張彥兵 張石磊 劉良波 謝全亮 孫延鳴*

（1石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832003；2石河子大學生命科學學院，新疆石河子 832003）

非洲豬瘟（African Swine Fever,ASF）自從 2018年秋季傳入我國，迅速在我國各地區(qū)豬場點狀散發(fā)，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的損失。非洲豬瘟病毒感染豬體，會造成豬體皮膚發(fā)紅、發(fā)紺，出現(xiàn)皮炎，強毒感染可導致豬多個臟器出血，例如，脾臟、腎臟等出血，對豬體造成嚴重的病理損傷。非洲豬瘟病毒（African Swine Fever Virus,ASFV）感染的靶細胞主要是豬原代肺泡巨噬細胞、樹突狀細胞以及骨髓細胞等[1]。

ASFV作為一類DNA病毒，基因組大小為170～190 kb，兩端為可變區(qū)域，中間為保守的核心區(qū)域；由于兩端高度可變使得ASFV具有較多的基因型[2]。ASFV有多層外膜包裹著病毒核酸，因此該病毒具有較強的耐受性，對酸堿不敏感；在潮濕的條件下，ASFV在豬肉中存活數(shù)年之久[3]。ASFV的滅活疫苗不能提供免疫保護，基因缺失疫苗仍然具有一定的毒力，甚至可導致豬只死亡[4]。到目前為止，仍然沒有安全有效的ASF疫苗用于豬群的免疫保護。目前，為了防控ASFV的傳播，主要采取生物安全防控措施來遏制病毒。

一般DNA甲基化發(fā)生在基因序列的cg位點，cg位點又稱CpG位點，其甲基化主要由DNA甲基化轉移酶（DNMTs）調控，哺乳動物DNA甲基化轉移酶主要包括DNMT3B、DNMT3A和DNMT1，基因啟動子區(qū)域高甲基化抑制基因表達，啟動子區(qū)域低甲基化則利于基因轉錄表達[5]。ASFV復制過程中完全借助宿主細胞進行自我復制，宿主細胞自身DNA甲基化修飾是否參與限制病毒基因復制的過程，從而抑制ASFV的復制，還不清楚。

本文首次預測分析ASFV的復制相關基因E165R的啟動子及其甲基化，通過生物信息學分析E165R基因的啟動子活性和轉錄因子，進一步利用生物信息學手段預測其啟動子甲基化區(qū)域。從DNA甲基化角度，初步分析病毒基因E165R啟動子特性及其DNA甲基化位點，為研究DNA甲基化調控ASFV的感染奠定初步基礎。

1 材料和方法

研究中所用的主要軟件：DNA star、MEGA 7、NCBI Blast、BDGP、Promoter 2.0 Prediction、AliBaba 2.1、Meth Primer、QUMA等。

1.1 啟動子預測及進化樹構建

據(jù)報道，ASFV的E165R基因與病毒的復制相關。為了分析其啟動子序列，首先從National Center for Biotechnology Information（NCBI） 獲得中國 ASFV毒株 （African swine fever virus isolate Pig/HLJ/2018） 全序列（基因登錄號：MK333180.1）[6]，從序列中選取E165R的編碼區(qū)，進一步截取其上游500 bp的序列，作為其啟動子。在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對E165R的啟動子并下載其他ASFV毒株的序列，利用MEGA7構建進化樹。

1.2 啟動子活性及轉錄起始位點預測

利用在線預測軟件BDGP（Berkeley Drosophila Genome Project）（http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）預測啟動子活性，打開軟件，輸入所要預測的DNA序列，點擊submit按鈕，軟件開始運行分析。

利用 Promoter 2.0 Prediction Server[7]軟件 （http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/）預測啟動子活性區(qū)域，打開軟件輸入被預測的DNA序列。

1.3 啟動子區(qū)域轉錄因子預測

打開在線軟件AliBaba 2.1（http://gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html），在對話框中將要預測的DNA序列粘貼進去，選擇中等條件的參數(shù)，點擊START按鈕運行程序。

