何保仁 劉金蓮 劉學(xué)軍

[摘要]目的調(diào)查研究南寧地區(qū)無償獻(xiàn)血人群 ABO 亞型的分布特點(diǎn)及分子遺傳學(xué)特征。方法收集2017年3月至2018年12月南寧地區(qū)無償獻(xiàn)血者血液樣本，采用試管法對微板法篩查出的正反定型不一致的樣本進(jìn)一步做血型血清學(xué)分析，并進(jìn)行亞型確認(rèn)。對亞型樣本進(jìn)行基因克隆測序，測序結(jié)果用軟件比對分析后，確定其基因型。結(jié)果從2017年3月至2018年12月南寧地區(qū)無償獻(xiàn)血者225587例血液樣本中檢出 ABO 亞型41例，其中 A 亞型6例、B 亞型25例、AB 亞型10例。對41例 ABO 亞型樣本進(jìn)行克隆測序分析，共檢測出3個常見 O 等位基因（O01、O04、O13）;3個常見 A 等位基因（A101、A102、Ael08）以及一個新的 A 等位基因;4個常見 B 等位基因（B101、B108、B305、Bw11）以及一個新的 B 等位基因。結(jié)論 ABO 亞型分布存在不均衡性和地域性差異。南寧地區(qū)獻(xiàn)血人群 B 亞型出現(xiàn)的頻率高于 A 亞型，最常見的亞型是 A102和 Bw11。

[關(guān)鍵詞]獻(xiàn)血人群; ABO 血型; ABO 亞型;克隆測序

[中圖分類號] R394.3? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A?? [文章編號]2095-0616（2021）24-0030-04

Molecular genetics research on the ABO subtypes of the blood donors in Nanning region

HE? Baoren??? LIU? Jinlian??? LIU? Xuejun

Nanning Institute ofTransfusion Medicine， Guangxi， Nanning 530007， China

[Abstract] Objective To probe into the distribution characteristics and molecular genetic characteristics of ABO subtypes among the voluntary blood donors in Nanning region . Methods The blood samples of the voluntary blood donors in Nanning from March 2017 to December 2018 were collected . For the samples screened by microplate technique to be with inconsistent positive and negative typing， further blood group serological analysis was carried out， and the subtypes were confirmed . After clone sequencing of genes of the subtype samples， the sequencing results were compared and analyzed by software and the genotypes were determined . Results From the 225587 blood samples of the voluntary blood donors in Nanning region from March 2017 to December 2018， 41 ABO subtypes were detected， of which 6 were subtype A， 25 were subtype B， and 10 were AB subtype . According to the clone sequencing analysis of 41 ABO subtype samples， those alleles that were detected included 3 common O alleles （O01， O04， O13）， 3 common A alleles （A101， A102， Ael08） and 1 new A allele， 4 common B alleles （B101， B108， B305， Bw11） and 1 new B allele . Conclusion The distribution of ABO subtypes is unbalanced， and it varies among regions . The frequency of subtype B among the blood donors in Nanning region is higher than that of subtype A， and the most frequently seen subtypes are A102 and Bw11.

[Key words] Blood donors; ABO blood group; ABO subtype; Clone sequencing

自1900年奧地利科學(xué)家 Karl Landsteiner 發(fā)現(xiàn) ABO 血型以來，ABO 血型系統(tǒng)一直是臨床輸血中最重要的血型系統(tǒng)之一[1-3]。在臨床輸血中，供受者 ABO 血型不合可導(dǎo)致嚴(yán)重的溶血反應(yīng)，主要原因是 ABO 亞型引起的血型誤判或漏檢。因此，精準(zhǔn)鑒定獻(xiàn)血者的血型對保障臨床輸血安全具有重要意義。 ABO 亞型是由于基因突變，導(dǎo)致紅細(xì)胞表面 A 抗原或 B 抗原表達(dá)數(shù)目減少，因此與抗 A 或抗 B 血清反應(yīng)出現(xiàn)凝集強(qiáng)度減弱的現(xiàn)象[4-5]。本研究對2017年3月至2018年12月南寧輸血醫(yī)學(xué)研究所獻(xiàn)血者常規(guī)血型檢測中發(fā)現(xiàn)的41例 ABO 亞型標(biāo)本進(jìn)行基因克隆測序分析，旨在了解南寧地區(qū)獻(xiàn)血人群 ABO 血型分布情況及 ABO 亞型分子生物學(xué)特征，積累本地區(qū)人群血型大數(shù)據(jù)資料，同時規(guī)范獻(xiàn)血者血型篩查，以保障臨床用血的安全性、有效性?，F(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

