孫曉峰 汪 峰 岑 堯 胡玉崇 薩日娜 楊慧君

(1 包頭醫(yī)學院內(nèi)蒙古臨床醫(yī)學院，包頭市 014040，電子郵箱:312432187@qq.com；內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院2 病理科，3 婦產(chǎn)科，呼和浩特市 010016)

根據(jù)國際癌癥研究署公布的數(shù)據(jù),2012年全球宮頸癌新增病例約52.8萬,死亡病例約27萬,其中超過一半的新發(fā)病例和死亡病例發(fā)生于欠發(fā)達地區(qū)[1]。宮頸癌呈現(xiàn)出高發(fā)病率、高死亡率及年輕化特征[2]。由于缺乏有效的篩查程序，宮頸癌成為發(fā)展中國家的公共衛(wèi)生問題之一，眾多發(fā)展中國家必須制定簡單、廉價、有效的策略以應對宮頸癌的篩查和治療[3]。由于受到種族及地域的影響，不同人群的人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染峰值年齡、流行病學現(xiàn)狀以及感染病毒類型不同[4-5]，其中性活躍女性感染率較高，感染峰齡在18～28歲[6]。中國是宮頸癌的高發(fā)地區(qū)之一，每年新發(fā)病例約9.89萬例，死亡病例約3.05萬例[7]。中國是多民族聚居的國家，其HPV感染型別及發(fā)病率呈現(xiàn)不同的特征。我國學者通過對內(nèi)蒙古地區(qū)女性開展早期診斷篩查，發(fā)現(xiàn)蒙古族與漢族女性HPV感染的優(yōu)勢型別排序相同[2]。但目前鮮少有關于蒙古族女性宮頸癌預后標志物的相關研究成果。本研究分析宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅰ級(cervical intraepithelial neoplasia grade Ⅰ,CINⅠ)的蒙古族女性病變組織中高危型HPV載量與P16蛋白表達的相關性，以及聯(lián)合應用兩者預測患者組織學轉歸的可行性，以期為蒙古族女性宮頸CINⅠ患者的精準治療提供指導。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年1月至2017年12月期間，于內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院婦科門診就診的118例蒙古族女性CINⅠ患者作為研究對象。納入標準：戶籍上民族為蒙古族的中國公民；有性生活史3年以上；行薄層液基細胞學檢查；在陰道鏡檢查滿意的前提下行陰道鏡下宮頸多點活檢及宮頸搔刮術，經(jīng)組織病理學檢查確診；患者簽署知情同意書；患者自愿接受并配合隨訪；具備隨訪條件且近3個月內(nèi)未經(jīng)藥物或物理治療。排除標準：妊娠期女性；合并其他免疫系統(tǒng)疾病或服用相關抑制劑等女性。118例CINⅠ患者年齡18～67歲，其中18～<49歲共76例，49～67歲共42例。

1.2 高危型HPV載量的檢測 于月經(jīng)結束后3～7 d進行檢測，檢測前應避免性生活、陰道沖洗及陰道栓劑藥物的使用，排除存在陰道炎性疾病、陰道內(nèi)置入藥物治療或理療史、宮頸錐切或子宮手術史。受檢者取婦科檢查截石位，以窺器充分暴露宮頸后，拭去表面分泌物，用專用子宮頸脫落細胞采集器尖端伸入宮頸內(nèi)口，直到兩翼刷毛和宮頸口兩側緊密接觸，大拇指與食指握住刷柄，朝一個方向旋轉2～5圈以獲得足量細胞樣本，抽出宮頸刷后將宮頸刷靜置于洗脫管的專用細胞封存液中，沿刷柄固定折痕處折斷，緊旋洗脫管蓋，直立放置，然后對送檢小瓶進行編號，標注詳細信息，1周內(nèi)送檢。采用二代雜交捕獲術檢測高危型HPV載量，檢測試劑購自杭州德同生物技術有限公司(批號：SPS20J02)，可檢測的HPV類型包括高危型HPV16、HPV18以及非高危型HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68。HPV-DNA含量以檢測樣本的相對光單位(relative light unit，RLU)與標準陽性對照平均值(cut of ration，CO)的比值表示[8]。RLU/CO值<1為陰性，RLU/CO值≥1為陽性，其中1≤RLU/CO值<10為低載量，10≤RLU/CO值<100為中低載量，100≤RLU/CO值<1 000為中高載量，RLU/CO值≥1 000為高載量。

