孫大鵬，李東芳，孔倩倩，劉廷

(山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬青島眼科醫(yī)院，山東省眼科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，山東 青島 266071)

真菌性角膜炎(fungal keratitis，F(xiàn)K)是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的致盲性眼病，在我國(guó)北方地區(qū)真菌感染是感染性角膜病的首位致病因素[1]。臨床常見(jiàn)的角膜真菌感染患者通常伴有植物外傷史，可因角膜上皮和基質(zhì)層的損傷形成角膜潰瘍，感染早期在未進(jìn)行刮除和抗真菌藥物等治療手段時(shí)，真菌菌絲生長(zhǎng)比較表淺，活體共聚焦顯微鏡可較容易在淺基質(zhì)層查見(jiàn)典型的菌絲。文獻(xiàn)[2-3]中報(bào)道，活體共聚焦顯微鏡診斷真菌感染的陽(yáng)性率達(dá)90%以上，明顯高于其他檢查方法。雖然活體共聚焦顯微鏡在診斷角膜基質(zhì)淺層真菌感染中具有很高的陽(yáng)性率，但當(dāng)臨床上遇到角膜感染病灶位于深基質(zhì)及內(nèi)皮面的真菌感染患者，即角膜后部真菌感染患者時(shí)，真菌感染常較難確診。由于角膜淺基質(zhì)層常缺乏明顯潰瘍病灶，角膜刮片檢查通常為陰性，且角膜后部真菌感染病灶可引起角膜基質(zhì)水腫和混濁，給活體共聚焦顯微鏡檢查增加了診斷難度。部分患者最終需要通過(guò)術(shù)后病理標(biāo)本檢查來(lái)得到確診。本研究對(duì)比角膜后部真菌感染的活體共聚焦顯微鏡檢查陽(yáng)性率與臨床病理檢查結(jié)果，以期對(duì)角膜后部真菌感染的診斷有所幫助。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

回顧性分析2009年11月至2020年12月因FK在青島眼科醫(yī)院就診并行穿透性角膜移植手術(shù)治療的18例角膜后部真菌感染患者的臨床資料，其中男11例，女7例。年齡23～73(平均53.5)歲。視力為0.1至FC20 cm，眼壓15～20 mmHg(1 mmHg=0.133 kg)。所有患者行活體共聚焦顯微鏡檢查前均知情同意，本研究符合青島眼科醫(yī)院倫理委員會(huì)要求。

入選標(biāo)準(zhǔn)：選擇就診時(shí)角膜表面無(wú)明顯潰瘍，角膜病灶位于深基質(zhì)及內(nèi)皮面的患者，術(shù)前經(jīng)共聚焦顯微鏡或術(shù)后經(jīng)病理檢查診斷明確，包括病史、裂隙燈檢查符合典型的角膜后部感染體征。術(shù)前均行角膜刮片KOH涂片檢查和活體共聚焦顯微鏡檢查，術(shù)后病變角膜片進(jìn)行病理組織切片和特殊染色檢查，根據(jù)角膜共聚焦顯微鏡檢查聯(lián)合術(shù)后病理確診為角膜后部真菌感染患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)伴有全身免疫性疾病和感染性疾??；2)排除角膜前部感染性病變的患者。

1.2 活體共聚焦顯微鏡檢查方法

使用海德堡激光共聚焦顯微鏡(HRTIII德國(guó)海德堡公司)，觀(guān)察視野為400 μm ×400 μm，放大倍數(shù)為800，分辨率為1 μm。簡(jiǎn)要檢查步驟：應(yīng)用0.4%奧布卡因滴眼2次進(jìn)行表面麻醉，開(kāi)瞼器撐開(kāi)眼瞼，患者坐位固定頭部，移動(dòng)共聚焦顯微鏡物鏡對(duì)齊患者角膜病灶中央，微調(diào)物鏡看到角膜表層上皮定位為0 μm，勻速旋轉(zhuǎn)調(diào)節(jié)物鏡向前推進(jìn)，間隔約10 μm深度采集各層角膜圖像，采集圖像最深度至約770 μm。所有檢查由同一名特檢科高年資醫(yī)師進(jìn)行。

1.3 手術(shù)方式

綜合FK患者病情考慮，術(shù)前應(yīng)用抗真菌藥物治療無(wú)效，感染癥狀持續(xù)進(jìn)展，視力明顯下降。18例患者因感染嚴(yán)重侵犯角膜深基質(zhì)層，前房炎癥反應(yīng)重，前房積膿行穿透性角膜移植術(shù)。所有患者接受PKP手術(shù)，首先測(cè)量Fleischer環(huán)直徑的大小以確定鉆切植床的環(huán)鉆直徑，角膜環(huán)鉆鉆取，再以鉆石刀切透全層，前房注入縮瞳劑，以角膜剪取下病變角膜組織，將制備好的較植床直徑大0.25 mm角膜植片應(yīng)用10-0尼龍縫線(xiàn)間斷縫合。在手術(shù)顯微鏡的自動(dòng)散光盤(pán)指導(dǎo)下調(diào)整縫線(xiàn)，消除術(shù)中散光[4]。

