng)頻率為每分鐘20～30次，操作10 min，連續(xù)治療28 d。模型組采用同樣的束縛方式，但不予腹部推拿干預(yù)，10 min后結(jié)束束縛。正常對(duì)照組不予任何干預(yù)手段。

2.3 實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物處理 經(jīng)過28 d干預(yù)，3組實(shí)驗(yàn)大鼠開始禁食不禁水處理，持續(xù)12 h。然后在實(shí)驗(yàn)大鼠的腹腔注射1%戊巴比妥鈉。大鼠昏迷之后，行手術(shù)取出部分回腸組織涂片于載玻片，然后利用4℃4%多聚甲醛進(jìn)行固定。

2.4 肝組織HE染色 將實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行麻醉，行手術(shù)取出部分肝臟組織，放入10%的福爾馬林溶液中；酒精脫水后放入二甲苯。然后將組織塊置入石蠟中并包埋，切成5～8 μm薄片。脫去石蠟，經(jīng)高濃度到低濃度乙醇后入蒸餾水。HE染色后光鏡下觀察。

2.5 免疫蛋白印跡（Western blot）法檢測MLCK及P-MLC蛋白表達(dá) 向1.5 mL EP管中加入500 μL RIPA裂解液重懸，進(jìn)行黏膜組織的裂解；配制分離膠為10%的SDS-PAGE凝膠；配制SDS變性5%聚丙烯酰胺凝膠；取蛋白樣品進(jìn)行上樣，進(jìn)行電泳，待目的蛋白分離后停止電泳；分別與一抗、二抗結(jié)合；最后曝光、顯影、定影，用LabWorks凝膠成像分析系統(tǒng)攝像。

2.6 免疫熒光方法檢測腸黏膜P-MLC與F-actin的共定位 待4%多聚甲醛固定30 min后，用預(yù)冷的1×磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3遍。然后利用4℃，0.5%Triton X-100通透5 min，用預(yù)冷的1×PBS浸洗3遍，每次5 min，吸水紙吸干殘余PBS。在室溫下，用10%驢血清封閉2 h（1×PBS稀釋）。吸棄封閉液，加一抗（鼠單抗P-MLC：1%驢血清1∶100稀釋；兔多抗 F-actin：1%驢血清 1∶50稀釋），放入濕盒內(nèi)，4℃過夜。吸棄一抗結(jié)合液，PBS浸洗3次，每次5 min。加二抗（1%血清1∶100稀釋），避光，室溫作用 2 h。預(yù)冷的PBS浸洗3次，每次5 min。加DAPI（1∶1 000，1×PBS稀釋），4℃避光作用5 min。PBS浸洗3次，每次3 min。用吸水紙吸干殘余液體。封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察圖像。熒光顯微鏡下觀察P-MLC與F-actin共定位情況。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 研究數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 24.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間比較用單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 肝臟組織HE染色 肝臟組織HE染色結(jié)果顯示，模型組的肝細(xì)胞呈氣球樣變，結(jié)構(gòu)紊亂，且包含數(shù)量較多的脂肪空泡，而正常對(duì)照組肝細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)正常，結(jié)果表明造模復(fù)制成功，見圖1。

3.2 MLCK及P-MLC的表達(dá) 采用Western blot方法，用LabWorksTM凝膠成像及分析系統(tǒng)進(jìn)行攝像分析，分析計(jì)算各組MLC及p-MLCK條帶亮度的相對(duì)值。經(jīng)單因素方差分析顯示，3組MLCK及P-MLC表達(dá)量數(shù)據(jù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；模型組的MLCK及P-MLC表達(dá)明顯增多；與模型組比較，腹部推拿組的MLCK及P-MLC表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；正常對(duì)照組的MLCK及P-MLC表達(dá)量處于模型組和腹部推拿組之間。見表1、圖2。

圖2 MLCK、P-MLC的表達(dá)Fig.2 Expression of MLCK and P-MLC

3.3 P-MLC和F-actin的共定位 通過轉(zhuǎn)染鼠單抗P-MLC和兔多抗F-actin，進(jìn)行免費(fèi)熒光制片、顯微拍攝。其中鼠單抗P-MLC：為紅光；兔多抗F-actin：為綠光；藍(lán)光為DAPI染細(xì)胞核。結(jié)果顯示：3組腸黏膜涂片P-MLC與F-actin均存在共定位，但是腹部推拿組的P-MLC和F-actin表達(dá)量最高。見圖3。

圖3 P-MLC/F-actin/DAPI免疫熒光檢測組圖Fig.3 P-MLC/F-actin/DAPI immunofluorescence detection group

