郝志曄 盧雯平 錢偉 崔莎莎

摘要 目的：探討三陰方治療晚期三陰性乳腺癌（TNBC）的臨床療效、活性成分及作用機(jī)制。方法：選取2018年3月至2019年10月中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院收治的Ⅳ期TNBC患者52例作為研究對象，均給予三陰方，每日1劑，觀察患者的無進(jìn)展生存期（PFS）和臨床療效。依托中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）檢索并篩選三陰方的有效成分和作用靶標(biāo)，應(yīng)用GeneGards數(shù)據(jù)庫對三陰性乳腺癌靶標(biāo)進(jìn)行檢索進(jìn)而構(gòu)建成分靶點網(wǎng)絡(luò)、構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，并對靶標(biāo)進(jìn)行基因本體（GO）功能富集分析、京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，構(gòu)建靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖。結(jié)果：經(jīng)三陰方治療后，患者的中位PFS為（8.64±1.87）個月，客觀緩解率為34.6%，疾病控制率為82.7%，卡氏評分和FACT-B評分均有改善，療效顯著。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究共篩選出三陰方與三陰性乳腺癌重合靶標(biāo)110個，GO及KEGG富集分析預(yù)測出與疾病相關(guān)的多條作用通路。結(jié)論：三陰方是治療晚期三陰性乳腺癌的有效方劑，可延長患者的PFS，提高臨床療效及生命質(zhì)量。本研究預(yù)測三陰方治療晚期三陰性乳腺癌的主要活性成分為黃酮類及甾醇類化合物，主要調(diào)節(jié)靶標(biāo)是AKT1、MAPK1、RELA，可能通過作用于PI3K-AKT、TNF、p53等信號通路對晚期三陰性乳腺癌起到治療作用。

關(guān)鍵詞 三陰方;治療;晚期;三陰性乳腺癌;臨床療效;藥理學(xué)研究;活性;作用機(jī)制

Clinical Research and Pharmacology Study on Sanyin Decoction in the Treatment of Triple-Negative Breast Cancer

HAO Zhiye，LU Wenping，QIAN Wei，CUI Shasha

（Guanganmen Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100053，China）

Abstract Objective：To explore the clinical effect，active ingredients and action mechanism of Sanyin Decoction in the treatment of advanced triple-negative breast cancer.Methods：A total of 52 cases of stage IV triple-negative breast cancer patients were selected as the research objects and were given Sanyin Decoction，one dose a day.The progress-free survival（PFS） and clinical effect of the patients were observed.Based on TCMSP，we searched and screened the effective components and targets of Sanyin Decoction.The triple-negative breast cancer targets were searched in the GeneGards database and then the component target network and protein interaction（PPI） network were constructed.The target was analyzed by go function enrichment，KEGG pathway enrichment and the target pathway network map was constructed.Results：The median PFS were 8.64±1.87 months，the objective remission rate and the disease control rate were 34.6% and 82.7%，respectively after the treatment with Sanyin Decoction.Both the casabella score and the FACT-B score were improved significantly，showing significant curative effect.A total of 110 overlapping targets of Sanyin Decoction and triple-negative breast cancer were selected by network pharmacology research.Go and KEGG enrichment analysis predicted multiple disease-related pathways.Conclusion：Sanyin Decoction is an effective prescription for the treatment of advanced triple negative breast cancer，which can improve prolong PFS，the clinical efficacy，and improve quality of life in advanced triple-negative breast cancer patients.This study predicts that the main active components of Sanyin Decoction in the treatment of advanced triple-negative breast cancer are mainly flavonoids and sterols，the main regulatory targets are AKT1，MAPK1，RELA，which might be related to PI3K-AKT，TNF，p53 and so on signal pathway and plays a therapeutic role in advanced triple-negative breast cancer.

