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        四川黑茶活性成分、抗氧化能力及品質(zhì)評價

        2021-09-21 08:16:00朱柏雨羅棵瀕朱永清唐曉波
        食品與機械 2021年8期
        關鍵詞:渥堆咖啡堿兒茶素

        朱柏雨 夏 陳 羅棵瀕 朱永清 唐曉波 陳 建

        (1. 四川省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,四川 成都 610066;2. 四川大學公共衛(wèi)生學院,四川 成都 610044;3. 四川省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所,四川 成都 610066)

        茶葉中富含多種天然活性物質(zhì),包括茶多酚、生物堿、氨基酸和茶色素等[1],其中茶多酚是茶葉中發(fā)揮生物活性的重要物質(zhì)[2]。研究表明,茶多酚具有抗炎[3]、抗癌細胞增殖[4]、抗心血管疾病[5]和抗糖尿病[6]等作用。此外咖啡堿和茶堿等物質(zhì)也是茶葉中重要的呈味物質(zhì)和活性成分,具有強心、促進代謝[7]、利尿[8]、助消化[9]等功效。黑茶主產(chǎn)于四川、湖南、湖北、云南、廣西等地[10],是由茶樹的鮮葉或成熟的新梢經(jīng)殺青、渥堆、干燥等工藝制成[11],原料一般較為粗老,兒茶素化合物含量通常低于嫩葉[12]。黑茶的渥堆是加工過程中的關鍵工藝,該工藝會發(fā)生氧化還原、美拉德反應等化學變化,這些變化可能促使茶多酚單體相互轉(zhuǎn)化及分解,且不同的渥堆工藝生產(chǎn)的黑茶中茶多酚等功效物質(zhì)可能有巨大差異[1]。曹永等[13]以湖南產(chǎn)區(qū)的天尖茶、茯磚茶和百兩茶,云南的普洱茶以及廣西的六堡茶為原料,考察了不同產(chǎn)區(qū)黑茶的簡單兒茶素(表沒食子兒茶素、兒茶素、表兒茶素)和酯型兒茶素(表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯)含量,結(jié)果顯示天尖、茯磚和百兩茶提取物中兒茶素的總量高于普洱茶和六堡茶,酯型兒茶素含量則以天尖茶和百兩茶占優(yōu)。王斌等[14]分析了26種安化黑茶水溶性成分,并與干燥未加工的茶葉及新鮮茶葉作對比。結(jié)果表明,26種安化黑茶的沒食子酸、沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、咖啡堿、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯、沒食子兒茶素沒食子酸酯、兒茶素沒食子酸酯含量差異較大,與新鮮茶葉對比后發(fā)現(xiàn)除了咖啡堿外,其他化合物的含量均存在顯著下降的情況,部分物質(zhì)下降至1/20以下。劉婷婷等[15]研究發(fā)現(xiàn)黑茶在發(fā)酵過程中,其主要品質(zhì)成分及生物酶活性均存在顯著變化。隨著黑茶發(fā)酵程度的不斷加深,茶多酚、兒茶素、茶褐素、纖維素、原果膠、蛋白質(zhì)、氨基酸、可溶性糖含量均在渥堆工藝中下降,其含量降幅分別為69.2%,43.7%,52.4%,9.6%,60.0%,62.3%,66.2%,37.2%,多酚氧化酶、過氧化物酶、纖維素酶、果膠酶活性分別提高了246%,371%,371%,223%,咖啡堿含量則無顯著變化。

        四川黑茶歷史悠久,早在乾隆年間就分為“南路邊茶”和“西路邊茶”,但目前關于四川黑茶中茶多酚和黃酮及功效的研究較少,同時對于市售四川黑茶的品質(zhì)評價也未見報道。因此研究擬對26種市售四川黑茶產(chǎn)品進行茶多酚和咖啡堿含量分析,通過自由基清除試驗評價其抗氧化能力,并以相關性及主成分分析對市售26種四川黑茶(S1~S26)進行品質(zhì)評價,以期為四川黑茶研發(fā)、生產(chǎn)和質(zhì)量控制提供基礎依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        26種黑茶:四川市售;

        沒食子酸(GA)、沒食子兒茶素(GC)、兒茶素(C)、表沒食子兒茶素(EGC)、表兒茶素(EC)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、兒茶素沒食子酸酯(CG)標準品:北京索萊寶科技有限公司;

        表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)標準品:上海源葉生物科技有限公司;