4 討論

NAFLD是全球最常見的慢性肝病，其患病率已達(dá)25.24%[5]。據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)發(fā)布的最新統(tǒng)計(jì)顯示[6]，中國已成為年齡標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率最高的地區(qū)之一，而NAFLD正是誘發(fā)肝癌風(fēng)險(xiǎn)的首要因素[7-8]。因此，防治NAFLD已成為降低肝癌發(fā)病率和病死率的重要醫(yī)學(xué)策略。這也與中醫(yī)“既病防變”的理念高度契合。隨著“腸-肝軸”概念的廣泛認(rèn)知，NAFLD的研究聚點(diǎn)也逐步前移至腸道。剖釋NAFLD發(fā)病的啟動(dòng)機(jī)制，腸道黏膜通透性的增高是整個(gè)機(jī)制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[9]。因此，如何維護(hù)腸道黏膜通透性，重新構(gòu)建平衡的腸-肝對(duì)話，已成為未來潛在的研究熱點(diǎn)。

表1 3組大鼠MLCK及P-MLC表達(dá)量（±s）Tab.3 Expression of MLCK and P-MLC（±s）

表1 3組大鼠MLCK及P-MLC表達(dá)量（±s）Tab.3 Expression of MLCK and P-MLC（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù) MLCK含量 P-MLC含量正常對(duì)照組 9 0.66±0.875# 0.51±0.427#模型組 9 1.38±0.246* 0.85±0.700*腹部推拿組 9 0.21±0.100*# 0.32±0.469*#

現(xiàn)階段，對(duì)于細(xì)胞內(nèi)力學(xué)信號(hào)傳遞途徑的研究更多聚焦于MLCK信號(hào)通路。因?yàn)榧?xì)胞骨架蛋白F-actin在細(xì)胞中央遠(yuǎn)比細(xì)胞外圍穩(wěn)固，故細(xì)胞的外圍對(duì)外界機(jī)械力刺激更為敏感。MLCK恰巧定位于細(xì)胞外圍較多。故本研究選擇MLCK信號(hào)通路作為研究調(diào)控腸黏膜通透性的信號(hào)路通。許多研究者認(rèn)為P-MLC是腸黏膜通透性增加的分子基礎(chǔ)，其水平的高低可以調(diào)控細(xì)胞微絲骨架的結(jié)構(gòu)，從而影響通透性。而P-MLC水平正是由MLCK所調(diào)控。本研究的結(jié)果也證明，通過高脂飲食誘導(dǎo)NAFLD大鼠模型腸道黏膜組織中的MLCK與P-MLC表達(dá)均增高。說明高脂飲食可以增強(qiáng)MLCK信號(hào)通路的活性，介導(dǎo)P-MLC表達(dá)上升，通過解聚細(xì)胞骨架蛋白F-actin破壞腸道黏膜屏障功能，使通透性增高，加劇腸道內(nèi)細(xì)胞毒素對(duì)肝細(xì)胞的破壞。而通過腹部推拿28 d的干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，MLCK與P-MLC表達(dá)均顯著下降，證明腹部推拿可有效抑制MLCK蛋白及其介導(dǎo)的P-MLC蛋白表達(dá)，從而減緩腸道黏膜通透性的增加，為肝細(xì)胞逆轉(zhuǎn)脂肪變性奠定基礎(chǔ)。

既往研究證實(shí)，細(xì)胞微絲骨架蛋白F-actin、PMLC的改變與MLCK信號(hào)通路的活性密切相關(guān)[10]。MLCK可通過調(diào)控P-MLC水平進(jìn)而解聚或重塑F-actin結(jié)構(gòu)，引起微絲重新分布，造成力學(xué)不穩(wěn)定，使細(xì)胞群收縮，細(xì)胞間隙增大，通透性增強(qiáng)。故本研究還利用了免疫熒光觀測了P-MLC與F-actin的共定位關(guān)系。研究結(jié)果顯示3組均存在共定位關(guān)系，但是腹部推拿組的P-MLC和F-actin的表達(dá)量最高。證明通過腹部推拿干預(yù)后，可增加P-MLC和F-actin處于同一區(qū)域的概率。腹部推拿可以抑制MLCK與P-MLC表達(dá)，可以增加P-MLC和F-actin共定位的關(guān)系，這種結(jié)果也間接為腹部推拿通過機(jī)械力重塑細(xì)胞骨架蛋白奠定研究基礎(chǔ)。

本研究通過對(duì)MLCK、P-MLC表達(dá)以及P-MLC與F-actin的共定位關(guān)系，初步驗(yàn)證了腹部推拿對(duì)腸道黏膜通透性的干預(yù)作用。同時(shí)，也為后續(xù)腹部推拿重塑細(xì)胞骨架蛋白的研究提供了研究支持。