收集2017年3月至2018年12月南寧市無償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本，進(jìn)行常規(guī)血型檢測，對正反定型不一致的標(biāo)本進(jìn)行進(jìn)一步分析，經(jīng)吸收放散實(shí)驗(yàn)確定為 ABO 亞型的標(biāo)本共41例，其中男23例、女18例，年齡18～55歲，均為身體健康的無償獻(xiàn)血者。

1.2試劑與儀器

單克隆抗-A、抗-B 和抗-H（上海血液生物公司）、抗-A1抗體（荷蘭Sanquin公司）;人 ABO 反定型用紅細(xì)胞試劑（北京金豪公司）;抗-AB 抗體（DIAGAST 公司）;pGEM_T Vector 系統(tǒng)（美國 Promega 公司）;KA-2200型離心機(jī) （日本久保田公司）;GentraPuregene Blood Kit 外周血基因組抽提試劑盒（德國 QIAGEN 公司）;9700型基因擴(kuò)增儀和 ABI3730型 DNA 測序儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。所有試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.3方法

1.3.1血型血清學(xué)實(shí)驗(yàn)對微板法篩查中發(fā)現(xiàn)正反定型不一致或者抗原凝集強(qiáng)度較弱的樣本，采用試管法進(jìn)行 ABO 亞型鑒定，包括 ABO 正反定型試驗(yàn)、冷吸收熱放散試驗(yàn)，按血清學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)來判斷結(jié)果并進(jìn)行 ABO 亞型鑒定和分類[6]。

1.3.2基因克隆測序采用GentraPuregene Blood Kit 提取 ABO 亞型標(biāo)本基因組 DNA 備用，操作按試劑說明書進(jìn)行。通過 Primer 5.0軟件在 ABO 基因的第5內(nèi)含子側(cè)翼和第7外顯子之間設(shè)計引物（引物序列： ABO-F AGA GGA GGC AGA AGC TGA GTG GAG TTT C，ABO-R AGT TTA CCC GTT CTG CTA AAA CCA AGG G），用于擴(kuò)增目的片段（引物由上海生工合成）。PCR 擴(kuò)增體系：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸150 s，35次循環(huán)，完成后于72℃延伸5 min。擴(kuò)增片段長度為2.1 kb，擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收純化。通過 T4 DNA 連接酶將目的片段連接到pGEM_T質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化到 DH5α感受態(tài)細(xì)胞里，涂平板培養(yǎng)，挑取10個陽性克隆進(jìn)行測序。

1.3.3序列分析使用 Chromas 軟件閱讀測序圖譜，通過AlignX軟件與 GenBank 中的序列（NM_020469）進(jìn)行比對，確定基因型。

2結(jié)果

2.1 ABO亞型血清學(xué)檢測結(jié)果

2017年3月至2018年12月南寧地區(qū)獻(xiàn)血人數(shù)225587人，檢出 ABO 亞型41例，其中 A 型獻(xiàn)血人數(shù)52642人，亞型6例;B 型獻(xiàn)血人數(shù)59441人，亞型25例; AB 型獻(xiàn)血人數(shù)12216人，亞型10例; O 型獻(xiàn)血人數(shù)101288人，未檢出亞型標(biāo)本。

2.2 ABO基因克隆測序結(jié)果

本研究對41例 ABO 亞型樣本的第6、7外顯子和第6內(nèi)含子以及兩側(cè)側(cè)翼進(jìn)行克隆測序分析，共檢測出3個常見 A 等位基因（A101、A102、 Ael08）以及一個新的 A 等位基因，命名為Anovel;4個常見 B 等位基因（B101、B305、B108、Bw11）以及一個新的 B 等位基因，命名為Bnovel;3個常見 O 等位基因（O01、O04、O13），見表1。本研究發(fā)現(xiàn)3例標(biāo)本檢出兩種新的等位基因突變，一種血清學(xué)定型為 A 亞型，克隆測序顯示，一條鏈為 O01，另一條鏈與 A101比對，存在467C > T，737A > G 突變，導(dǎo)致氨基酸 P156L、Y246C 替換;另一種血清學(xué)定型為 B 亞型，克隆測序顯示，一條鏈為 O13，另一條鏈與 B101比對，存在734C > T 突變，氨基酸 T245I 替換，兩種新發(fā)現(xiàn)的等位基因序列均已提交到 GenBank，序列號為： MK144787和 MK568546。