1.4 甲基化區(qū)域預測及甲基化檢測引物設計

利用在線軟件Meth Primer（Meth Primer-Design Primers for Methylation PCRs）[8]預測可能的甲基化區(qū)域，進一步設計甲基化檢測引物，打開瀏覽器，輸入IP地址：http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/met hprimer.cgi，網(wǎng)址點開后會顯示軟件的操作界面，將被預測的DNA序列粘貼到對話框中，點擊submit按鈕，軟件運行顯示結果，會給出幾組引物序列選項。

1.5 DNA甲基化序列分析

DNA甲基化數(shù)據(jù)分析quantification tool for methylation analysis[9]軟件，打開瀏覽器并輸入 IP：http://quma.cdb.riken.jp/按下Enter鍵打開軟件，genomic對話框輸入基因組DNA序列，第二和第三對話框輸入，測序獲得的重亞硫酸鹽處理轉化后的序列，具體見表1。

表1 重亞硫酸鹽處理轉化后的序列比對

2 結果

2.1 ASFV dUTPase（E165R）基因序列分析及其啟動子區(qū)域預測

從NCBI數(shù)據(jù)庫中，搜索ASFV的基因信息，選擇下載 Pig/HLJ/2018（MK333180），發(fā)現(xiàn)此毒株的E165R基因ATG是從166 507位點開始的，本研究截取E165R上游500 bp左右作為其啟動子（165 985～166 506）。

2.2 ASFV dUTPase（E165R）基因啟動子同源進化分析

在NCBI下載35株ASFV的E165R基因啟動子序列，ASFV毒株分離時間跨度為1978—2019年，利用MEGA 7軟件中NJ-1000方法構建同源進化樹；通過進化樹可以看到，不同來源的ASFV分為2大群，中國新分離的毒株與俄羅斯遠東地區(qū)分離的毒株同源關系很近，ASFV E165R基因啟動子處于165 985～166 506之間，選擇的E165R基因啟動子非常保守，在2大群中間都較保守（圖1）。在此基礎上，進一步分析E165R基因的啟動子活性及甲基化位點CpG才有實際意義，也能較為普遍地反映ASFV毒株的E165R基因啟動子甲基化區(qū)域。

圖1 E165R基因啟動子同源進化樹分析

2.3 ASFV dUTPase（E165R）基因啟動子活性預測

軟件運行完畢之后會輸出預測結果，結果中score的值越高表示預測結果越可信，圖2中score值在0.98～1.0之間，表明預測結果可信度較高，所預測的啟動子活性可信。此外，啟動子序列中每一個預測結果里字體變大的堿基，表示轉錄起始位點。

圖2 BDGP軟件預測結果顯示

利用Promoter 2.0預測軟件，預測啟動子轉錄起始位點，打開軟件輸入被預測的DNA序列，單擊submit選項運行軟件。運行結束后會更新頁面，顯示出預測的結果。預測結果顯示，在第200位附近有一個潛在的轉錄起始位點，score值為0.619（圖3）；因此，預測在第200位點上下游區(qū)域為可能的啟動子活性中心。為了更加直觀地顯示所預測的E165R基因啟動子活性，在序列上將2種軟件所預測的活性區(qū)域進行標注，同時標出基因的ORF區(qū)域（圖4）。

圖3 Promoter2.0預測結果顯示界面

圖4 ASFV E165R基因啟動預測活性區(qū)域及其ORF區(qū)域

2.4 ASFV dUTPase（E165R）基因啟動子轉錄因子預測

在預測E165R基因啟動子的基礎上，進一步利用在線軟件AliBaba 2.1預測其轉錄因子，共預測到7個轉錄因子，分別是 c-Jun、c-Fos、GCN4、2個 Sp1、Oct-1和C/EBPalp（圖5）。其中較為常見的有c-Jun、Sp1和C/EBPalp。轉錄因子的成功預測與啟動子活性的成功預測是相一致的。在轉錄因子Sp1、Oct-1和C/EBPalp結合序列上均含有cg甲基化位點，cg位點已標出（圖 5）。