Keywords Sanyin Decoction; Treatment; Advanced; Triple-negative breast cancer; Clinical efficacy; Pharmacology research; Active ingredients; Action mechanism

中圖分類號：R289.5;R966文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.16.023

乳腺癌是世界上女性最多發(fā)的惡性腫瘤，在全球女性惡性腫瘤中居首位，嚴(yán)重危害女性健康[1]。三陰性乳腺癌（Triple-negative Breast Cancer，TNBC）是乳腺癌分子分型中的一種特殊類型，約占所有乳腺癌的15%，確診后5年生存率明顯低于其他類型乳腺癌患者[2-3]。因其雌激素受體（Estrogen Receptor，ER），孕激素受體（Progesterone Receptor，PR），人表皮生長因子受體（Human Epidermal Growth Factor Receptor 2，HER-2）均不表達(dá)，使此類患者不能從靶向治療及內(nèi)分泌治療中獲益，因此，治療仍以化療為主要手段，且通常復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移發(fā)生較早，TNBC一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，對化療的敏感度顯著降低，中位生存時間縮短至6個月以下[4]，對其他類型乳腺癌治療有效的藥物通常對TNBC無效[5]，尤其是對于晚期患者，臨床上仍需尋找新的治療方法。

中醫(yī)學(xué)在治療乳腺癌方面有一定療效。為進(jìn)一步尋找有效的治療方劑，總結(jié)研究盧雯平教授應(yīng)用三陰方（即逍遙散合理沖湯化裁方）治療晚期TNBC的臨床經(jīng)驗。采用臨床療效觀察和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，驗證該方在臨床上的療效，同時構(gòu)建藥物與TNBC共有的靶點，探討該湯劑治療晚期TNBC的有效成分及分子作用機(jī)制，旨在為中醫(yī)藥治療晚期TNBC的研究提供進(jìn)一步科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年3月至2019年10月中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院收治的Ⅳ期TNBC患者52例作為研究對象，年齡36～75歲，平均年齡（55±12）歲。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《NCCN乳腺癌篩查和診斷臨床實踐指南》[6];中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)參照國家中醫(yī)藥管理局《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》[7]，分為肝郁痰凝、沖任失調(diào)、正虛毒熾三型。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) 1）確診為Ⅳ期乳腺癌的成年女性，有證據(jù)顯示存在不可切除或不能行根治放療的局灶復(fù)發(fā)性病灶或轉(zhuǎn)移病灶，不伴內(nèi)臟危象和其他快速進(jìn)展性疾病。2）組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)免疫組織化學(xué)結(jié)果ER（-），PR（-），HER-2（-）;3）所有患者依據(jù)美國國家癌癥綜合網(wǎng)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）乳腺癌治療指南，接受規(guī)范治療，不伴內(nèi)臟危象和其他快速進(jìn)展性疾病;4）可測量病灶滿足以下條件或僅單純的骨轉(zhuǎn)移病灶：a.對于非淋巴結(jié)，至少一處病灶的最長直徑≥1.0 cm，或者對于淋巴結(jié)，至少一處病灶的短軸直徑≥1.5 cm;如果只有一處靶病灶且為非淋巴結(jié)，則其最長直徑應(yīng)≥1.5 cm;b.接受過外照射放療或局部區(qū)域治療（如射頻消蝕）的病灶，必須顯示出疾病進(jìn)展證據(jù)（根據(jù)實體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)1.1），以作為靶病灶使用;5）ECOG評分0～2分。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 1）疾病晚期、出現(xiàn)癥狀、內(nèi)臟擴(kuò)散、在短期內(nèi)有發(fā)生危及生命的并發(fā)癥者;2）妊娠、哺乳及拒絕采取避孕措施的女性患者;3）預(yù)期壽命小于3個月者。

1.5 脫落與剔除標(biāo)準(zhǔn) 已入組病例但符合以下之一者，應(yīng)剔除：1）誤診;2）符合排除標(biāo)準(zhǔn)者;3）未曾用藥者;4）無任何檢測記錄者;5）由于使用某種禁用的藥物，以致無法評價藥效者。