1.3 P16蛋白表達的檢測 陰道鏡下宮頸活檢留取病變組織，以3 μm[9]作為本研究的切片厚度標準。參照文獻[10]，采用免疫組化方法檢測P16蛋白的表達，檢測試劑購自羅氏公司(生產(chǎn)批號：ZKSP-10448)。采用顯微攝像計算機(×100)分析蛋白表達情況(排除間質細胞陽性)：P16蛋白主要定位于胞核或胞質中，若染色后呈棕黃色即判定為陽性[11]。參照文獻[8]將染色強度分為4級，其中無染為0，低染為1，中染為2，強染為3；陽性細胞百分率為0%評為0分，<10%評為1分，10%～50%評為2分，51%～80%評為3分，>80%評為4分；蛋白表達評分=染色強度×陽性細胞百分率得分，評分在0～12分之間。按評分進行分級，其中 <4分為(-)， 4～5分為(+)， 6～8分為(++)，9～12分為(+++)。

1.4 隨訪及組織學轉歸判定 分別于確診后6、12、18、24個月進行隨訪觀察，復查薄層液基細胞學、陰道鏡，必要時行子宮頸活檢、子宮頸環(huán)形電切術或行子宮頸錐切手術，并將組織病理學檢查結果作為組織學轉歸結局；未行手術治療者，則于確診后24個月隨訪時再次給予陰道鏡下宮頸多點活檢術，確定其組織學轉歸結局。研究期間以避孕套作為主要避孕方法。病變結局分為病變不進展(含病變消退、病變持續(xù))和病變進展， 其中沒有發(fā)現(xiàn)CIN病變存在或存在類型較前輕微者判定為病變消退，CINⅠ病變未發(fā)生改變者判定為病變持續(xù)，發(fā)現(xiàn)宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅱ級(cervical intraepithelial neoplasia grade Ⅱ,CINⅡ)及以上病變者判定為病變進展。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，趨勢分析采用趨勢χ2檢驗；采用Spearman等級相關分析評估指標間的相關性；采用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線評價相關指標的診斷效能。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 CINⅠ患者病變組織中高危型HPV載量與P16蛋白表達情況及兩者的關系 118例蒙古族CINⅠ患者中，47例(39.83%)P16蛋白陽性，其中(+)30例(25.42%)，(++)9例(7.63%)，(+++)8例(6.78%)，見圖1。高危型HPV 陽性率為70.34%(83/118)，主要集中于中低載量組及中高載量組，見表1。CINⅠ患者病變組織P16蛋白表達分級與HPV載量呈正相關(rs=0.569，P=0.014)。

P16蛋白(+) P16蛋白(++) P16蛋白(+++)

表1 118例CINⅠ患者病變組織中高危型HPV載量與P16蛋白表達情況

2.2 CINIⅠ患者高危型HPV載量和P16蛋白表達分級與組織學轉歸的關系 118例患者均按時完成隨訪，共有14例患者病情發(fā)生進展，104例病情未發(fā)生進展的患者中，病變自然消退68例，病變持續(xù)36例。其中，共5例進展為宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅲ級(cervical intraepithelial neoplasia grade Ⅲ,CINⅢ)，于隨訪至第12個月、18個月分別發(fā)現(xiàn)1例、4例，已行手術治療；共9例進展為CINⅡ，其中隨訪至第18個月時發(fā)現(xiàn)3例并給予子宮頸環(huán)形電切術或子宮頸錐形切除術，隨訪至第12、24個月時分別發(fā)現(xiàn)5例、1例，因患者對手術治療持質疑態(tài)度，表示仍要繼續(xù)隨訪，遵循患者意見繼續(xù)隨訪觀察。隨著P16蛋白表達分級升高和HPV載量增加，CINⅠ患者病變進展率有增高的趨勢(均P<0.05)，見表2及表3。