        咖啡堿(CAF)標準品:成都普菲德生物技術有限公司;

        甲醇、乙腈:色譜純,美國MREDA公司;

        甲酸、福林酚、蘆丁、水溶性維生素E、過硫酸鉀、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH):分析純,成都市科龍化工試劑廠;

        試驗用水為超純水。

        1.2 儀器與設備

        高速萬能粉碎機:FW-100型,北京科偉永興儀器有限公司;

        數(shù)控超聲波清洗器:KH2200DE型,昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;

        臺式低速離心機:TD-4Z型,四川蜀科儀器有限公司;

        酶標儀:ELX-800型,美國伯騰儀器有限公司;

        高效液相色譜儀:1290型,美國Agilent公司;

        優(yōu)普系列超純水機:UPC-1-10T型,成都超純科技有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 黑茶多酚單體及生物堿含量分析

        (1) 對照品的制備:單體酚與咖啡堿對照品20.0 mg,以甲醇溶解定容至5 mL,以二倍稀釋法制備不同濃度的對照品溶液,冷藏備用。

        (2) 樣品的制備:將供試樣品粉碎過篩,精密稱取供試黑茶1.000 0 g于錐形瓶中,加入80%甲醇8 mL,40 ℃超聲30 min后離心,收集上清液至25 mL容量瓶,殘渣再以同樣方法重復提取2次,合并3次提取液,定容備用。

        (3) 色譜條件:采用梯度洗脫,Eclipse Plus C18柱(2.1 mm×50 mm,1.8 μm);檢測波長280 nm;柱溫35 ℃;流速0.3 mL/min;進樣量1 μL;流動相A為1%甲酸—水溶液,B為乙腈,洗脫條件:0~2 min,5%~10% B;2~10 min,10%~20% B;10~15 min,20%~40% B;15~17 min,40%~70% B;17~20 min,70%~95% B。

        (4) 多酚單體及生物堿含量計算:經(jīng)HPLC分析后,根據(jù)供試品各化合物峰面積及標準曲線按式(1)計算含量。

        (1)

        式中:

        W——含量,mg/g;

        C——樣品質(zhì)量濃度,μg/mL;

        D——稀釋倍數(shù);

        V——樣品體積,mL;

        m——樣品質(zhì)量,g。

        1.3.2 總多酚(TPC)含量分析 采用福林酚法[16],按式(1)計算TPC含量(以沒食子酸當量計)。

        1.3.3 總黃酮(TFC)含量分析 參照宋瑩等[17]的方法,并按式(1)計算TFC含量(以蘆丁當量計)。

        1.3.4 抗氧化活性分析

        (1) ABTS自由基清除能力:參照夏陳等[18]的方法,以水溶性維生素E為橫坐標,吸光值為縱坐標繪制標準曲線,據(jù)標準曲線計算ABTS自由基清除力。

        (2) DPPH自由基清除能力:參照鄧俊琳等[19]的方法,以水溶性維生素E為橫坐標,吸光值為縱坐標繪制標準曲線,據(jù)標準曲線計算DPPH自由基清除力。

        1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

        所有數(shù)據(jù)均為3次重復取平均值,使用Microsoft Excel 2016進行數(shù)據(jù)整理并通過SPSS 20.0采用Turkey方法對數(shù)據(jù)進行分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 四川黑茶活性成分含量

        對照品和樣品的HPLC圖譜如圖1和圖2所示。由圖1可知,10個對照品在20 min內(nèi)均得到較好的分離且峰形較好,26個樣品色譜圖中的10個目標物的保留時間與對照品色譜圖一致。

        1. GA 2. GC 3. ECG 4. EC 5. EGCG 6. ECG 7. CG 8. C 9. EGC 10. CAF

        圖2 樣品HPLC圖譜

        以各對照品濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標制圖得標準曲線回歸方程如表1所示,10個目標物的回歸方程R2在0.998 7~0.999 9,表明各回歸方程在其線性范圍內(nèi)線性關系良好,可以用于各物質(zhì)含量計算。

        表1 回歸方程及線性范圍

        2.1.1 GA含量 由表2可知,26個黑茶樣品中GA含量差異較大,其中S21的GA含量顯著高于其他樣品(P<0.05),而S11的GA含量最低。已有研究[20]表明,綠茶中GA含量大多低于1.00 mg/g,試驗的26個樣品中有25個樣品的GA含量高于1.00 mg/g,表明茶葉經(jīng)過發(fā)酵、渥堆、干燥等加工后能夠顯著提高GA含量,可能是在發(fā)酵等加工過程中的酯化兒茶素經(jīng)過微生物作用、酶轉(zhuǎn)化以及美拉德反應的共同作用下降解形成GA等物質(zhì)[21]。

        表2 四川黑茶GA含量?