1.6 治療方法 所有患者依據(jù)美國國家癌癥綜合網(wǎng)乳腺癌治療指南接受規(guī)范治療。在此基礎(chǔ)上患者均給予三陰方（即逍遙散合理沖湯化裁方），基礎(chǔ)方：黃芪30 g、白術(shù)15 g、三棱6 g、莪術(shù)9 g、柴胡12 g、白芍20 g、枸杞子15 g、青蒿15 g、黨參10 g、天花粉10 g、白花蛇舌草15 g。臨床可隨證加減，肝郁痰凝證加薄荷6 g、瓜蔞15 g;沖任失調(diào)證加淫羊藿15 g、巴戟天15 g;正虛毒熾證加蒲公英15 g。根據(jù)轉(zhuǎn)移部位不同加減，骨轉(zhuǎn)移者加威靈仙10 g、杜仲10 g;肝轉(zhuǎn)移者加茵陳6 g、八月札20 g、鱉甲6 g;肺轉(zhuǎn)移者加桔梗9 g、麥冬20 g;腦轉(zhuǎn)移者加菖蒲15 g、全蝎5 g。水煎服，每日1劑，分2次早晚服藥，治療8周。

1.7 觀察指標(biāo) 1）主要觀察指標(biāo)：無進(jìn)展生存期（PFS）和臨床療效。無進(jìn)展生存期（PFS）為從研究藥物的首次給藥時間開始至疾病進(jìn)展時間。2）次要觀察指標(biāo)：卡氏評分、生命質(zhì)量等。對患者基線和治療4、8周后的卡氏評分、乳腺癌生命質(zhì)量測定表（FACT-B）評分進(jìn)行比較。FACT-B評分包括生理、情感、功能狀況、社會/家庭情況和其他問題等5個維度，評分越高說明生命質(zhì)量越好。

1.8 療效判定標(biāo)準(zhǔn) 治療8周后根據(jù)實體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)1.1進(jìn)行療效評估，完全緩解（CR）為病變部位病灶全部消失，且腫瘤標(biāo)志物為正常范圍，至少持續(xù)4周;部分緩解（PR）為病灶最大直徑與垂直橫徑面積縮小50%以上并至少維持4周，其他病灶無增大并無新病灶發(fā)生;疾病穩(wěn)定（SD）為病灶的兩徑乘積縮小50%或者增大程度沒有超過25%，且周圍無新病灶出現(xiàn);疾病進(jìn)展（PD）為病灶直接乘積增大程度>25%，有新病灶的出現(xiàn)。客觀緩解率（ORR）（%）=（CR+PR）例數(shù)/總例數(shù)×100%。疾病控制率（DCR）（%）=（CR+PR+SD）例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多個時點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.10 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法

1.10.1 方藥成分收集與篩選 三陰方中共含11味中藥材，分別以中藥名為關(guān)鍵詞在TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmspsearch.php）中通過口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18篩選藥物活性成分，建立藥物靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫。通過GeneCards數(shù)據(jù)庫（http：//www.genecards.org/）篩選TNBC相關(guān)基因和蛋白靶標(biāo)，建立數(shù)據(jù)集。再通過UniProt數(shù)據(jù)庫將所有靶標(biāo)轉(zhuǎn)化為識別碼格式，并對藥物有效成分靶標(biāo)與TNBC疾病靶標(biāo)取交集，尋找共有靶標(biāo)。

1.10.2 “成分-靶標(biāo)”交互網(wǎng)絡(luò)與PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 為進(jìn)一步研究三陰方中所含活性成分與TNBC靶標(biāo)之間的相互關(guān)系，將搜集到的藥物有效化合物成分、作用靶標(biāo)與TNBC相關(guān)靶標(biāo)信息導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件進(jìn)行可視化分析，并通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析。

1.10.3 GO富集分析 通過R語言Clusterprofiler包對PPI網(wǎng)絡(luò)中的蛋白進(jìn)行基因本體（GO）富集分析，分別進(jìn)行生物過程（Biological Process，BP）、細(xì)胞成分（CC）及分子功能（MF）分析，對基因集合或基因簇進(jìn)行功能聚類的統(tǒng)計分析，根據(jù)富集的相關(guān)靶標(biāo)數(shù)目及統(tǒng)計學(xué)差異繪制GO富集分析氣泡圖。

1.10.4 KEGG通路富集分析 通過R語言Clusterprofiler包對PPI網(wǎng)絡(luò)中的蛋白進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析，得出交互網(wǎng)絡(luò)中的直接作用靶標(biāo)相關(guān)通路，對結(jié)果進(jìn)行功能聚類的統(tǒng)計分析，繪制KEGG富集分析氣泡圖。將得到的通路條目、靶點信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，繪制得到靶點-通路圖。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察結(jié)果

