王晨豫，宋 潔，曹夢園，陳明杰，魏 勇，齊亞銀＊

1 石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子 832000

2 新疆天潤乳業(yè)股份有限公司，新疆烏魯木齊 830000

0 引言

牛病毒性腹瀉?。˙ovine Viral Diarrhea，BVD）是由牛病毒性腹瀉病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV）感染牛引起的以出現(xiàn)發(fā)熱、腹瀉、消化道黏膜糜爛、產(chǎn)奶量下降、流產(chǎn)和死胎等為主要臨床癥狀的一類急性、接觸性傳染病，被還是世界動物衛(wèi)生組織列為三類動物疫病[1]。同時，BVDV也是牛呼吸道疾病綜合征（Bovine respiratory disease complex,BRDC，BRDC）重要的病原，能引起奶牛持續(xù)性感染、免疫抑制，長期乃至終生帶毒，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。

新疆奶牛養(yǎng)殖業(yè)從小戶散養(yǎng)及小規(guī)模養(yǎng)殖場逐步向集約化、規(guī)?；哪Ｊ睫D(zhuǎn)型。目前，新疆一些大規(guī)模牧業(yè)公司已經(jīng)制定了統(tǒng)一的管理模式、生產(chǎn)經(jīng)營模式，并根據(jù)不同地區(qū)的環(huán)境，因地制宜地制定了飼養(yǎng)管理、營養(yǎng)調(diào)配、環(huán)境控制等具體方案。通過制定嚴(yán)格的消毒程序和免疫程序，這些牧場的疫病防控與前幾年相比已經(jīng)發(fā)生了翻天覆地的變化。尤其是規(guī)模奶牛場對BVD非常重視，對其采取“免疫-檢疫-淘汰”等一系列的防控措施[3]。

本試驗對南疆阿克蘇市和北疆烏魯木齊市、奎屯市、昌吉市、沙灣縣5 個地區(qū)16 個規(guī)模奶牛場采集全群牛群血清、犢牛耳組織，并采用IDEXX BVDV抗原檢測及RT-PCR復(fù)檢結(jié)合測序等方法，監(jiān)測BVDV在不同奶牛場的感染、流行情況，為實施阻斷傳播途徑、淘汰陽性牛、建立疫病凈化場提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

BVDVELISA抗原檢測試劑盒/血清購自IDEXX公司；PrimeScript? RT Master Mix購自TaKaRa公司；普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、TIANamp Virus RNA Kit購自天根公司；2×Taq Plus Master Mix Ⅱ購自諾唯贊公司；RNA專用氯仿、RNA專用75%乙醇、異丙醇等購自上海生工公司。

1.2 樣品來源

2020年11月至2021年7月，累計對新疆5 個地區(qū)共計16 個規(guī)模奶牛場的新生犢牛7日齡內(nèi)采集2～3 mm耳組織于2 mL離心管中，置于-20 ℃保存。其他牛群全群進(jìn)行尾靜脈采血，置于采血器中析出血清，編號分裝至1.5 mL離心管中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 血清及耳組織抗原檢測

ELISA檢測：從-20 ℃冰箱取出的先前采集的各牛場血清及犢牛耳組織，恢復(fù)至室溫后，犢牛耳組織往離心管中加入200 μL耳組織浸泡緩沖液過夜浸泡。分別按照Bovine viral diarrhoea virus antigen test Kit/Serum Plus（BVDV Ag/Serum）產(chǎn)品說明書對血清中和耳組織BVDV抗原分別進(jìn)行檢測。

BVDV血清抗原檢測試劑盒結(jié)果判定：檢測計算樣品的校正OD值。被檢樣品的S-N值≤0.300，判為BVDV抗原陰性；被檢樣品的S-N值＞0.300，判為BVDV抗原陽性。

BVDV耳組織抗原檢測試劑盒結(jié)果判定：檢測計算樣品的校正OD值。被檢樣品的S-N值≤0.200，判為BVDV抗原陰性；被檢樣品的S-N值＞0.300，判為BVDV抗原陽性。被檢樣品的0.300＞S-N值≥0.200，判為BVDV抗原可疑。

1.4 BVDV 病原RT-PCR 檢測

1.4.1 樣品來源

病原檢測樣本來源于血清學(xué)抗原檢測陽性血清，對陽性牛采集糞便、鼻腔分泌物，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行RT-PCR復(fù)檢。取PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和EB染色后，經(jīng)凝膠成像掃描儀觀察目的片段大小。通過膠回收目的條帶，送檢測序。

1.4.2 引物設(shè)計

根據(jù)張信軍等[4]采用的方法，設(shè)計通用檢測引物（表1），由上海生工合成。

表1 引物序列、位置及大小

1.4.3 RT-PCR擴(kuò)增

按照天根公司的TIANamp Virus RNA Kit說明書方法提取血清中的RNA，根據(jù)TaKaRa公司的cDNA合成試劑盒說明書方法將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件

PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件見表2。

表2 PCR 反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件

反應(yīng)結(jié)束后，取8 μLPCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳和EB染色后，經(jīng)凝膠成像掃描儀觀察目的片段大小。