        2.1.2 GC、GCG、C、EGCG、ECG含量 26個樣品中GC、GCG、C、EGCG、EGC 5個多酚單體含量差異較大(表3)。與綠茶[22]相比,黑茶的GC和GCG含量均相對較高,但C、EGCG和EGC含量則遠低于綠茶。黑茶在渥堆及干燥過程中由于溫度升高使GC和GCG含量升高,而C、EGCG和EGC的含量下降。有研究[23-24]表明,兒茶素類化合物會發(fā)生個體異構(gòu)化,尤其是在較高的溫度下更明顯。隨著溫度的升高,部分兒茶素類化合物的含量減少,而其異構(gòu)體含量增加,部分兒茶素類化合物從上位結(jié)構(gòu)(EGC和EGCG)變化為非上位結(jié)構(gòu)(GC和GCG)[25]。因此四川黑茶C、EGCG、EGC含量較綠茶有所下降,而GC、GCG的含量升高。

        表3 四川黑茶GC、GCG、C、EGCG、ECG含量?

        2.1.3 EC、ECG、CG、CAF含量 已有研究[20]表明,綠茶中EC含量在0.64~10.20 mg/g,ECG含量在2.18~13.40 mg/g。由表4可知,26個黑茶樣品中的EC和ECG含量均低于綠茶,是由于黑茶在制作中需經(jīng)過渥堆、發(fā)酵等工藝步驟,在氧化酶類(多酚氧化酶、過氧化物酶等)的作用下黑茶中幾乎所有簡單兒茶素(C、EC、EGC)和酯兒茶素(ECG、EGCG)含量顯著降低,從而形成黑茶獨有的顏色、風味和香氣[26]。與其他單體酚相比,26個樣品中的CG含量均處于較低的水平,而且各樣品間的CG含量差異較大。所有供試品中咖啡堿含量占10種化合物總量24.50%以上且與綠茶[22]相比差異不大,表明咖啡堿性質(zhì)穩(wěn)定,在黑茶加工過程中不易受溫度、發(fā)酵及氧化影響[27]。

        表4 四川黑茶EGC、CAF、EC、CG含量?

        2.2 黑茶總多酚含量

        通過福林酚法,以沒食子酸濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標,制圖得總多酚標準曲線:y=0.001 8x+0.042 6,線性范圍2.34~300.00 μg/mL,其R2=0.999 1,表明在該范圍內(nèi),線性關系良好,可用于總多酚含量計算。

        黑茶中含有大量的多酚類化合物,主要以游離或結(jié)合的方式存在,其能夠發(fā)揮降血脂、防止血栓和動脈硬化的形成。由表5可知,26個黑茶樣品中的總多酚含量差異較大,其中S23總多酚含量為S11總多酚含量的10倍以上。多酚是一類在同一個苯環(huán)上有多個酚羥基取代的芳香羧酸類化合物,由于其含有多個酚羥基取代,因而結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定[28],在一定的光照、水分、溫度、酶及酸堿條件下易發(fā)生開環(huán)反應而使其降解或異構(gòu)化[29]。黑茶的渥堆、發(fā)酵等工藝實際上是一個氧化還原過程,因而不同生產(chǎn)廠家、不同工藝條件的黑茶樣品的總多酚含量不盡相同。

        表5 四川黑茶總多酚含量?

        2.3 黑茶總黃酮含量

        總黃酮的標準曲線為y=0.001x+0.051 7,線性范圍0.98~500.00 μg/mL,其R2=0.999 1,表明在該范圍內(nèi),線性關系良好,可用于總黃酮含量計算。

        由表6可知,26個四川黑茶樣品的總黃酮含量差異較小,維持在相對穩(wěn)定的水平內(nèi)。有研究[30]表明,黃酮類化合物在50 ℃以下、光照、弱酸及中性條件下均保持良好的穩(wěn)定性。黑茶在渥堆過程中,其溫度多在45 ℃以下[31],因而能夠保證黃酮類化合物不被降解,而黃酮類化合物含量差異可能是由其原料差異所致。

        表6 四川黑茶總黃酮含量?

