王盟 畢倩宇 李慧 呂傳峰

摘要 目的：觀察鉤藤堿固體脂質(zhì)納米粒（Rhy-SLN）對小鼠氣道平滑肌細(xì)胞（ASMC）的增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）表達(dá)以及TGF-β1/Smad信號通路的影響。方法：將小鼠ASMC體外分離培養(yǎng)，用Rhy-SLN干預(yù)ASMC，用免疫熒光法測定小鼠ASMC的PCNA的表達(dá);Western Blotting法檢測小鼠ASMC中Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、Smad4、Smad7蛋白表達(dá)。結(jié)果：Rhy-SLN在一定程度上可以降低小鼠氣道平滑肌細(xì)胞中PCNA的表達(dá)1.80±0.12比1.50±0.15（P<0.05），顯著下調(diào)Smad2蛋白1.09±0.20、p-Smad2蛋白1.97±0.70、p-Smad3蛋白4.47±0.35、p-Smad4蛋白1.42±0.20相對表達(dá)（P<0.05），顯著上調(diào)Smad7蛋白0.65±0.15相對表達(dá)（P<0.05），效果與通路阻滯劑SB431542組相似。結(jié)論：Rhy-SLN可以抑制小鼠ASMC的增殖，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)TGF-β1誘導(dǎo)的Smad信號通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞 鉤藤堿;固體脂質(zhì)納米粒;哮喘;支氣管平滑肌細(xì)胞;增殖細(xì)胞核抗原;轉(zhuǎn)化生長因子-β1

Effects of Rhynchophylline Solid Lipid Nanoparticles on Proliferation and TGF-β1/Smad Pathway in Airway Smooth Muscle Cells of Mice

WANG Meng1，2， BI Qianyu2， LI Hui1， LYU Chuanfeng1

（1 Jining NO.1 People′s Hospital， Jining 272000， China; 2 College of Chinese Traditional Medicine， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Ji′nan 250355， China）

Abstract Objective：To observe the effect of Rhy-SLN on the expression of PCNA and TGF-β1/Smad signal pathway of ASMC in mice. Methods：Mouse ASMC were isolated and cultured in vitro， Rhy-SLN interfered with ASMC， and the expression of PCNA in mouse ASMC was determined by immunofluorescence method; the expression of Smad2， p-Smad2， Smad3， p-smad3， Smad4， Smad7 in ASMC was detected by Western blot. Results：To a certain extent， Rhy-SLN can reduce the expression of PCNA in airway smooth muscle cells of mice [（1.80±0.12） VS （1.50±0.15）] （P<0.05）， significantly down regulate the relative expression of Smad2 （1.09±0.20）， p-Smad2（1.97±0.70）， p-Smad3（4.47±0.35）， p-Smad4（1.42±0.20） protein （P<0.05）， significantly up regulate the relative expression of Smad7 （0.65±0.15） protein （P<0.05）， the effect was similar to that of SB431542. Conclusion：Rhy-SLN can inhibit the proliferation of ASMC in mice， and its mechanism may be related to the regulation of Smad signal pathway induced by TGF-β1.

Keywords Rhynchophylline; Solid lipid nanoparticles; Asthma; Airway smooth muscle cell; Proliferating cell nuclear antigen; TGF-β1

中圖分類號：R284文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.16.010

支氣管哮喘涉及多種細(xì)胞及其組分，以可逆性的氣流阻塞和氣道的高反應(yīng)為特征的慢性炎癥疾病，其炎癥反應(yīng)的不斷發(fā)展刺激氣道平滑肌細(xì)胞（Airway Smooth Muscle Cell，ASMC）的增殖及肥大[1]。因此如何抑制AMSC的增殖，進(jìn)而抑制氣道重塑的過程，已經(jīng)成為了治療哮喘疾病新的研究方向。

鉤藤堿為中藥鉤藤的重要有效成分之一，具有抗高血壓、抗心肌缺血、抗心肌重構(gòu)等一系列藥理作用[2-6]。前期研究表明，鉤藤堿固體脂質(zhì)納米粒（Rhynchophylline-loaded Solid Lipid Nanoparticles，Rhy-SLN）可以緩解小鼠的哮喘反應(yīng)，降低支氣管肺泡灌洗液（BALF）中炎癥介質(zhì)IL-4、IL-5、IL-13、嗜酸性粒細(xì)胞以及血清中IgE的水平，并且可以降低小鼠肺組織中TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、Smad4的蛋白水平[7]。為進(jìn)一步明確Rhy-SLN緩解小鼠哮喘的分子作用機(jī)制，本實驗通過Rhy-SLN對小鼠氣道平滑肌細(xì)胞PCNA表達(dá)的影響以及對TGF-β1/Samd信號通路的影響，為鉤藤堿緩解支氣管哮喘提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 BALB/c雌性小鼠24只，8周齡，體質(zhì)量18～24 g，由濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院動物中心提供，動物合格證號：20030011。倫理批號：2021倫審研第（032）號。動物飼養(yǎng)條件：動物飼養(yǎng)溫度20～23 ℃，相對濕度40%～70%，動物自由進(jìn)食飲水，晝夜節(jié)律正常[8]。