表2 不同組織學轉歸蒙古族CINⅠ患者的高危型HPV載量的比較情況(n)

表3 不同組織學轉歸蒙古族CINⅠ患者的P16蛋白表達分級的比較情況(n)

2.3 高危型HPV載量和P16蛋白表達評分預測蒙古族CINⅠ病變進展的效能 以病理結果作為金標準，以P16蛋白表達評分≥4分、≥6分、≥9分，以及高危型HPV載量≥1 RLU/CO、≥10 RLU/CO、≥100 RLU/CO作為診斷界值，分析P16蛋白表達評分和高危型HPV載量單獨或聯(lián)合預測蒙古族CINⅠ患者病變進展的效能。結果顯示，P16蛋白表達評分≥6分聯(lián)合高危型HPV載量≥100 RLU/CO的曲線下面積、靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值均較高，見表4。

表4 不同臨界值P16蛋白表達評分和高危型HPV載量單獨或聯(lián)合預測蒙古族CINⅠ患者病變進展的效能

3 討 論

CINⅠ患者病變部位的子宮頸細胞處于不穩(wěn)定狀態(tài),為HPV感染的早期狀態(tài)，可隨病毒感染的不同狀態(tài)發(fā)生細胞學形態(tài)上的改變；因其自然消退率高，細胞學檢查為CINⅠ及以下、細胞學正常伴HPV感染的患者只需藥物治療和隨訪觀察[12]。本組118例蒙古族CINⅠ女性隨訪觀察24個月，共68例病變自然消退，自然消退率為57.63%(68/118)，病變持續(xù)率為30.51%(36/118)。這提示，經(jīng)嚴格隨訪，半數(shù)以上的CINⅠ病例可以達到臨床治愈的效果，但對于病變持續(xù)的患者，給予積極干預對實現(xiàn)有效轉歸很關鍵。

本研究中，蒙古族CINⅠ患者P16蛋白陽性率達39.83%，且P16蛋白表達與HPV病毒載量之間呈正相關(P<0.05)，即在P16蛋白強陽性表達的同時伴隨高危型HPV的高負荷量，這進一步闡明高病毒載量的高危型HPV誘導宿主抑癌基因發(fā)生改變，P16蛋白的異常表達是高危型HPV感染并導致宿主細胞變異的外在表現(xiàn)，其用于預測病變轉歸更值得臨床參考。本研究結果顯示，CINⅠ病變發(fā)生進展的患者主要為P16蛋白(++)、(+++)的患者，以及高危型HPV低載量及以上的患者，隨著P16蛋白表達分級增加或高危型HPV病毒載量增加，CINⅠ患者病變進展率均有升高趨勢(均P<0.05)。由此可見，宮頸病變與高危型HPV載量和P16蛋白陽性均關系密切。以病理結果作為金標準，分析高危型HPV載量和P16蛋白表達評分單獨或聯(lián)合預測病變進展的效能，發(fā)現(xiàn)P16蛋白表達評分≥6分聯(lián)合高危型HPV載量≥100 RLU/CO對疾病進展的預測效能比較高。即在CINⅠ的轉歸預測中，P16蛋白表達評分≥6分聯(lián)合HPV載量≥100 RLU/CO可以對宮頸病變進展起到較好的預測作用。

總之，對于宮頸癌初篩患者，二代雜交捕獲術檢測無創(chuàng)傷，操作簡便，具有高度敏感性、主觀性極小，值得在臨床實踐中推廣和應用。對于組織學確診為CINⅠ的內(nèi)蒙古族患者，采用P16蛋白免疫組化檢查進行分流，特別是針對P16蛋白表達評分≥6分、高危型HPV載量≥100 RLU/CO的患者，應及時及早給予積極臨床干預，有利于預防病變進展。今后將擴大樣本量、豐富樣本類型，進行更加深入的探究，以探尋更加科學、人性化且及時有效的預防篩查方法和策略。