趙欣,王麗,馬靜,成志平△,寶山,那松巴乙拉
(1包頭市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心,內(nèi)蒙古 包頭;2內(nèi)蒙古自治區(qū)國際蒙醫(yī)醫(yī)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特)
別木圖-9丸具有清肝熱功能,用于受損性肝熱,肝血熱盛,黃疸,肝“寶日”病,“寶日巴達(dá)干”病。紅花是一種可活血化瘀、散瘀止痛的藥物,是一種菊科植物,其拉丁學(xué)名為Carthamus tinctorius L.[1]。該種藥物中含有一種羥基紅花黃色素A的物質(zhì),其可通過激活BKCa通道,從而起到抑制L型Ca通道的作用,以此誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生血管舒張[2];而且還可以有效治療機(jī)體的心肌缺血再灌注損傷、缺血性腦灌注等,有研究指出其機(jī)理可能與其抑制JAK2/STAT1通路有關(guān),而且該種物質(zhì)還是活血化瘀的主要有效成分[3,4]。除此之外,也具有抗炎、抗氧化等作用,有研究發(fā)現(xiàn),其可通過對(duì)MAPK、TNFR1/NF-κB等信號(hào)通路進(jìn)行有效地抑制,從而發(fā)揮降低細(xì)胞炎性反應(yīng)因子水平的作用[5-7],是紅花發(fā)揮藥效的重要成分。故建立合理有效的測(cè)定方法對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行控制具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。本研究中采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)測(cè)定別木圖-9丸紅花中紅花羥基黃色素A的含量。
島津LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司);色譜柱:島津C18柱(250×4.6mm 5μm)、Phenomenex C18柱(250mm×4.6mm 5μm);Thermo Accliam C18:250mm×4.6mm,5μm(美 國Thermo公 司);Sartorius BP 211D十萬分之一電子分析天平(德國賽多利斯公司);Sartorius AL 204-IC 萬分之一電子分析天平(德國賽多利斯公司);KQ-500DE數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。
羥基紅花黃色素A對(duì)照品(111637-201810),純度:93.1%,購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇為色譜純(Fisher Scientific),水為超純水;別木圖-9丸為內(nèi)蒙古自治區(qū)國際蒙醫(yī)醫(yī)院蒙藥制劑中心生產(chǎn),批號(hào)分別為20190932、20190927、20191216,規(guī)格:2g/10丸。
本研究中的填充劑選用十八烷基硅烷鍵合硅膠,其流動(dòng)相為甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液(26∶2∶72);流速、檢測(cè)波長、柱溫分別為1ml/min、403nm、30℃。根據(jù)羥基紅花黃色素A峰來計(jì)算其理論板數(shù),其應(yīng)不低于5000。
2.2.1 對(duì)照品溶液的制備
準(zhǔn)確稱量并測(cè)定適量羥基紅花黃色素A作為對(duì)照品,加入25%甲醇,制備含0.05mg/ml的溶液。
2.2.2 供試品溶液的制備
取本品適量,研細(xì),取約2g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,準(zhǔn)確稱量并吸取25%甲醇50ml加入,密塞后稱定重量,超聲處理(功率300 W,頻率40 kHz)30 min,取出,放冷,并再次稱量,用25%甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。
準(zhǔn)確稱量并吸取對(duì)照品10μl、供試品10μl,分別注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。
按本品處方方法制備不含紅花的陰性樣品,按供試品溶液制備方法制備不含紅花的陰性對(duì)照溶液(缺紅花),按上述色譜條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,陰性樣品不會(huì)對(duì)羥基紅花黃色素A的測(cè)定產(chǎn)生干擾。