1.1.2 藥物 鉤藤堿固體脂質(zhì)納米粒（濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部自制，批號：20161114）。

1.1.3 試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國，批號：12100-46）;TGF-β1（USCN公司，批號：RPA124Mu01）;PCNA（Proteintech公司，美國，批號：10205-2-AP）;鉤藤堿（阿拉丁公司，批號：R102720）;TGF-β1抗體（博斯特生物公司，批號：BA0290）;Smad2抗體（Cell Signaling公司，美國，批號：5339）、Smad3（Cell Signaling公司，美國，批號：9523）、細(xì)胞外蛋白調(diào)節(jié)激酶ERK（Cell Signaling公司，美國，批號：4695）;Smad4抗體（上海生工生物工程公司，批號：D120124）、Smad7（上海生工生物工程公司，批號：D160746）、p38（上海生工生物工程公司，批號：D151619）;SB431542（阿拉丁公司，批號：S125924）;倒置相差顯微鏡（麥克奧迪公司，型號：AE31）;CO2培養(yǎng)箱（上海力申，型號：HF-90）;凝膠成像分析系統(tǒng)（BIO-RAD公司，美國，型號：AV-1000）;酶標(biāo)儀（BIOTEK公司，美國，型號：ELx800）;熒光顯微鏡（OLYMPUS，日本，型號：IXplore SpinSR）。

1.2 方法

1.2.1 Rhy-SLN的制備 按照處方量精密稱取鉤藤堿、脂質(zhì)、卵磷脂，采用納米乳法制備鉤藤堿固體脂質(zhì)納米粒，4 ℃條件下密封保存?zhèn)溆肹9]。

1.2.2 ASMC的培養(yǎng)及傳代 取5周齡的小鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉處死，無菌條件下取出支氣管組織，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2遍，將支氣管剪碎，加入0.1%膠原酶和0.1%胰蛋白酶的混合消化液，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，放入37 ℃水浴鍋中進(jìn)行水浴消化20 min。用含雙抗的DMEM沖洗100目濾網(wǎng)，過濾消化混合液至15 mL離心管中離心。離心后棄上清液，細(xì)胞用完全培養(yǎng)基重懸，接種至12孔培養(yǎng)板中，37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%時，將培養(yǎng)板中培養(yǎng)基上清液棄去，PBS清洗2遍后棄去。加入一定體積的胰酶消化細(xì)胞，待細(xì)胞變圓加入一定量的完全培養(yǎng)基終止消化。

1.2.3 分組與給藥 收集4～6代小鼠ASMC，分為4個組，空白組，健康A(chǔ)SMC;TGF-β1組，加入5 ng/mL TGF-β1處理24 h;Rhy-SLN組，加入5 ng/mL TGF-β1及10 μmol/L Rhy-SLN處理24 h;SB431542組，加入5 ng/mL TGF-β1及10 μmol/L SB431542作用24 h。TGF-β1組、Rhy-SLN組和SB431542組在加藥前，使用0.2% BSA/DMEM serum-free的培養(yǎng)基培養(yǎng)ASMC使細(xì)胞增殖停滯。

1.2.4 免疫熒光檢測ASMC中PCNA的表達(dá) 取ASMC，去掉培養(yǎng)液，PBS沖洗，加4%多聚甲醛固定液固定15 min，清除4%多聚甲醛，PBS清洗3次，滴加0.1%tritonX-100至完全覆蓋細(xì)胞，室溫孵育30 min，PBS清洗3次，0.5%牛血清清蛋白封閉30 min。滴加一定量的山羊血清完全覆蓋細(xì)胞，室溫15 min。一抗用PBS按1∶50稀釋，滴加到完全覆蓋細(xì)胞，在4 ℃條件下過夜孵育。清除一抗，PBS清洗3次。滴加熒光二抗，稀釋比例為1∶200，滴加到完全覆蓋細(xì)胞，在室溫下孵育60 min。清除二抗，PBS清洗3次。滴加DAPI到完全覆蓋細(xì)胞復(fù)染細(xì)胞核。清除DAPI，PBS清洗3次。滴加抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察并進(jìn)行拍照。