2.1.1 平均PFS 三陰方治療后患者總體的平均PFS為（8.64±1.87）個月。

2.1.2 臨床療效 觀察服藥8周后患者臨床療效。完全緩解2例，部分緩解16例，疾病穩(wěn)定25例，客觀緩解率34.6%，疾病控制率82.7%。

2.1.3 卡氏評分 治療前及治療4周、8周后患者的卡氏評分分別為（88.6±3.1）分、（91.9±2.8）分、（93.6±2.7）分，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.1.4 FACT-B評分 治療前及治療4周、8周后患者的FACT-B評分比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）。見表1。

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果

2.2.1 藥物與疾病的靶標(biāo)篩選 基于數(shù)據(jù)庫構(gòu)建方法，本研究利用TCMSP數(shù)據(jù)庫共篩選得到三陰方11味中藥的136個活性成分及226個不同作用靶標(biāo)。見表2。通過GeneCards數(shù)據(jù)庫共篩選得到TNBC作用靶標(biāo)1 550個。將226個藥物有效成分靶標(biāo)與1 550個TNBC疾病作用靶標(biāo)繪制韋恩圖，得到共110個重合靶標(biāo)。淺藍(lán)色代表TNBC相關(guān)靶標(biāo)，紅色代表三陰方作用靶標(biāo)，重疊部分代表三陰方化學(xué)成分與TNBC交集作用靶標(biāo)。見圖1。

2.2.2 藥物活性成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果 將所篩選出的有效藥物成分與靶標(biāo)信息構(gòu)建“成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)。見圖2。藍(lán)色長方形為藥物作用靶標(biāo)，橙色三角形代表白花蛇舌草成分，綠色三角形代表白芍成分，紫色三角形代表白術(shù)成分，藍(lán)色三角形代表柴胡成分，黃色三角形代表黨參成分，紅色菱形代表枸杞子成分，綠色菱形代表黃芪成分，藍(lán)色菱形代表青蒿成分，黃色菱形代表三棱成分，紅色三角形代表天花粉成分，紫色菱形為多藥共有成分。藥物活性成分中Degree≥10的分別是：槲皮素（Quercetin，MOL000098，值為78）、木犀草素（Luteolin，MOL000006，值為37）、山柰酚（Kaempferol，MOL000422，值為26）、甘氨酸（Glycitein，MOL008400，值為17）、7-甲氧基-2-甲基異黃酮（7-Methoxy-2-methyl isoflavone，MOL003896，值為15）、芒柄花黃素（Formononetin，MOL000392，值為15）、異鼠李素（Isorhamnetin，MOL000354，值為15）、7-O-甲基異戊烯醇（7-O-methylisomucronulatol，MOL000378，值為14）、卡氏菌素（Calycosin，MOL000417，值為14）、蒿黃素（Artemetin，MOL005229，值為12）、芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷（6，8-di-c-glucosylapigenin_qt，MOL007423，值為11）、β-谷甾醇（Beta-sitosterol，MOL000358，值為10）、牡荊素（Vitexin_qt，MOL007404，值為10）。

2.2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用String在線數(shù)據(jù)庫對靶標(biāo)蛋白進(jìn)行PPI分析，構(gòu)建了三陰方和TNBC潛在靶標(biāo)的PPI網(wǎng)絡(luò)（圖3，互作分?jǐn)?shù)≥0.4），圖中含有107個靶蛋白和2 108條相互作用邊。

2.2.4 GO分析 分別對靶標(biāo)蛋白進(jìn)行BP、CC、MF富集分析，保留P≤0.01的結(jié)果，并分別對前20個條目進(jìn)行可視化分析，得到柱狀圖。見圖4～6。縱坐標(biāo)表示富集條目，橫坐標(biāo)表示基因所占比例，圖中圓形面積越大代表富集基因數(shù)目越多，顏色越紅代表富集程度越顯著。圖4所示，主要BP富集條目如：氧化應(yīng)激反應(yīng)（Response to Oxidative Stress）、對金屬離子的反應(yīng)（Response to Metal Ion）、對類固醇激素的反應(yīng)（Response to Steroid Hormone）等;圖5所示，主要CC富集條目如：染色質(zhì)（Chromatin）、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物（Transcription Factor Complex）、膜筏（Membrane Raft）等;圖6所示，主要MF富集條目如：核受體活性（Nuclear Receptor Activity）、為近端啟動子序列特異性DNA結(jié)合（Proximal Promoter Sequence-specific DNA Binding）、蛋白質(zhì)異二聚活性（Protein Heterodimerization Activity）等。

