覃曉虹 劉志昂 陸婷婷 楊 溢 董建輝

(中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九二三醫(yī)院1 檢驗(yàn)科，2 移植科，廣西南寧市 530021，電子郵箱：499432680@qq.com)

腎移植術(shù)后急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)與移植腎的免疫損傷、缺血損傷等密切相關(guān)[1-2]。目前，臨床上一般通過(guò)監(jiān)測(cè)患者術(shù)后血清肌酐水平的變化來(lái)預(yù)測(cè)是否發(fā)生腎移植術(shù)后AKI，然而當(dāng)血清肌酐水平升高時(shí)，腎移植患者的腎功能可能已經(jīng)呈嚴(yán)重減退狀態(tài)，這對(duì)患者的生命安全造成嚴(yán)重威脅[3-4]。因此，亟待尋找一種敏感性和/或特異性較強(qiáng)的腎移植術(shù)后AKI的早期診斷標(biāo)志物。有研究發(fā)現(xiàn)，血清微小RNA(microRNA，miRNA)-21表達(dá)水平的變化與腎細(xì)胞的增殖及凋亡有關(guān)[5]。但目前關(guān)于miRNA-21在腎移植術(shù)后AKI早期診斷中的應(yīng)用研究仍較少。因此，本研究探討血清miRNA-21在腎移植術(shù)后并發(fā)AKI早期診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年1月至2020年2月我院收治的84例腎移植受者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)在我院接受規(guī)律血液透析治療1個(gè)月以上，且在我院接受腎移植術(shù)者；(2)AKI診斷符合《改善全球腎臟病預(yù)后組織臨床實(shí)踐指南》中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[6]；(3)入組患者均對(duì)本研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)接受2次以上腎移植受者；(2)臨床資料不全者。根據(jù)患者術(shù)后是否發(fā)生AKI分為AKI組和非AKI組，每組42例。AKI組男性27例、女性15例，年齡18～57(33.16±2.87)歲。非AKI組男性24例、女性18例，年齡17～59(32.37±4.15)歲。另選取同期在本院體檢的42例健康者作為對(duì)照組，男性25例、女性17例，年齡20～61(34.09±5.12)歲。3組研究對(duì)象的性別、年齡等一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性。本研究通過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集：分別采集研究對(duì)象空腹靜脈血3 mL，2 500 r/min離心15 min分離血清，置于-80℃保存待檢。腎移植患者于腎移植術(shù)后第2天、對(duì)照組于體檢當(dāng)日采集。

1.2.2 儀器與試劑：ViiA 7型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、TRIzol(批號(hào)：181203)及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)：1948302)由Life Technologies公司提供，Versa Fluor比色杯熒光分光光度計(jì)由Bio-Rad公司提供，AU680全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)樂(lè)特公司。miRNA-21引物及內(nèi)參U6由上海生工生物工程公司合成，miRNA-21上游引物序列為：5′-AGCAAGUCUGAGUACUGAUGCAGUGCAUCAUGUCACCGUUGCAU-3′，下游引物序列為：5′-ACAAAUCGACUUGCAUCGCCUGU-3′；內(nèi)參U6引物序列為：5′-TCTCGCTCGCACGCAGA-3′(正向)，5′-TAACGCTCACAATTTGCGGT-3′(反向)；miRNA-21逆轉(zhuǎn)錄引物序列為：5′-CUCGUGAUUUACUGGCCCCUGCUCGAGAGAUGAGGAUAACUAGCACUGAGCCA-3′；內(nèi)參U6逆轉(zhuǎn)錄引物序列為：5′-CTTGCGCGGAATAGCTTCTTCAT-3′。

1.2.3 檢測(cè)方法：(1)血清總RNA提取。參照TRIzol試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)樣本中RNA濃度及純度。(2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，反應(yīng)體系為20 μL，包括2 μL RNA樣品、1 μL引物、1 μL逆轉(zhuǎn)錄酶、1 μL U6反向引物、0.5 μL RNase 抑制劑、1 μL dNTP 混合物(10 mM)、4 μL 5×RT 緩沖液、9.5 μL不含RNase的H2O 。反應(yīng)條件為42℃ 30 s，92℃ 10 min，65℃ 30 s，32℃ 1 min，產(chǎn)物置于-20℃保存。(3)PCR擴(kuò)增。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系共25 μL，包括2 μL稀釋的cDNA、12.5 μL SYBP Premix EX TaqTMⅡ、2 μL引物、8.5 μL ddH2O。反應(yīng)條件為30℃ 5 min，42℃ 10 min，85℃ 30 s，45℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。(4)結(jié)果分析。miRNA-21的相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt值(miRNA-21)-2-ΔΔCt值(U6)。(5)檢測(cè)血清肌酐、尿酸、降鈣素原及尿素氮水平。血清肌酐正常值：男性54～106 μmol/L，女性44～97 μmol/L；血清尿酸正常值：男性237.9～356.9 μmol/L，女性178.4～297.4 μmol/L。血清降鈣素原正常值：0.15～14 ng/mL；血清尿素氮正常值：3.10～8.80 mmol/L。計(jì)算腎小球?yàn)V過(guò)率，男性腎小球?yàn)V過(guò)率(mL/min)=[(140-年齡)×體重(kg)]/血肌酐(μmol/L)×1.23，女性腎小球?yàn)V過(guò)率(mL/min)=[(140-年齡)×體重(kg)]/血肌酐(μmol/L)×1.04。腎小球?yàn)V過(guò)率正常值：90～125 mL/min。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析，采用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線分析血清miRNA-21預(yù)測(cè)腎移植后AKI的臨床價(jià)值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組研究對(duì)象血清miRNA-21相對(duì)表達(dá)量的比較 AKI組、非AKI組、對(duì)照組的血清miRNA-21相對(duì)表達(dá)量分別為(3.51±0.98)、(1.13±0.27)、(1.04±0.19)，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=231.196，P<0.001)，其中AKI組的血清miRNA-21相對(duì)表達(dá)量均高于非AKI組與對(duì)照組(均P<0.05)，而非AKI組與對(duì)照組的血清miRNA-21相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 AKI組和非AKI組實(shí)驗(yàn)室相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)的比較 術(shù)后第2天，AKI組患者的血清肌酐、尿酸、降鈣素原及尿素氮水平均高于非AKI組，而腎小球?yàn)V過(guò)率低于非AKI組(均P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 AKI組和非AKI組實(shí)驗(yàn)室相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)的比較(x±s)