        2.4 抗氧化活性

        2.4.1 ABTS自由基清除能力 以水溶性維生素E的質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標,吸光值為縱坐標,制圖得標準曲線回歸方程:y=-0.006x+0.473 5,線性范圍1.48~47.50 μg/mL,其R2=0.997 5,表明在該范圍內(nèi),線性關系良好,可用于四川黑茶ABTS自由基清除計算。

        由表7可知,26個樣品的ABTS自由基清除能力差異較大。相關性分析結(jié)果表明,ABTS自由基清除能力與GA、GC、CAF以及TPC、TFC含量存在一定的相關性(表9),由于黑茶的渥堆、發(fā)酵等加工過程中的美拉德反應及氧化還原反應對這些活性物質(zhì)的含量均存在較大的影響,因此不同樣品間ABTS自由基清除能力的差異也可能是由加工工藝不同所致。

        表7 四川黑茶對ABTS自由基清除能力?

        2.4.2 DPPH自由基清除能力 以水溶性維生素E的質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標,吸光值為縱坐標,制圖得到DPPH自由基清除回歸方程為y=0.942 8x-0.420 2,線性范圍:13.00~104.00 μg/mL,其R2=0.997 0,表明在該范圍內(nèi),線性關系良好,可用于四川黑茶DPPH自由基清除計算。

        由表8可知,26個樣品的DPPH自由基清除能力差異較大,顯著性分析結(jié)果表明黑茶的DPPH自由基清除能力與單體酚、CAF、TPC和TFC含量均存在顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)的正相關(表9),而黑茶的制作工藝同樣會對這些物質(zhì)的含量產(chǎn)生較大的影響,從而導致樣品間DPPH自由基的清除能力不盡相同。

        表8 四川黑茶對DPPH自由基清除能力?

        2.5 相關性分析

        如表9所示,簡單兒茶素(C、EC、EGC)和酯兒茶素(EGC、GCG、EGCG)之間均存在顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)的相關性。四川黑茶樣品的DPPH自由基清除能力與GA和EGCG含量呈顯著正相關(P<0.05),與其他單體化合物、總多酚及總黃酮含量呈極顯著正相關(P<0.01)。ABTS自由基的清除能力與GA、GC和CAF含量呈極顯著正相關(P<0.01),與其他單體化合物無顯著的相關性,表明抗氧化活性與多酚的含量以及種類有關。

        表9 四川黑茶中單體酚、咖啡堿、總多酚、總黃酮和抗氧化活性的相關性?

        2.6 主成分分析及綜合評價

        對26個四川黑茶樣品的9個單體酚、CAF、TPC和TFC含量共計12個成分利用SPSS進行主成分分析(PCA),結(jié)果見表10。經(jīng)分析提取EGCG、C、TPC 3個主成分進行四川黑茶樣品最終的綜合評價(表11)。結(jié)果顯示S16、S23、S19 3個四川黑茶的綜合得分分別為7.44,6.66,3.85。因此當以EGCG、C、TPC 3個成分作綜合評價,S16、S23、S19 3個四川黑茶更為優(yōu)質(zhì)。

        表10 四川黑茶的單體酚、咖啡堿、總多酚和總黃酮的主成分分析結(jié)果

        表11 四川黑茶綜合評價得分及排名

        3 結(jié)論

        殺青、渥堆、干燥等過程中,四川黑茶的簡單兒茶素、酯兒茶素以及總多酚含量均存在顯著降低的現(xiàn)象,而總黃酮、咖啡堿的含量變化較小,與前人[14]對其他產(chǎn)區(qū)黑茶的分析結(jié)果相近。此外研究發(fā)現(xiàn)四川產(chǎn)區(qū)內(nèi)的黑茶活性成分含量差異較大,產(chǎn)品品質(zhì)參差不齊,可能是由于黑茶產(chǎn)品的生產(chǎn)原料、生產(chǎn)工藝及貯藏條件等多種因素導致,這也從側(cè)面反映四川黑茶的生產(chǎn)工藝及質(zhì)量標準不統(tǒng)一。研究僅對四川市售的26個黑茶進行了活性成分及抗氧化能力分析,并未結(jié)合其生產(chǎn)工藝,因此有必要將黑茶品質(zhì)與其生產(chǎn)工藝相結(jié)合進行深入研究,建立黑茶生產(chǎn)從原料到最終產(chǎn)品的規(guī)范化標準。

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