2.2.5 KEGG通路富集分析 通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的KEGG_PATHWAY通路注釋分析，獲取了三陰方的主要藥理學(xué)作用通路166條（Count≥2，P-Value≤0.05）。主要涉及PI3K-AKT信號通路（PI3K-AKT Signaling Pathway）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF Signaling Pathway）、p53信號通路（p53 Signaling Pathway）等。見圖7?？v坐標(biāo)表示富集條目，橫坐標(biāo)表示基因所占比例，圖中圓形面積越大代表富集基因數(shù)目越多，顏色越紅代表富集程度越顯著。

2.2.6 構(gòu)建靶標(biāo)-通路圖 將得到的通路條目、靶標(biāo)信息導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，繪制得到靶標(biāo)-通路圖。見圖8。紫色長方形代表靶標(biāo)，橙色橢圓形代表通路，面積越大富集越顯著。其中Degree≥10的靶有AKT1、MAPK1、RELA、CCND1、CDKN1A、CHUK、IKBKB、BAX、CDK4、CASP9、CASP3、RAF1、RB1、E2F1、MAPK8、BCL2、JUN。

3 討論

中醫(yī)學(xué)關(guān)于乳腺癌的記載最早見于葛洪的《肘后備急方》：“若發(fā)腫至堅而有根者，名曰石癰?！焙蟪苍皆凇吨T病源候論》中稱之為“乳石癰”，竇漢卿在《瘡瘍經(jīng)驗全書》中稱之為“乳巖”，TNBC在中醫(yī)學(xué)也屬于“乳巖”范疇[8]。在病機(jī)方面，歷代醫(yī)家均強(qiáng)調(diào)與七情內(nèi)傷密切相關(guān)，情志異常是導(dǎo)致乳腺癌發(fā)生發(fā)展的重要因素。情志異常，以致肝氣久郁，氣郁結(jié)聚于乳絡(luò)則可發(fā)病，加之飲食不佳，脾胃受損，運化不利，則痰濁內(nèi)生，加重病情?！渡鼾S遺書》中曾記載：“脾胃一傷，四臟皆無生氣。”TNBC患者肝脾不合是其發(fā)病關(guān)鍵，而瘀血內(nèi)停、痰濁內(nèi)生為疾病演變基礎(chǔ)，痰瘀互結(jié)為疾病主要病機(jī)轉(zhuǎn)歸，疾病發(fā)生、發(fā)展過程中虛、外傷、痰、瘀、郁相互促進(jìn)，互為影響，虛實夾雜，疾病纏綿難愈，治療則當(dāng)以疏肝健脾、養(yǎng)血益氣之法論治[9-10]。

盧雯平教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗，擬定三陰方（即逍遙散合理沖湯化裁方）用于臨床治療晚期TNBC患者。逍遙散出自《太平惠民和劑局方》，養(yǎng)血健脾，疏肝清熱;理沖湯出自《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》，具有益氣行血，調(diào)經(jīng)祛瘀之功效。方中柴胡疏肝解郁，以調(diào)達(dá)肝氣;白芍養(yǎng)血斂陰，柔肝緩急;黨參、黃芪、白術(shù)補(bǔ)脾胃之元氣，使氣旺而促血行、祛瘀而不傷正。三棱、莪術(shù)破血、行氣、消癥;枸杞子益精明目，滋補(bǔ)肝腎;天花粉清熱瀉火，生津止渴，排膿消腫;青蒿清熱涼血;白花蛇舌草清熱解毒、消痛散結(jié)。諸藥合用，有疏肝益腎，調(diào)理沖任之功，且攻補(bǔ)兼施，祛邪不傷正。