1.4 角膜組織病理組織學(xué)檢查

穿透性角膜移植手術(shù)在術(shù)中切除病變角膜組織，組織經(jīng)4%甲醛固定24 h以后，經(jīng)病灶中心取材，從80%乙醇開(kāi)始進(jìn)行梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋后切片，切片厚度4 μm，切片經(jīng)二甲苯脫蠟后，梯度乙醇復(fù)水，蘇木精伊紅染色，中性樹(shù)膠封片。

1.5 組織過(guò)碘酸-Schiff法(periodic acid-schiff，PAS)

病變角膜組織切取4 μm石蠟切片進(jìn)行PAS染色，簡(jiǎn)略步驟如下：石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇復(fù)水，過(guò)碘酸染色10 min，水洗1 min，雪夫氏染色20 min，硫代硫酸鈉洗2 min，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，中性樹(shù)膠封片。觀(guān)察角膜內(nèi)浸潤(rùn)的真菌菌絲，發(fā)現(xiàn)有紅色菌絲為真菌感染陽(yáng)性。

1.6 角膜組織六亞甲基四胺銀法(GMS)染色

病變角膜組織切取4 μm石蠟切片進(jìn)行過(guò)六胺銀(Grocott Methenamine silver，GMS)染色，簡(jiǎn)略步驟如下：石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇復(fù)水，8%鉻酸水溶液染色20 min，水洗1 min，0.5%偏重亞硫酸鈉液處理1 min，水洗后放入六胺銀工作液于60 ℃溫箱內(nèi)60 min，至切片呈黃褐色，見(jiàn)角膜基質(zhì)內(nèi)真菌菌絲呈黑褐色為陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 角膜后部真菌感染臨床表現(xiàn)和活體共聚焦顯微鏡檢查結(jié)果

患者發(fā)病前均有眼部角膜外傷病史，包括板栗刺傷、植物劃傷和異物碰傷等，最長(zhǎng)病史達(dá)3個(gè)月，最短病史約1個(gè)月，平均為2個(gè)月。發(fā)病初期均有反復(fù)發(fā)作的眼紅、痛、視力輕度下降，刺激癥狀等表現(xiàn)。經(jīng)治療后遷延不愈，病程后期癥狀加重，出現(xiàn)流淚、不能睜眼等體征，視力下降顯著，定位和紅綠色覺(jué)正常，角膜后部真菌感染患者體征表現(xiàn)為球結(jié)膜混合充血，可見(jiàn)角膜上皮尚完整，角膜水腫，病灶位于角膜中央或邊緣深基質(zhì)內(nèi)，病灶的內(nèi)皮面可見(jiàn)白色圓形混濁浸潤(rùn)，角膜病灶區(qū)內(nèi)皮面大量膿液附著(內(nèi)皮斑)，前房?jī)?nèi)滲出細(xì)胞，前房下方積膿。前節(jié)OCT檢查可見(jiàn)角膜基質(zhì)水腫，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，深層基質(zhì)混濁區(qū)域無(wú)法穿透。到本院就診后18例角膜后部真菌感染患者角膜刮片KOH涂片均未檢查到真菌菌絲，其中有16例患者經(jīng)活體共聚焦顯微鏡檢查到真菌菌絲(88.9%)，活體共聚焦顯微鏡檢查在基質(zhì)淺層未見(jiàn)樹(shù)枝狀菌絲，在深基質(zhì)和內(nèi)皮層查見(jiàn)典型的真菌菌絲伴炎細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1，2)。

圖1 典型角膜后部真菌感染患者裂隙燈、OCT及共聚焦圖像Figure 1 Representitive images of slit lamp,OCT and confocal microscope of retrocorneal fungal infection

大多數(shù)角膜后部真菌感染的病例在共聚焦顯微鏡下檢查均發(fā)現(xiàn)典型的深基質(zhì)或內(nèi)皮面菌絲，形態(tài)呈分枝狀，少數(shù)病例的共聚焦顯微鏡檢查圖片中最終僅查見(jiàn)單根菌絲(圖3)。術(shù)后真菌培養(yǎng)18例患者中有10例患者培養(yǎng)陽(yáng)性(55.5%)，其中鐮刀菌占5 例，曲霉菌占3 例，鏈格孢霉菌占2例。