圖5 E165R（dUTPase）基因啟動子轉錄因子預測及CG位點標注

2.5 ASFV dUTPase（E165R）基因啟動子甲基化檢測方法

利用meth primer軟件設計并預測可能的甲基化區(qū)域，打開軟件輸入序列，勾選亞硫酸氫鹽測序法（Bisulfite sequencing PCR,BSP）選項并點擊提交，可以獲得5對BSP的引物，軟件根據(jù)引物CG含量、退火溫度等綜合后進行了排名，實際情況下首選F1和R1為目標引物，如圖6。BSP引物上不能含有被測的CpG位點，這樣可以保證甲基化和非甲基化的片段高效擴增，保證擴增片段的準確性。BSP擴增的片段要通過TA克隆連接克隆載體，進一步挑選克隆產(chǎn)物進行測序分析，每個處理組克隆數(shù)目不少于15個。

圖6 BSP引物設計結果示意圖

除了設計BSP引物，還可利用軟件設計甲基化特異性的引物 PCR（Methylation-specific PCR,MSP），結果見圖7。在同一區(qū)域有2條引物，但每條引物的3’UTR處至少包含一個CpG位點，M引物為XXXCG，則與之對應的U引物為XXXTG。MSP法可以根據(jù)甲基化或非甲基化引物擴增的條帶，迅速確定基因片段是否存在甲基化。若MF擴增出條帶，UF無條帶則說明在這一區(qū)域存在甲基化；反過來，UF能擴增出條帶，而MF不能擴增出條帶，則表明此區(qū)域不存在甲基化。

圖7 MSP引物設計結果示意圖

3 討論

ASFV編碼150～200種蛋白，許多病毒蛋白與病毒的復制密切相關[10-12]。如，E165R是ASFV復制所需的關鍵蛋白[13]。在豬的基因甲基化研究中，發(fā)現(xiàn)大量的重復序列處于高甲基化水平[14]，而這些重復序列恰恰源于病毒基因。說明宿主一般通過高甲基化的形式來限制某些有害基因的表達。

宿主DNA甲基化修飾可能參與限制病毒基因的復制，例如乙型肝炎病毒基因中存在高甲基化與其病毒蛋白復制有關[15,16]。本文選擇ASFV復制相關基因E165R為研究對象，分析其啟動子甲基化等的特性。雖然ASFV基因型較多，但是ASFV的E165R基因啟動子序列較保守；通過在線軟件分析預測到ASFV基因的3個潛在啟動子活性中心，說明預測的E165R啟動子在理論上具有活性，將來還需進一步克隆其啟動子并驗證活性。此外，在啟動子上預測到了常見的一些轉錄因子，例如c-Jun、c-Fos、GCN4、Sp1、C/EBPalp[17,18]等。值得注意的是，在轉錄因子Sp1和Oct-1的結合區(qū)域上含有cg甲基化位點，如果這些結合位點發(fā)生甲基化則會抑制轉錄因子與啟動子的結合，最終抑制E165R基因啟動子激活從而限制蛋白的合成。

DNA甲基化的檢測方法有BSP（重亞硫酸氫鹽測序法）和MSP（甲基化特異性檢測法）等。BSP是甲基化檢測的金標準，優(yōu)點是檢測結果準確、可信度高；缺點是成本較高[5]。MSP的檢測方法主要優(yōu)點是快捷迅速、成本低；但是，MSP對于半甲基化的基因不易區(qū)分甲基化水平的高低。本文針對E165R啟動子序列成功設計了甲基化檢測引物，包括BSP和MSP。

4 小結

研究中對E165R基因啟動子進行了生物信息學分析，預測到了E165R基因的啟動子活性區(qū)域、啟動子轉錄因子及甲基化區(qū)域。此外，本文對ASFV的復制相關基因E165R啟動子設計了甲基化檢測引物，為將來在甲基化方向深入研究ASFV的感染復制機理打下了基礎。