陳 忱

北大荒完達(dá)山乳業(yè)股份有限公司質(zhì)檢中心，黑龍江哈爾濱 150000

0 引言

目前，國家對于嬰幼兒配方乳粉（簡稱“嬰配粉”）的監(jiān)管日益嚴(yán)格[1]，尤其對于葉黃素這類極易降解、添加的營養(yǎng)強(qiáng)化物質(zhì)含量，抽檢頻次要求更為頻繁[2，3]。對于不同的檢測方法，在其檢測過程中總會引入A類不確定度和B類不確定度，A類不確定度主要來源是測量重復(fù)性相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel Xrep()和多次測量試樣質(zhì)量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel m2()。而B類不確定度則包含的比較廣泛，主要包括工作曲線相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel X()，稱量相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel m1()，樣品定容體積,的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel V()，標(biāo)準(zhǔn)溶液相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel I()等。本文則是針對《GB5009.248—2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中葉黃素的測定》方法，對檢測過程中可能出現(xiàn)不確定的過程進(jìn)行數(shù)學(xué)建模[4]，最終獲得嬰配粉中葉黃素含量的不確定度[5]，為檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性提供更加詳實的基礎(chǔ)。

1 原理與方法流程

1.1 方法原理

脂肪含量高（脂肪含量以干基計，不低于3.0%）的食品經(jīng)氫氧化鉀溶液室溫皂化使葉黃素游離后，再以乙醚-正己烷-環(huán)己烷（40∶40∶20，體積比）提取，液相色譜法分離，紫外檢測器或二極管陣列檢測器檢測，外標(biāo)法定量[6]。樣品在提取與分析過程中，反式結(jié)構(gòu)的葉黃素可能發(fā)生異構(gòu)化，轉(zhuǎn)化為順式葉黃素。對于轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的順式葉黃素，可通過保留時間定性、峰面積加合定量。

1.2 操作步驟

準(zhǔn)確稱取2 g（精確至0.01 g）均勻試樣于50.000 mL聚丙烯離心管中，加入約0.2 g二丁基羥基甲苯（BHT）和10.000 mL乙醇，混勻，加入10.000 mL10.0%氫氧化鉀溶液，渦旋振蕩1 min混勻，室溫避光振蕩皂化30 min，以10.000 mL萃取溶劑避光渦旋振蕩提取3 min，4500 r/min離心3 min，重復(fù)提取2 次。合并提取液，以10.000 mL水洗滌，4500 r/min離心3 min分層，重復(fù)洗滌1 次，合并有機(jī)相于室溫減壓濃縮至近干，以0.1% BHT 乙醇溶液渦旋振蕩溶解殘渣并定容至5.000 mL，過0.45 μm 濾膜，供液相色譜測定。

液態(tài)奶：準(zhǔn)確稱取10 g（精確至0.01 g）樣品于50.000 mL聚丙烯離心管中，加入約0.2 g BHT和10.000 mL乙醇，混勻，加入2.000 mL20.0%的氫氧化鉀溶液，渦動1 min混勻，室溫避光振蕩皂化30 min，以10.000 mL萃取溶劑避光渦旋振蕩提取3 min，4500 r/min離心3 min，重復(fù)提取2 次。合并提取液，以10.000 mL水洗滌，4500 r/min離心3 min分層，重復(fù)洗滌1 次，合并有機(jī)相于室溫減壓濃縮至近干，以0.1%BHT乙醇溶液渦旋振蕩溶解殘渣并定容至25.000 mL，過0.45 μm 濾膜，供液相色譜測定。在操作過程中，需要注意的是，由于葉黃素對光敏感，除非另行說明，所有試驗操作應(yīng)在無500 nm以下紫外光的黃色光源或紅色光源環(huán)境中進(jìn)行。

2 數(shù)學(xué)模型

試樣中葉黃素的含量按下式計算：

式中：X 為試樣中葉黃素的含量，單位為μg/100 g；c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線而得的樣液中標(biāo)準(zhǔn)品的含量，單位為μg/mL；V為樣品最終定容體積，單位為mL；m為稱樣量，單位為g；F為校正系數(shù)。

可通過以下方式獲得：用液相色譜分析試樣溶液，將順式與反式葉黃素色譜峰面積加合作為總峰面積，其中反式葉黃素峰面積除以總峰面積所得值為校正系數(shù)。計算結(jié)果保留3 位有效數(shù)字。

3 各量值及其不確定度評定

公式1中的各量值見表1。

表1 量值及其不確定度

用液相色譜法測定濃度，為了校準(zhǔn)液相色譜儀器，采用葉黃素標(biāo)準(zhǔn)儲備液濃度為20.8575 μg/mL 配制6 種標(biāo)準(zhǔn)溶液，其濃度分別為0.3337 μg/mL、0.6674 μg/mL、1.3349 μg/mL、2.0023 μg/mL、2.6698 μg/mL、3.3372 μg/mL。用液相色譜法對6 種濃度溶液進(jìn)行含量測定，每個濃度測定3 次，結(jié)果見表2。

表2 各濃度下測量葉黃素含量量值

3.1 濃度的不確定度

濃度的不確定度有兩部分構(gòu)成，一是由于6 種濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液擬合的線性方程求得的濃度時測量產(chǎn)生的不確定度；二是由標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制成6 種濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液時所產(chǎn)生對濃度的測量帶來的不確定度。

3.1.1 濃度的線性方程引起的不確定度

根據(jù)表1，數(shù)據(jù)擬合得到如下線性方程：y=0.7108x+0.0180，其中x為溶液含量，y為峰面積比，對一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行2 次重復(fù)測量，通過線性方程求得待測樣品x=1.6426 μg/mL，則x的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為[7]：