圖3 典型角膜后部真菌感染患者的激光共聚焦顯微鏡檢查圖像Figure 3 Representitive images of confocal microscope of retrocorneal fungal infection

2.2 組織病理學(xué)PAS 和GMS 染色檢查結(jié)果

患者穿透性角膜移植術(shù)后行病理檢查，病理切片HE染色可見(jiàn)角膜深基質(zhì)層變性壞死，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，PAS染色聯(lián)合GMS染色在18例患者中均可檢查到真菌菌絲，角膜后部真菌感染PAS染色可見(jiàn)典型真菌菌絲侵犯角膜基質(zhì)深層，而角膜基質(zhì)淺層未查見(jiàn)真菌菌絲，GMS染色也可查見(jiàn)角膜基質(zhì)中黑色的菌絲(圖4)。角膜后部真菌感染患者活體共聚焦顯微鏡、病理檢查和真菌培養(yǎng)診斷陽(yáng)性率比較見(jiàn)表1。

表1 角膜后部真菌感染患者活體共聚焦顯微鏡、病理檢查和真菌培養(yǎng)診斷陽(yáng)性率比較Table 1 Comparison of positive rates of in vivo confocal microscopy,pathological examination and fungal culture in retrocorneal fungal infection

圖4 角膜后部真菌感染患者的角膜組織病理學(xué)HE、PAS和GMS染色圖像Figure 4 Representitive images of HE,PAS and GMS stain

2例角膜后部真菌感染患者術(shù)前無(wú)法明確為真菌感染，術(shù)前活體共聚焦顯微鏡檢查在內(nèi)皮面見(jiàn)大量團(tuán)狀高反光，細(xì)節(jié)視不清，角膜基質(zhì)水腫，可視圖像中未探及明顯病原體。角膜移植術(shù)后角膜組織病理切片進(jìn)行PAS染色可見(jiàn)后彈力層后表面大量紅染、樹(shù)枝狀的菌絲，內(nèi)見(jiàn)分隔(圖5)。

圖5 角膜深層真菌感染患者的裂隙燈、共聚焦及病理PAS圖像Figure 5 Representitive images of slit lamp,confocal microscope and PAS stain

圖2 典型角膜后部真菌感染患者裂隙燈及共聚焦圖像Figure 2 Representitive images of slit lamp and confocal microscope of retrocorneal fungal infection

3 討論

FK是國(guó)內(nèi)角膜感染致盲的首要原因，及時(shí)診斷和治療是預(yù)防FK并發(fā)癥發(fā)生的關(guān)鍵。在活體共聚焦顯微鏡發(fā)明之前，角膜組織刮片進(jìn)行KOH涂片是術(shù)前診斷FK的主要方法，而病理診斷是手術(shù)后診斷的唯一金標(biāo)準(zhǔn)。臨床常用的活體共聚焦顯微鏡是德國(guó)海德堡公司生產(chǎn)，其圖像最佳分辨率精度達(dá)1 μm，放大倍率達(dá)800倍[5]。活體共聚焦角膜顯微鏡具有快速、無(wú)創(chuàng)傷和可多次進(jìn)行的優(yōu)點(diǎn)，迅速在角膜組織觀(guān)察和病原體的診斷中發(fā)揮主導(dǎo)作用[4,6]。

活體共聚焦顯微鏡在診斷角膜真菌、阿米巴等感染性角膜病有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[7-9]，為臨床醫(yī)生提供手術(shù)依據(jù)，同時(shí)活體共聚焦顯微鏡對(duì)判斷抗真菌藥物治療效果，調(diào)整臨床治療方案也都提供客觀(guān)依據(jù)[10]。FK患者的感染病灶如果位于角膜深基質(zhì)或內(nèi)皮面，則稱(chēng)為角膜后部真菌感染[11]。在我們報(bào)道的角膜后部真菌感染患者大多數(shù)具有明確的植物、飛蟲(chóng)或者金屬等外傷病史，都應(yīng)小心細(xì)致的檢查。角膜深層真菌感染患者通常角膜病灶混濁較嚴(yán)重，由于病灶位于深基質(zhì)層，以及炎癥和內(nèi)皮損害引起角膜水腫，影響了激光的穿透性和成像清晰度，因此病灶中心區(qū)域在活體共聚焦顯微鏡下往往成像不清晰，首先應(yīng)著重針對(duì)病灶邊緣水腫較輕的區(qū)域進(jìn)行掃描，其次應(yīng)對(duì)患者角膜全層進(jìn)行細(xì)致的掃描，特別是有明顯的角膜內(nèi)皮面和前房積膿的患者，根據(jù)病灶的深度確定重點(diǎn)掃描的角膜后部范圍。