經(jīng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)發(fā)掘共得到三陰方篩選的136個活性成分及226個不同作用靶標(biāo)，經(jīng)過與TNBC相關(guān)作用靶標(biāo)取交集得到110個藥物與疾病相關(guān)活性成分與靶標(biāo)，活性成分為黃酮類化合物及甾醇類化合物。以往研究證實黃酮類化合物可以抑制腫瘤細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），從而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[11];黃酮類植物成分不僅可以通過抑制細(xì)胞色素P4501B1酶逆轉(zhuǎn)丙二醛-MB-468TNBC細(xì)胞對順鉑的耐藥性，還可以通過抑制TNBC細(xì)胞的遷移來誘導(dǎo)阿霉素的抗腫瘤活性，提示黃酮類植物成分能夠提高現(xiàn)有化療藥物對TNBC的療效[11-12]。有報道槲皮素不僅可以通過調(diào)節(jié)Foxo3a活性誘導(dǎo)TNBC細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯，而且其可以增強(qiáng)電熱療誘導(dǎo)TNBC細(xì)胞凋亡[13-14]。槲皮素和姜黃素聯(lián)合通過調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因協(xié)同作用誘導(dǎo)治療TNBC細(xì)胞株的抗癌活性[15]。同時它們可以與鈰離子形成復(fù)合物從而提高光動力療法治療TNBC的療效[16]。槲皮素聯(lián)合沒食子酸和沒食子酸酯通過下調(diào)S期激酶蛋白2的表達(dá)，誘導(dǎo)TNBC細(xì)胞S期阻滯和凋亡[17]。木犀草素及其苷已往研究中被證實對TNBC的MDA-MB-231細(xì)胞侵襲和凋亡有作用，而且可以通過下調(diào)β-catenin的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)上皮向間充質(zhì)的轉(zhuǎn)移抑制TNBC的轉(zhuǎn)移、細(xì)胞遷移和生存[18-20]。同時其可以通過AKT/mTOR信號通路表觀遺傳調(diào)控MMP9表達(dá)抑制雄激素受體陽性TNBC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，所以有研究表明木犀草素作為新型YAP/TAZ抑制劑是一種治療TNBC的新藥物[21-22]。有研究表明小劑量山柰酚可以抑制TNBC細(xì)胞的遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、凋亡和DNA損傷，還可以通過抑制P-21激活激酶4（PAK4）的活性改善TNBC的預(yù)后[23-25]。有研究將異鼠李素（IH）聯(lián)合氯喹（CQ）干預(yù)TNBC細(xì)胞和異種移植小鼠，可使小鼠的依賴性線粒體分裂和凋亡[26]。此外，異鼠李素與經(jīng)典的自噬/有絲分裂抑制因子聯(lián)合治療TNBC是一種新的治療策略。