式中，n=18（n為標(biāo)準(zhǔn)系列點數(shù)6，重復(fù)次數(shù)3 次）；P 為待測樣品的重復(fù)測定次數(shù)，P=2；X為待測樣品濃度的平均值1.6426 μg/mL（1.6425 μg/mL，1.6427 μg/mL）；C0為標(biāo)準(zhǔn)系列各點濃度的平均值1.7242 μg/mL）；C0i為各標(biāo)準(zhǔn)液濃度；b為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率0.7108；a為截距0.0180；yi為各標(biāo)準(zhǔn)液的面積比。

根據(jù)以上數(shù)據(jù)，由公式6計算得U（x）=0.0181 μg/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.1.2 配標(biāo)準(zhǔn)溶液所產(chǎn)生的不確定度

（1）標(biāo)準(zhǔn)品的稱量引入的不確定度

電子天平準(zhǔn)確稱取1.05 mg葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品，所使用天平精密度為0.01 mg，包含因子因此，天平的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（2）標(biāo)準(zhǔn)品的定容引入的不確定度

配置葉黃素的標(biāo)準(zhǔn)儲備液采用的容量瓶在20 ℃時的體積為50.00 mL，按照《JJG196—2006 常用玻璃量具檢定規(guī)程》的要求，經(jīng)查詢，50.00 mL容量瓶的允差為±0.05 mL，包含因子其標(biāo)準(zhǔn)不確定度Uc（B2）為：

（3）標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程溫度對容量瓶引入的不確定度

配制標(biāo)準(zhǔn)儲備液中采用的容量瓶已在 25 ℃時校準(zhǔn)，而實驗室的溫度也控制在（20±5）℃。由溫度波動引起的不確定度可通過估算溫度范圍和體積膨脹系數(shù)進(jìn)行計算，液體的膨脹系數(shù)遠(yuǎn)高于玻璃的膨脹系數(shù)，所以玻璃的膨脹系數(shù)可忽略。標(biāo)準(zhǔn)工作液是用甲醇配制，甲醇的體積膨脹系數(shù)為0.0012 ℃-1，產(chǎn)生的體積變化為：（5010.0012 ℃-1=0.06 mL，則區(qū)間半寬度a2=0.06 mL設(shè)為均勻分布，包含因子工作液配置過程中用到了6 個10.000 mL容量瓶，（1060.0012 ℃-1=0.072 mL，則區(qū)間半寬度a2=0.072 mL設(shè)為均勻分布，包含因子k=其標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel（B3）為：

（4）標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程移液管引入的不確定度

吸取葉黃素標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋到標(biāo)準(zhǔn)溶液的過程所用為移液管，吸取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液時所選用的1.000 mL（2 次）、2.000 mL（1 次）、5.000 mL（1 次）、10.000 mL（1 次）的移液管來吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0958 μg/mL，0.1915 μg/mL，0.3831 μg/mL，0.7661 μg/mL，1.5323 μg/mL，1.9153 μg/mL。根據(jù) SGCR-3-535 批次胖肚移液管的校正說明書，得到以下規(guī)格移液管的偏差范圍，根據(jù)均勻分布，包含因子移液管量取體積和次數(shù)的不確定度分別見表3、4。

由表3和表4，根據(jù)公式可得：

表3 移液管量取體積的不確定度

表4 移液管量取次數(shù)的不確定度

3.2 質(zhì)量的不確定度

質(zhì)量的不確定度主要有兩個方面，一是所用天平的不確定度，二是多次測量引入的不確定度。天平制造商給出了±0.10 mg 的線性分量，該數(shù)值代表了托盤上被稱量的實際重量與從天平所讀取的數(shù)值的最大差值。線性分量被假設(shè)成矩形分布，換算成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

上述分量必須計算二次，一次作為空盤，另一次為毛重，因為每一次稱重均為獨立的觀測結(jié)果，兩者的線性影響不相關(guān)，因此，由天平引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

稱樣量為2.0000 g，則相對不確定度為：Urel（m1）=0.0816/2103=0.0000408

對樣品重復(fù)測量10 次引入的不確定度為A類分量，區(qū)次測量結(jié)果分別為2.0002 g，2.0005 g，2.0009 g，2.0004 g，2.0005 g，2.0003 g，2.0008 g，2.0007 g，2.0007 g，2.0002 g。

3.3 結(jié)果的不確定度評定

在重復(fù)性條件下，對試樣進(jìn)行了10 次獨立測試值（μg/100 g）：

標(biāo)準(zhǔn)偏差S=0.675 μg/100g，則算術(shù)平均值的不確定度為：

由測量重復(fù)性引入的相對不確定度：

3.4 體積的不確定度評定

樣品定容采用在20 ℃時的5.00 mL吸管，按照《JJG 196—2006 常用玻量具檢定規(guī)程》的要求，經(jīng)查詢，5 mL 吸管的允差為±0.025 mL，包含因子 k=其標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc（v）為：

4 合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度評定

合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel的計算：

5 結(jié)論

擴(kuò)展不確定度評定U c（X）=Urel（X）X=0.012234.3 μg/100g=2.8116 μg/100 g，取置信因子k=2（P約為95.0%）擴(kuò)展不確定度為U擴(kuò)展=kUc（X）=5.62 μg/100g，故當(dāng)多次試驗數(shù)據(jù)的所測樣品中葉黃素結(jié)果為234.30 μg/100g 時，測量結(jié)果為：X=（234.30±5.62）μg/100 g。結(jié)論在葉黃素含量測定過程中，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度引入的相對不確定度是影響測量乳粉重葉黃素含量不確定度的主要因素[8]。