活體共聚焦顯微鏡對(duì)FK診斷的敏感性和特異性在不同文獻(xiàn)中報(bào)道略有差異[12]，Kanavi等[13]對(duì)133例感染性角膜炎患者進(jìn)行檢查，活體共聚焦顯微鏡對(duì)FK診斷的敏感率約為94%，特異性為78%。Chidambaram等[14]的研究納入239例患者，活體共聚焦顯微鏡對(duì)FK診斷的敏感性和特異性分別為85.74%和81.4%。本研究納入的病例是真菌感染中較為少見(jiàn)的角膜后部真菌感染，其中有兩例患者在術(shù)前活體共聚焦顯微鏡未能明確診斷，診斷率大約為88.9%，究其原因最大可能性是由于患者炎癥反應(yīng)重，角膜基質(zhì)混濁明顯，菌絲位于基質(zhì)貼近后彈力層甚至在前房?jī)?nèi)，深度可能超出活體共聚焦顯微鏡激光穿透能力以及儀器成像分辨率。在這種情況下，術(shù)后病理檢查就顯得尤為重要。

病理特殊染色PAS染色和GMS染色可將基底膜和糖原成分進(jìn)行特異性染色，高歡歡等[15]使用了PAS染色和GMS染色可良好地顯示角結(jié)膜原位癌基底膜，其中PAS染色顯色更為鮮明，與背景反差更明顯，操作更為方便，認(rèn)為其是一種理想的基底膜染色方法。在本研究的組織病理檢查PAS染色中可以清楚看到樹(shù)枝狀有分隔的菌絲結(jié)構(gòu)。應(yīng)用GMS染色也可觀(guān)察到對(duì)比清晰的菌絲。因此對(duì)于角膜后部真菌感染，病理學(xué)特殊染色檢查仍是不可或缺的檢查手段。因?yàn)檎婢z在HE切片中不能清晰的顯示，因此在臨床病理檢查中針對(duì)角膜切片中的菌絲常采用PAS染色，可以將真菌富含多糖的細(xì)胞壁清晰顯示，另外對(duì)角膜標(biāo)本病灶區(qū)域的多張切片進(jìn)行PAS染色，并結(jié)合GMS染色可明顯提高真菌檢出的陽(yáng)性率，在18例角膜后部真菌感染患者中均檢查到菌絲。

有研究表明活體共聚焦顯微鏡診斷真菌感染陽(yáng)性率與醫(yī)師臨床經(jīng)驗(yàn)有關(guān)系，Kheirkhah等[16]采集同一批真菌性和細(xì)菌性角膜炎患者的共聚焦圖像，比較不同臨床經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師應(yīng)用共聚焦顯微鏡診斷FK的差別，臨床經(jīng)驗(yàn)豐富的診斷醫(yī)師發(fā)現(xiàn)共聚焦圖像中菌絲的敏感性為71.4%，而臨床經(jīng)驗(yàn)較少的診斷醫(yī)師發(fā)現(xiàn)菌絲敏感性?xún)H為42.9%。表明診斷醫(yī)師的臨床經(jīng)驗(yàn)對(duì)共聚焦顯微鏡檢查結(jié)果有明顯的影響。活體共聚焦顯微鏡還可依據(jù)菌絲的形態(tài)進(jìn)行初步的菌種鑒定[17]，活體共聚焦顯微鏡能觀(guān)察到鐮刀菌和曲霉菌感染的菌絲分枝夾角有差別，可通過(guò)菌絲分枝的角度來(lái)初步區(qū)分鐮刀菌和曲霉菌感染，曲霉菌為有隔菌絲組成，菌絲分叉呈45°，而鐮刀菌菌絲分叉角度為90°。但是也有新近研究[18]對(duì)98例FK患者進(jìn)行研究，共聚焦顯微鏡下鐮刀菌分叉角度59.7°和曲霉菌分叉角度63.3°之間并無(wú)明顯差距，不能作為區(qū)分的標(biāo)準(zhǔn)。

綜上所述，共聚焦顯微鏡在FK的診斷具有無(wú)創(chuàng)、快速、可重復(fù)進(jìn)行等獨(dú)到優(yōu)勢(shì)，但在角膜后部感染病變的診斷中有一定的局限性，其次由于活體共聚焦顯微鏡無(wú)法對(duì)角膜組織進(jìn)行染色顯影，不能確定真菌的種屬、類(lèi)別，因此仍然需要與培養(yǎng)及組織病理檢查等手段結(jié)合起來(lái)，共同提高對(duì)FK的診斷率。