李自發(fā),張 浩,任 萌,徐凱勇,胡明會,周苗苗,王可洲

[1.山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心,濟南250355;2.山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)實驗動物學(xué)院/山東省實驗動物中心,濟南250002]

隨著現(xiàn)代工業(yè)的快速發(fā)展，金屬冶煉和工業(yè)廢棄物等不斷增加，鎘已經(jīng)成為一種廣泛存在的環(huán)境污染物［1］，且因其半衰期可長達10～25年，一旦進入機體將產(chǎn)生蓄積并持續(xù)發(fā)揮毒性作用。研究表明，環(huán)境中的鎘主要通過職業(yè)性暴露、香煙、食物鏈和水等途徑進入機體，可對肝臟、腎臟、心臟、骨骼、大腦等多器官以及生殖和免疫系統(tǒng)造成嚴(yán)重?fù)p害［2］。其中，肝臟作為以代謝功能為主的重要器官，在鎘等有毒金屬的外界刺激下均可引起脂質(zhì)代謝紊亂而導(dǎo)致肝功能障礙［3-4］。

近年來，天然藥物成分的解毒作用逐漸被發(fā)現(xiàn)，其對于有毒金屬肝損傷的保護作用效果及機制引起了人們的關(guān)注［5］。槲皮素是一種存在于蔬菜、水果及草本植物中的天然類黃酮，在抗氧化、抗炎、促進脂質(zhì)代謝方面表現(xiàn)出良好的效果［6］。據(jù)報告，槲皮素可保護肝臟免受鉛和其他重金屬的毒性影響［7］。而且，槲皮素能調(diào)控脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝蛋白表達，促進肝臟脂質(zhì)代謝，減少脂質(zhì)積累［8-9］。但槲皮素是否對鎘暴露所致的肝脂肪代謝紊亂具有保護效應(yīng)，尚未見報告。因此，本研究采用槲皮素干預(yù)鎘暴露C57BL/6J小鼠的方法，從血清肝功能指標(biāo)、肝組織病理變化和肝脂肪代謝3個方面，探索槲皮素對鎘致肝損傷的保護效應(yīng)及機制，為槲皮素臨床應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性C57BL/6J小鼠32只，7周齡，體質(zhì)量為（20±2）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司［SCXK（京）2016-0006］，實驗動物質(zhì)量合格證編號為1100112011023332。小鼠飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心屏障設(shè)施［SYXK（魯）2017-0022］，室溫（22±1）℃，相對濕度50%～60%，自由進食、飲水，12 h/12 h明暗節(jié)律（8∶00～20∶00光照），適應(yīng)性飼養(yǎng)1周［10-11］。動物實驗經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物福利倫理審查委員會審批通過（LLSH2019000017），嚴(yán)格按照實驗動物使用規(guī)范進行。

1.2 實驗藥品及試劑

槲皮素（美國Sigma公司，批號Q4951，規(guī)格10 g/瓶）；谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20190111、20190112）；總膽固醇（TC）和三酰甘油（TG）檢測試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司，批號182041、197971）；BCA蛋白濃度測定試劑盒及標(biāo)準(zhǔn)蛋白（上海碧云天生物技術(shù)研究所，貨號P0009）；羧甲基纖維素鈉（索萊寶科技有限公司，批號20180702）；蘇木素-伊紅染液購自武漢賽維爾生物科技有限公司；氯化鎘、無水乙醇、二甲苯、鹽酸、氨水和中性樹膠購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.3 動物分組與處理