在進(jìn)行GO富集的BP、CC與MF分析過程中，我們富集出來許多高相關(guān)性的富集條目，如氧化應(yīng)激反應(yīng)，有研究表明黏蛋白1（MUC1）是一種異二聚體腫瘤蛋白，其可通過氧化應(yīng)激反應(yīng)降低TNBC細(xì)胞的耐藥性[27];對金屬離子的響應(yīng)，有研究表明抗癌和抗血管生成藥物，毛殼菌合成的真菌代謝產(chǎn)物Chetomin（CHET）可以通過促進(jìn)鈣超載和線粒體功能障礙誘導(dǎo)人TNBC細(xì)胞凋亡[28];對類固醇激素的反應(yīng)，有研究表明雌二醇能夠誘導(dǎo)TNBC BDNF/TrkB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)腦轉(zhuǎn)移，且在雌激素受體β（ERβ）的TNBC細(xì)胞中具有抗增殖作用[29-30];對活性氧的反應(yīng)，有研究表明二萜類天然化合物C4（Crassin）能夠通過活性氧途徑對TNBC細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用[31];對抗生素的反應(yīng)，有研究表明鹽霉素不僅對TNBC細(xì)胞成活和遷移有影響，而且對TNBC細(xì)胞生長有抑制作用[32-33];活性氧代謝過程，有研究表明楊梅素通過過氧化氫產(chǎn)生鐵依賴性活性氧介導(dǎo)誘導(dǎo)TNBC細(xì)胞凋亡[34];染色質(zhì)，有研究表明染色質(zhì)復(fù)合物可以抑制膽固醇生物合成在TNBC中發(fā)揮抑癌作用[35];轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，有研究表明激活轉(zhuǎn)錄因子4通過SMAD2/3/4和mTORC2信號調(diào)節(jié)TGFβ誘導(dǎo)的乳腺癌侵襲性[36];膜筏，有報道證實脂筏破裂可以誘導(dǎo)TNBC細(xì)胞凋亡，降低TNBC細(xì)胞的成活率[37-38];主軸，有研究表明高水平的核仁紡錘體相關(guān)蛋白和低水平的BRCA1表達(dá)預(yù)示著TNBC預(yù)后不良[39];核受體活性，有研究表明孤兒核受體雌激素相關(guān)受體β（ERRβ或ESRRB）的小分子激動劑配體在TNBC細(xì)胞系中具有生長抑制和抗有絲分裂活性[40]。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的KEGG通路分析，預(yù)測了三陰方治療TNBC可能的主要藥理學(xué)作用通路，如PI3K-AKT信號通路。PI3K-AKT信號通路是TNBC耐藥和生存的重要途徑之一[41]。有隨機(jī)試驗表明，PI3K-AKT信號通路抑制劑聯(lián)合一線化療可提高TNBC患者的無進(jìn)展生存率（PFS）[42]。而雙重抑制PI3K-AKT和MEK5-ERK5信號通路比單獨抑制這2種途徑更有效地降低TNBC的增殖和成活[43]。有研究發(fā)現(xiàn)雷帕霉素靶點（mTOR）聯(lián)合阿霉素脂質(zhì)體和貝伐單抗通過PI3K-AKT-mTOR通路治療晚期化生性TNBC的安全性和有效性，蜈蚣總提取物（CME）可能通過抑制EGFR、PI3K/AKT/mTOR、核因子κB和STAT3通路治療TNBC，MiR-193通過ING5/PI3K/AKT途徑促進(jìn)TNBC細(xì)胞增殖和侵襲，IL-8過表達(dá)通過PI3K-AKT信號通路和EMT促進(jìn)TNBC細(xì)胞遷移[44-47];腫瘤壞死因子信號通路，有研究證明癌基因磷酸酶PRL-3通過腫瘤壞死因子信號通路導(dǎo)致TNBC細(xì)胞衰老和凋亡[48];p53信號通路，有研究證明環(huán)丙沙星通過p53信號通路誘導(dǎo)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡[49]。

通過靶標(biāo)-通路圖的繪制，我們發(fā)現(xiàn)AKT1、MAPK1、RELA、CCND1、CDKN1A、CHUK、IKBKB、BAX、CDK4、CASP9、CASP3、RAF1、RB1、E2F1、MAPK8、BCL2、JUN均與富集通路顯著相關(guān)。有研究表明Copine1（CPNE1）通過AKT信號通路促進(jìn)TNBC的腫瘤發(fā)生和抗輻射[50];MAPK的表達(dá)與腫瘤侵襲和TNBC轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為TNBC患者預(yù)后不良的指標(biāo)[51];磷酸化-Ser134-GR（pS134-GR）在TNBC中升高，通過MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)為侵襲性TNBC治療靶點[52];研究發(fā)現(xiàn)氟噻唑酰腙類化合物TSC-3C通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)MAPK途徑和誘導(dǎo)線粒體功能障礙等途徑抑制TNBC細(xì)胞的活性[53];CRT0066101是一種蛋白激酶D（PRKD）抑制劑，其通過MAPK1/3、AKT等信號通路有效地治療TNBC[54]。另有研究表明CDKN1A基因表達(dá)水平是影響TNBC患者預(yù)后的獨立因素[55]。吲哚-3-甲醇環(huán)四聚體衍生物CTet通過TNBC細(xì)胞株中CDKN1A/p21的過度表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[56]。腫瘤壞死因子通過CDKN1A/p21表達(dá)侵襲TNBC細(xì)胞[57]。

綜上所述，三陰方用于治療晚期TNBC臨床療效顯著，可延長患者的PFS，明顯改善患者的生命質(zhì)量。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究得到三陰方用于治療晚期TNBC具有多個有效成分、多作用靶標(biāo)及多作用通路的特點，為該方用于治療TNBC提供了理論依據(jù)，也為進(jìn)一步提取中藥有效成分，研制TNBC藥物提供了思路。

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（2020-05-11收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）