2.3 腎移植患者血清miRNA-21相對(duì)表達(dá)水平與腎損傷指標(biāo)的相關(guān)性 由Pearson分析結(jié)果可知，腎移植患者血清miRNA-21相對(duì)表達(dá)水平與血清肌酐、尿酸、降鈣素原及尿素氮均呈正相關(guān)(均P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 血清miRNA-21與腎損傷指標(biāo)的相關(guān)性

2.4 血清miRNA-21相對(duì)表達(dá)量對(duì)腎移植后AKI的預(yù)測(cè)價(jià)值 ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清miRNA-21相對(duì)表達(dá)水平預(yù)測(cè)腎移植后AKI的曲線下面積為0.875(95%CI：0.834，1.971，P<0.001)，約登指數(shù)為0.754，敏感度為91.04%，特異度為86.17%，見(jiàn)圖1。

圖1 血清miR-21NA相對(duì)表達(dá)水平預(yù)測(cè)腎移植后并發(fā)AKI的ROC曲線

3 討 論

腎移植是大多數(shù)終末期腎臟疾病患者的理想治療方式，但移植術(shù)后患者往往并發(fā)腎損傷，影響移植腎功能的恢復(fù)[7-8]。目前，臨床上一般根據(jù)患者術(shù)后尿量、血清肌酐、尿素氮等指標(biāo)評(píng)價(jià)患者移植腎功能，但上述指標(biāo)的診斷敏感性和特異性均較低，影響患者的病情評(píng)估[9]。既往研究顯示，miRNA與狼瘡性腎炎、糖尿病腎病、IgA腎病等腎臟疾病相關(guān)[10],而miRNA-21位于17q23.2染色體上，其表達(dá)與腫瘤、腎臟、心血管等疾病有關(guān)[11-12]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，腎移植術(shù)后并發(fā)AKI患者術(shù)后1～3 d的血清miRNA-21表達(dá)水平均高于腎移植術(shù)后無(wú)AKI患者。本研究結(jié)果也顯示，AKI組的血清miRNA-21相對(duì)表達(dá)量高于非AKI組與對(duì)照組(P<0.05)，而非AKI組與對(duì)照組的血清miRNA-21相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示miRNA-21在腎移植術(shù)后并發(fā)AKI患者血清中呈高表達(dá)。鐘開(kāi)義等[13]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-21在AKI患者血清中的表達(dá)水平明顯升高，可能可以作為診斷AKI的生物學(xué)標(biāo)志物。相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，miRNA-21可調(diào)控腎臟缺血再灌注損傷大鼠的腎小管上皮細(xì)胞壞死及凋亡[14]。由以上結(jié)果推測(cè)，miRNA-21可能來(lái)源于受損腎組織，故腎移植術(shù)后并發(fā)AKI患者的血清miRNA-21表達(dá)上調(diào)。

本研究結(jié)果顯示，AKI組患者的血清肌酐、尿酸、降鈣素原及尿素氮水平均高于非AKI組，腎小球?yàn)V過(guò)率低于非AKI組，且血清miRNA-21相對(duì)表達(dá)量與血清肌酐、尿酸、降鈣素原及尿素氮均呈正相關(guān)(均P<0.05)，提示血清miRNA-21表達(dá)量與腎移植術(shù)后并發(fā)AKI患者腎損傷的嚴(yán)重程度有關(guān)。林建等[15]的研究表明，miRNA-21在AKI患者血清中表達(dá)升高，可作為患者預(yù)后的評(píng)價(jià)指標(biāo)。本研究ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清miRNA-21相對(duì)表達(dá)水平預(yù)測(cè)腎移植術(shù)后并發(fā)AKI的曲線下面積為0.875，約登指數(shù)為0.754，敏感度為91.04%，特異度為86.17%，說(shuō)明血清miRNA-21表達(dá)量對(duì)預(yù)測(cè)腎移植術(shù)后并發(fā)AKI具有重要價(jià)值，可作為預(yù)測(cè)腎移植術(shù)后并發(fā)AKI的評(píng)價(jià)指標(biāo)。曹李娜等[16]的研究也發(fā)現(xiàn)，miRNA-21診斷心臟介入術(shù)后并發(fā)AKI的特異度較高，可作為AKI診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。

綜上所述， miRNA-21在腎移植后并發(fā)AKI患者血清中呈高表達(dá)，其與患者病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)，或可作為腎移植后并發(fā)AKI的早期診斷指標(biāo)。由于本研究納入的樣本量有限，研究結(jié)果存在一定局限性，今后需加大樣本量，深入探討miRNA-21表達(dá)量影響腎移植后并發(fā)AKI的機(jī)制。