實驗前根據(jù)小鼠體質(zhì)量基線值，分為4組，每組8只，即：對照組、槲皮素組、鎘組、鎘+槲皮素組。各組小鼠按以下方式進行處理：（1）8∶00～9∶00槲皮素組和鎘+槲皮素組小鼠按100 mg/kg體質(zhì)量劑量［12-13］灌胃槲皮素（0.5%羧甲基纖維素鈉溶解），灌胃體積為0.1 mL/10 g；對照組和鎘組小鼠按相同劑量灌胃羧甲基纖維素鈉（純凈水溶解）。（2）15∶00～16∶00鎘組和鎘+槲皮素組小鼠按2.5 mg/kg體質(zhì)量劑量［14］灌胃氯化鎘（純凈水溶解）；對照組和槲皮素組灌胃同等劑量純水。每日1次，持續(xù)8周。自由飲食飲水，于第4、8周稱其體質(zhì)量。待實驗結(jié)束后，戊巴比妥鈉（濃度1%，50 mg/kg）麻醉小鼠，腹主動脈取血，靜置離心后取血清。剝離肝臟，一半肝臟組織置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛溶液內(nèi)用于制作石蠟切片，其余部分置于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 肝臟病理分析

肝組織在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛溶液中固定24h，隨即脫水、透明、石蠟包埋，切成5μm薄片后進行HE染色，詳細(xì)步驟參考文獻［15］。同時，將冷凍肝臟組織切成8μm的薄片，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中完全干燥后，油紅O染色，詳細(xì)步驟參考文獻［16］。

1.5 血清與肝臟中生化指標(biāo)的測定

按照試劑盒說明書測定小鼠血清中ALT、AST、TC和TG以及肝臟組織中TC和TG的含量。

1.6 肝組織中脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白表達測定

按照組織蛋白提取試劑盒說明提取各組肝組織中蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。制備上樣樣品，沸水中變性5 min。按20μL/孔上樣，進行電泳。隨后采用蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移、膜封閉、一抗孵育、二抗孵育和顯色等標(biāo)準(zhǔn)步驟進行免疫印跡實驗。以β-actin或tubulin蛋白作為參考，用目的蛋白與β-actin或tubulin蛋白灰度值之比表示組織中目的蛋白脂肪酸合成酶（FAS）與脂蛋白脂酶（LPL）的表達水平。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.01軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料用±s表示，參數(shù)檢驗前數(shù)據(jù)進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，兩樣本均數(shù)比較用單尾非配對t檢驗；計數(shù)資料及率的比較用卡方檢驗，檢驗水準(zhǔn)設(shè)定為P＜0.05；偏離平均值兩倍及以上標(biāo)準(zhǔn)差的數(shù)據(jù)被視為異常值［17］，統(tǒng)計時將其剔除，行為異常的小鼠亦被剔除。

2 結(jié)果

2.1 鎘暴露對小鼠體質(zhì)量的影響及槲皮素的保護作用

如圖1所示，與對照組相比，鎘組小鼠體質(zhì)量于第4周（圖1A）、第8周（圖1B）出現(xiàn)明顯降低（P＜0.01，P＜0.05）。與鎘組相比，第4周鎘+槲皮素組小鼠體質(zhì)量顯著升高（P＜0.01），對照組、槲皮素組、鎘+槲皮素組之間小鼠體質(zhì)量無明顯變化（P＞0.05）。

圖1 鎘對小鼠體質(zhì)量的影響及槲皮素的保護作用Figure1 Effect of cadmium on body weight of miceand protectiveeffect of quercetin

2.2 鎘暴露對小鼠肝臟損傷的影響及槲皮素的保護作用

如圖2所示，與對照組相比，鎘組小鼠血清中ALT和AST含量顯著升高（P＜0.01）；與鎘組相比，鎘+槲皮素組小鼠血清中ALT和AST含量顯著降低（P＜0.05）；對照組、槲皮素組、鎘+槲皮素組之間小鼠血清中ALT和AST含量無明顯變化（P＞0.05）（圖2A）。HE染色結(jié)果顯示，對照組和槲皮素組小鼠肝臟組織小葉結(jié)構(gòu)清晰，未見異常；鎘組小鼠肝臟組織局部較大范圍的肝竇擴張，肝細(xì)胞索排列凌亂，肝細(xì)胞胞質(zhì)中可見少量脂肪空泡；與鎘組相比，鎘+槲皮素組病變有所減輕，肝小葉結(jié)構(gòu)較清晰，少量肝竇擴張（圖2B）。