1.5 序列測定

1.5.1 目的條帶的回收

取無菌的1.5 mL EP管稱量后標(biāo)記，將RT-PCR試驗陽性條帶用刀片全部切下，裝入EP管中稱重。按照普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書進(jìn)行，產(chǎn)物保存于-20℃冰箱中。

1.5.2 T載體連接及轉(zhuǎn)化

將膠回收得到的產(chǎn)物與pMD19-T載體按照pMD19-T載體試劑盒說明書進(jìn)行連接，各組分加至無菌的EP管中，混勻后放在連接儀中16 ℃過夜。將連接產(chǎn)物導(dǎo)入E·coliDH5α。加入預(yù)熱無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，充分混勻，放入37℃恒溫?fù)u床中，復(fù)蘇菌體。涂于含有氨芐青霉素的 LB 瓊脂平板上，放在37℃的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)12 h。

1.5.3 菌液PCR驗證

在平板上挑取單個菌落，接種于含有AMP的LB液體培養(yǎng)基，進(jìn)行PCR驗證，結(jié)果為陽性的菌液，高速離心后，棄液體，留下沉淀，送檢測序。

2 結(jié)果

2.1 試驗?zāi)膛鯞VDV 抗原檢測結(jié)果

牛群血清檢測結(jié)果為：沙灣某奶牛場的血清抗原陽性率為1.63%，烏魯木齊某奶牛場為0.35%，其余奶牛場均為陰性（表3）。犢牛耳組織抗原檢測結(jié)果為：烏魯木齊某奶牛場犢牛耳組織的抗原陽性率為1.17%，其余奶牛場的耳組織檢測均為陰性（表4）。

表3 南北疆部分規(guī)模奶牛場的血清BVDV 抗原檢測結(jié)果

表4 南北疆部分規(guī)模奶牛場的犢牛耳組織BVDV 抗原檢測結(jié)果

2.2 試驗?zāi)膛鯮T-PCR 復(fù)檢結(jié)果

對新疆部分地區(qū)奶牛場的BVDV抗原陽性牛進(jìn)行RT-PCR復(fù)檢，結(jié)果如圖1。共計檢測46 頭牛血清及其對應(yīng)的陽性牛鼻腔棉拭子和陽性牛鼻糞便拭子，復(fù)檢均為陽性。

圖1 病原核酸檢測結(jié)果

2.3 測序結(jié)果

將8 份陽性樣品的測序結(jié)果在NCBI中與BVDV參考株進(jìn)行序列對比，結(jié)果得出陽性樣品屬于BVDV-la型。

3 討論

BVD 對養(yǎng)牛業(yè)的危害巨大，且到目前為止沒有特效藥物用于治療，一直是規(guī)模奶牛場的困擾。李娜等[5]于2009年對新疆石河子地區(qū)進(jìn)行BVDV的分子流行病學(xué)調(diào)查，BVDV抗原陽性率為39.06%，2019年朱廣藝[6]對南疆某規(guī)?；B(yǎng)殖場奶牛進(jìn)行BVDV調(diào)查，抗原陽性率為0.38%。2019—2020年魏勇等[3]對新疆不同區(qū)域部分規(guī)?；皞鹘y(tǒng)奶牛場進(jìn)行BVDV抗原調(diào)查，陽性率為0.79%。本試驗于2020年11月至2021年7月對新疆16 個規(guī)模奶牛場BVDV抗原陽性率為0.16%。結(jié)果顯示，防控BVDV需要采取有效的防控凈化措施，控制與凈化的首要步驟都是及時發(fā)現(xiàn)持續(xù)感染牛。然后，根據(jù)本地本場的牛群密度和感染率來制定防控措施[7]。

首先，要加強(qiáng)奶牛場的消毒防控，制定消毒程序。使用復(fù)方醛類、氫氧化鈉、生石灰對奶牛場圈舍、道路、圈舍周邊的綠化帶等區(qū)域進(jìn)行定期消毒。

其次，要加強(qiáng)免疫。犢牛剛出生后免疫一次哞樂優(yōu)（BVDV-IBR二連滅活疫苗），間隔1 個月后加強(qiáng)免疫1 次。全群在每年4～10月中普免2 次。使用經(jīng)巴氏消毒過的牛初乳來喂養(yǎng)新生犢牛。

第三，定期對奶牛場全群做BVDV抗原檢測。對剛出生1 周齡以內(nèi)的犢牛進(jìn)行耳組織BVDV抗原檢測，若為陽性則暫時隔離飼養(yǎng)，采集鼻拭子、糞便或血清送至實驗室進(jìn)行RTPCR復(fù)檢，如結(jié)果仍為陽性，需將陽性犢牛淘汰。另外，血清陽性率較高的地區(qū)要做好持續(xù)的抗原檢測，做好持續(xù)免疫措施，來淘汰和減少陽性牛，并做好綜合性生物安全保護(hù)體系建設(shè)，維持BVDV的凈化狀態(tài)，避免新發(fā)BVD牛的出現(xiàn)。