1.2.5 Western Blotting法檢測ASMC中TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、Smad4、Smad7水平 取對數(shù)生長期的小鼠ASMC以2.0×105/孔接種于6孔板中，加入適量RIPA裂解液勻漿至充分裂解，BCA法進(jìn)行蛋白定量得出上樣量。取20 μg的蛋白加樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），隨后開始電轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)印后的PVDF膜加入5%的脫脂奶粉TBST封閉1 h。將膜置于1∶1 000稀釋的相應(yīng)一抗中，4 ℃冰箱過夜。PBS洗滌后，將膜放入辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG二抗（1∶2 000）孵育1 h。加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，室溫條件下反應(yīng)1～2 min，使用凝膠成像分析系統(tǒng)分析蛋白含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組間兩兩比較采用q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ASMC的鑒定 ASMC成長條形或者梭形，呈典型的峰谷狀生長。對平滑肌細(xì)胞特異的α-肌動蛋白免疫熒光染色陽性。見圖1～2。

2.2 Rhy-SLN對TGF-β1誘導(dǎo)的ASMC中PCNA表達(dá)的影響 與空白組比較，TGF-β1組、Rhy-SLN組、SB431542組細(xì)胞PCNA蛋白的表達(dá)有顯著上調(diào)（P<0.05），與TGF-β1細(xì)胞組比較，Rhy-SLN與SB431542組細(xì)胞PCNA蛋白的表達(dá)有顯著下調(diào)（P<0.05）。見表1和見圖3。

2.3 Western Blotting法檢測ASMC中Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、Smad4、Smad7的表達(dá) 與空白組比較，TGF-β1能顯著上調(diào)Samd信號通路中Smad2、p-Smad2、p-Smad3、p-Smad4蛋白相對表達(dá)，顯著下調(diào)Smad7蛋白相對表達(dá)（P<0.05）;與TGF-β1組比較，Rhy-SLN與SB431542組顯著下調(diào)Smad2、p-Smad2、p-Smad3、p-Smad4蛋白相對表達(dá)，顯著上調(diào)Smad7蛋白相對表達(dá)（P<0.05）。見表2～4和見圖4。

3 討論

鉤藤是我國傳統(tǒng)中草藥，鉤藤堿是鉤藤中含量最大的生物堿成分，具有降低血壓、抗血栓、抗血小板聚集等功效[10-11]。在前期的實驗中將鉤藤堿制成固體脂質(zhì)納米粒，并進(jìn)行了藥效和部分機(jī)制的動物體內(nèi)實驗，發(fā)現(xiàn)鉤藤堿固體脂質(zhì)納米粒在一定程度上可以緩解小鼠的哮喘反應(yīng)，降低支氣管肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-13、嗜酸性粒細(xì)胞含量以及血清中IgE的水平，還可以降低小鼠肺組織中TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、Smad4的蛋白水平[3]。

哮喘是一種以氣道慢性炎癥和支氣管平滑肌細(xì)胞異常增殖為病理特征的常見疾病[12-13]。增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）主要表達(dá)于細(xì)胞的增殖期，與細(xì)胞的分裂增殖有著密切的關(guān)系，常作為評價細(xì)胞增殖狀態(tài)的標(biāo)志物[14-16]。本研究結(jié)果顯示，鉤藤堿固體脂質(zhì)納米粒在一定程度上可以降低小鼠氣道平滑肌細(xì)胞中PCNA蛋白的表達(dá)，說明鉤藤堿固體脂質(zhì)納米?？梢砸种破交〖?xì)胞的增殖。

轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）有3種亞型，其中TGF-β1在哮喘發(fā)生演變的過程中起著重要的作用。Smads蛋白家族是TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中一個重要的基因家族，它受到激活后再將TGF-β1的信號從細(xì)胞表面的受體傳到細(xì)胞核的過程中起著重要作用。Smads蛋白家族有9種Smad蛋白，其中Smad2、Smad3為受體調(diào)節(jié)性蛋白，可以被磷酸化;Smad4為共同調(diào)節(jié)性蛋白，Smad7為抑制性蛋白，不可以被磷酸化[17-20]。為進(jìn)一步探討鉤藤堿固體脂質(zhì)納米粒緩解哮喘的作用機(jī)制，本研究利用鉤藤堿固體脂質(zhì)納米粒作用于小鼠氣道平滑肌細(xì)胞，檢測TGF-β1誘導(dǎo)的Smads蛋白表達(dá)的變化情況。結(jié)果顯示，鉤藤堿固體脂質(zhì)納米粒顯著下調(diào)Smad2、p-Smad2、p-Smad3、p-Smad4蛋白相對表達(dá)，顯著上調(diào)Smad7蛋白相對表達(dá)，效果與通路阻滯劑SB431542組相似，說明鉤藤堿固體脂質(zhì)納米?？梢哉{(diào)控TGF-β1/Smad通路。

綜上所述，鉤藤堿固體脂質(zhì)納米粒在一定程度上可以調(diào)控TGF-β1/Smad信號通路，進(jìn)而抑制小鼠氣道平滑肌細(xì)胞的增殖，從而發(fā)揮緩解哮喘的作用，為進(jìn)一步深入研究鉤藤堿固體脂質(zhì)納米粒緩解哮喘的作用機(jī)制以及探尋哮喘治療新靶點提供了一定基礎(chǔ)。

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（2020-07-01收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）