準(zhǔn)確稱量2.48mg的羥基紅花黃色素A對(duì)照品,放入50ml容量瓶中,加25%甲醇使其溶解,稀釋至刻度處,搖晃并使其均勻,作為對(duì)照品溶液。準(zhǔn)確稱量并分別吸取1、3、5、10、15、20μl,注入液相色譜儀,按上述色譜條件測(cè)定,以峰面積對(duì)進(jìn)樣量進(jìn)行回歸分析,回歸方程:羥基紅花黃色素A:Y=3396871.7X-25821.89(R2=0.9998)。結(jié)果表明羥基紅花黃色素A在0.0497-0.994ng范圍內(nèi)分別呈良好的線性關(guān)系。
準(zhǔn)確稱量后 取6份(2g/份)同一批號(hào)(批 號(hào):20190932)的供試品,分別按上述供試品溶液的制備和色譜條件進(jìn)行測(cè)定,照高效液相色譜法(《中國藥典》2015年版四部通則0512),在403nm波長處測(cè)定峰面積,按外標(biāo)峰面積計(jì)算。測(cè)定每份樣品的含量。進(jìn)樣量各10μl。其RSD為1.44% (n=6),表明該方法重復(fù)性良好。
取同一份供試品(批號(hào)20190932)溶液,按上述色譜條件,分別在0h、2h、4h、12h、24h進(jìn)行測(cè)定,記錄峰面積。24h的RSD 為0.04% (n=6)。從數(shù)據(jù)中可見,羥基紅花黃色素A在24h內(nèi)的面積積分值基本穩(wěn)定不變。
加樣回收率實(shí)驗(yàn):準(zhǔn)確稱量后取6份(1g/份)同一批號(hào)(批號(hào):20190932)的供試品,置具塞錐形瓶中,分別加入對(duì)照品溶液50ml(其中羥基紅花黃色素A濃度為0.029mg/ml),按2.2.2及2.1進(jìn)行測(cè)定,準(zhǔn)確記錄色譜圖,并對(duì)回收率進(jìn)行計(jì)算,平均回收率為98.95%,其RSD為0.74%。
結(jié)果見表1。
表1 不同色譜柱的耐用試驗(yàn)
依據(jù)建立的羥基紅花黃色素A含量測(cè)定方法,對(duì)3批次別木圖-9丸中的羥基紅花黃色素A含量進(jìn)行考察,其羥基紅花黃色素A含量分別為1.44、1.81、1.74mg/g。
參照《中國藥典》(2015年版),其中使用甲醇作為提取溶劑,同時(shí)與25%甲醇作溶劑進(jìn)行提取效率考察,結(jié)果25%甲醇作溶劑,測(cè)得含量高于甲醇提出量,且干擾成分少,由于試驗(yàn)樣品的分離效果良好,所以確定了25%甲醇作為提取溶媒。
《中國藥典》(2015年版)中“紅花”的超聲提取方法比較成熟,因此選擇超聲波提取,時(shí)間為30min。
根據(jù)《中國藥典》(2015年版),采用甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液(26:2:72)作為流動(dòng)相,結(jié)果分離效果好、保留時(shí)間適中,故確定為甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液(26:2:72)為流動(dòng)相。
在實(shí)驗(yàn)中,筆者比較了30℃和40℃的柱溫,雖然保持時(shí)間略有不同,但是分離度和理論板數(shù)沒有變化,因此本研究使用了30℃的柱溫。
本研究使用二極管陣列檢測(cè)器掃描了200-800nm范圍內(nèi)的羥基紅花黃色素A的光譜。結(jié)果表明,羥基紅花黃色素A在401nm處具有吸收峰。根據(jù)《中國藥典》(2015年版)中紅花的含量測(cè)定方法,選擇403nm作為檢測(cè)波長。
按原處方比例,本實(shí)驗(yàn)室自制的別木圖-9丸模擬樣每g含有羥基紅花黃色素A2.535-0.063mg/50ml,以模擬樣藥材為原料制成的批號(hào)為20190932的別木圖-9丸中羥基紅花黃色素A含量為1.663mg/g,轉(zhuǎn)移率為77.33 %。《中國藥典》2015年版一部要求紅花中羥基紅花黃色素A的含量不得低于1.00%,按此含量、處方量及轉(zhuǎn)移率計(jì)算,別木圖-9丸中應(yīng)含有羥基紅花黃色素A1.286 mg/g。參考以上測(cè)定結(jié)果、回收率、生產(chǎn)工藝及批間差異,擬規(guī)定別木圖-9丸紅花中羥基紅花黃色素A(C27H32O16)計(jì),不得少于0.90 mg/g。
綜上所述,本文建立了蒙藥別木圖-9丸紅花中羥基紅花黃色素A的含量測(cè)定方法,該方法科學(xué)、簡(jiǎn)便、專屬性較強(qiáng),為促進(jìn)蒙藥標(biāo)準(zhǔn)化、提高蒙藥發(fā)展水平具有一定的積極意義[8]。