圖2 鎘對小鼠血清ALT和AST含量（A）、肝組織病理學(xué)（B）（HE，×200）的影響及槲皮素的保護作用Figure 2 Effects of cadmium on serum ALT and AST levels（A），liver histopathology（B）（HE，×200）in mice and protective effect of quercetin

2.3 鎘暴露對小鼠血清及肝臟中TC和TG含量的影響及槲皮素的保護作用

如圖3所示，與對照組相比，鎘組小鼠血清及肝臟中TG和TC含量極顯著升高（P＜0.01）；與鎘組相比，鎘+槲皮素組小鼠血清及肝臟中TG和TC含量顯著降低（P＜0.05）；對照組、槲皮素組、鎘+槲皮素組之間小鼠血清及肝臟中TG和TC含量無明顯差異（P＞0.05）。

圖3 鎘對小鼠血清及肝組織中脂質(zhì)的影響及槲皮素的保護作用Figure3 Effect of cadmium on lipid in serum and liver of miceand protectiveeffect of quercetin

2.4 鎘暴露對小鼠肝組織中脂質(zhì)積累的影響及槲皮素的保護作用

油紅O染色結(jié)果（圖4）顯示：與對照組相比，鎘組小鼠肝臟脂滴顯著增多；與鎘組相比，鎘+槲皮素組小鼠肝臟脂滴明顯減少；鎘+槲皮素組和對照組相比，小鼠肝臟組織脂滴變化不明顯。

圖4 鎘對小鼠肝組織中脂質(zhì)沉積的影響及槲皮素的保護作用（油紅O，×200）Figure4 Effect of cadmium on lipid deposition in miceliver and protectiveeffect of quercetin（Oil red O，×200）

2.5 鎘暴露對小鼠肝臟中脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白表達的影響及槲皮素的保護作用

蛋白質(zhì)印跡檢測肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白表達的變化，結(jié)果如圖5所示。與對照組相比，鎘組的FAS表達量極顯著上升（P＜0.01），LPL表達量極顯著下降（P＜0.01），槲皮素組的LPL表達量極顯著上升（P＜0.01）；與鎘組相比，鎘+槲皮素組的FAS表達量極顯著下降（P＜0.01），LPL表達量極顯著上升（P＜0.01）。結(jié)果表明槲皮素可有效緩解鎘引起的肝臟脂質(zhì)代謝紊亂。

圖5 鎘對小鼠肝組織中FAS和LPL蛋白的影響及槲皮素的保護作用Figure 5 Effects of cadmium on FASand LPL proteins in mice liver and the protective effect of quercetin

3 討論

隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展，鎘已經(jīng)成為一種分布廣泛的重金屬環(huán)境污染物，主要通過食物鏈被人和動物吸收并在體內(nèi)蓄積，可損傷機體內(nèi)多個組織器官。肝臟作為脂質(zhì)代謝最活躍的器官之一，也是鎘毒性的重要靶器官。研究表明，鎘暴露可抑制肝細(xì)胞增殖能力，改變肝細(xì)胞形態(tài)，破壞肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，最終引起細(xì)胞死亡［18］。體質(zhì)量變化是反映機體功能正常與否最為直觀的指標(biāo)，也是毒理學(xué)檢測中常用指標(biāo)之一。動物體質(zhì)量增長過緩，說明機體的代謝受到威脅，影響正常的生命活動。本研究結(jié)果顯示，鎘暴露小鼠相較于正常小鼠體質(zhì)量顯著降低；進一步結(jié)合肝臟病理切片結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鎘組小鼠肝臟發(fā)生了明顯的組織病理學(xué)損傷，而槲皮素可以逆轉(zhuǎn)或緩解這種現(xiàn)象，降低鎘損傷。

脂質(zhì)作為一種基本的代謝產(chǎn)物，對于維持細(xì)胞功能具有不可替代的作用，而肝臟作為脂質(zhì)代謝中心，脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的變化可導(dǎo)致脂肪變性，長期的脂肪變性將演變?yōu)楦斡不?9］。肝臟脂質(zhì)代謝由一系列與脂肪生成和分解相關(guān)的基因控制。作為肝臟脂質(zhì)合成的重要激活因子，固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1（SREBP1）通過上調(diào)其下游脂肪合成酶（FAS）和乙酰輔酶a羧化酶（ACC）基因表達來調(diào)控脂質(zhì)生成過程［20］。同樣，PPAR-γ活化也可引起肝組織脂肪生成增加［21］。此外，LPL、CPT和HSL是3種關(guān)鍵的脂類酶，分別負(fù)責(zé)水解血漿脂蛋白中的三酰甘油、在細(xì)胞內(nèi)降解三酰甘油，以及將二酰甘油降解為單酰甘油［22］。PPAR-α通過參與線粒體β氧化和過氧化物酶體的氧化，在肝脂質(zhì)降解中發(fā)揮關(guān)鍵作用［23］。前期的研究發(fā)現(xiàn)，鎘暴露可通過增強膽甾醇酯轉(zhuǎn)移蛋白（CETO）活性，加重斑馬魚的高脂血癥和脂肪肝變化［24］。慢性鎘暴露可對鱟蟲幼蟲造成肝臟組織病理學(xué)損傷、基因表達改變和脂肪酸代謝紊亂［25］。本研究結(jié)果顯示，小鼠暴露于鎘環(huán)境中可引起血清和肝臟中TC和TG含量上升，肝臟脂質(zhì)合成關(guān)鍵酶FAS的表達增加，以及脂質(zhì)分解代謝酶LPL合成下降，進而導(dǎo)致脂滴在肝臟中不斷沉積。本研究與上述文獻結(jié)果一致，表明鎘可引起肝臟脂質(zhì)代謝紊亂和肝臟損傷。

槲皮素廣泛存在于植物的各個部位，如蔬菜、水果、蜂蜜、紅茶、葡萄酒及橄欖油中，具有抗氧化、降脂減肥、降血糖、抗腫瘤、抗炎癥等多種生理活性作用，對動物機體的脂肪沉積和代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用［26-27］。研究發(fā)現(xiàn)，10、20、40 mg/L槲皮素可降低脂肪細(xì)胞中PPAR-γ mRNA及蛋白表達，進而降低FATP1、FAS mRNA表達及蛋白含量。LPL基因多態(tài)性與豬、肉雞等脂肪沉積相關(guān)［28-29］，而日糧脂肪酸、能量水平和一些天然植物也能調(diào)控LPL基因表達［30-31］，槲皮素可顯著降低雞脂肪細(xì)胞中LPL基因表達，減少脂蛋白水解，達到抑制脂肪沉積的效果。同時，黃酮類物質(zhì)可通過腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶（DGAT）以及微粒體TG轉(zhuǎn)移蛋白（MTP）途徑抑制細(xì)胞TG聚積［32］。本研究發(fā)現(xiàn)，與鎘組相比，添加槲皮素共處理的小鼠血清和肝臟中TC和TG含量都顯著下降，同時FAS蛋白的表達也降低，LPL蛋白的表達升高，這表明槲皮素可以緩解鎘導(dǎo)致的脂質(zhì)代謝紊亂。

綜上所述，本研究結(jié)果表明鎘暴露可使小鼠體質(zhì)量下降，肝臟組織結(jié)構(gòu)發(fā)生病變，肝臟TC和TG水平上升，肝臟脂質(zhì)合成增加而分解降低，致肝臟脂質(zhì)代謝紊亂。槲皮素對鎘所致的肝臟脂質(zhì)代謝紊亂有一定保護作用，這可能是通過調(diào)節(jié)ALT、AST、TC、TG含量以及FAS和LPL蛋白水平的途徑來實現(xiàn)，可為臨床應(yīng)用槲皮素預(yù)防鎘中毒提供依據(jù)。