3討論

ABO 血型抗原較其他血型系統(tǒng)抗原更為復(fù)雜， ABO 基因的編碼產(chǎn)物為特異性糖基轉(zhuǎn)移酶，由糖基轉(zhuǎn)移酶引導(dǎo)合成 ABO 抗原[7]。ABO 血型是臨床輸血必須鑒定的血型之一，除了常見的4種 ABO 表型之外，根據(jù)紅細(xì)胞與抗血清或血凝集素的凝集反應(yīng)強(qiáng)度、血清中抗體以及唾液等分泌液中血型物質(zhì)， ABO 表型又有 A 亞型和 B 亞型之分。目前血型抗原基因突變數(shù)據(jù)庫上已報道的 ABO 等位基因有397個，其中 A 等位基因152個、B 等位基因108個，由血清學(xué)定義的同一種 ABO 亞型可以對應(yīng)多種等位基因[8]。

南寧地區(qū)獻(xiàn)血人群 ABO 血型分布為 O 型最多，占44.9%，其次是 B 型，占26.35%， A 型占23.34%， AB 型占5.41%，分布數(shù)量為 O > B > A > AB，與海南、廣州等地分布比較接近[9-11]，符合中國南方各省 O 基因頻率較其他地區(qū)高的特點(diǎn)。本研究顯示 B 亞型的出現(xiàn)頻率明顯高于 A 亞型的出現(xiàn)頻率，與張嶸等[7，12-13]報道一致。A 亞型等位基因主要為 A102，未檢測到 A2等位基因。 A102在中國人群的比例相對較高，是常見基因型。A102與 A101在序列比對上，發(fā)生467位點(diǎn)的單個堿基替換（C → T），導(dǎo)致氨基酸 Pro → Leu 替換，兩者翻譯糖基轉(zhuǎn)移酶的活力無明顯差異[14]。但是在本研究血清學(xué)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的 A102凝集強(qiáng)度均較弱，因本研究只做第6、7外顯子和第6內(nèi)含子測序，推測是其他外顯子或者調(diào)控區(qū)存在變異導(dǎo)致[8]。B 亞型等位基金主要是 Bw11，說明 Bw11亞型在本地區(qū)比較常見，Bw11亞型是由喻瓊等[15]首先報道的，與 B101等位基因的差異僅在于 nt695位點(diǎn) T > C 突變，相應(yīng)的232位氨基酸由亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦彼?，?dǎo)致糖基轉(zhuǎn)移酶活性部分喪失。O 亞型等位基因主要為 O01和 O13，其中 O01是中國人群中比較常見的等位基因，O13在其他地區(qū)比較少見，推測是廣西地區(qū)人群特有的基因特征。

本研究發(fā)現(xiàn)兩個新的等位基因，新的等位基因都是錯義突變，推測可能是由于氨基酸的替換改變了糖基轉(zhuǎn)移酶構(gòu)象，使酶活性降低。關(guān)于其如何影響酶的活性，還需進(jìn)一步研究。

ABO 亞型雖然較為少見，但其可能嚴(yán)重影響輸血的安全性和有效性。研究并闡明南寧地區(qū)人群 ABO 亞型的分子遺傳學(xué)特點(diǎn)，不僅可以指導(dǎo)臨床安全輸血，降低輸血風(fēng)險，還能對我國人類遺傳學(xué)研究、血型與疾病相關(guān)性研究及法醫(yī)物證鑒定等提供幫助。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Chen DP，Sun CF，Ning HC，et al . Genetic and mechanistic evaluation for the weak A phenotype in Ael blood type with IVS6+5G > A ABO gene mutation[J].Vox Sang，2014，108（1）：64-71.

[2]方樂，蘇周，劉艷，等.ABO*BW.03等位基因的鑒定及特性研究[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2021，31（11）：1359-1361.

[3]王中英，劉曦，蔡茵，等.無償獻(xiàn)血者人群中 ABO 亞型漏檢及人群頻率研究[J].中國輸血雜志，2019，32（11）：1113-1116.

[4]雷航，范亮峰，蔡曉紅，等.中國人群血型 ABO 亞型的分子基礎(chǔ)研究[J].診斷學(xué)理論與實(shí)踐，2020，19（4）：364-369.

[5]張爽，馬怡然，郝一文.A 亞型鑒定與臨床輸血[J].中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2021，50（4）：378-381.

[6]向東.ABO 亞型的檢測[J].中國輸血雜志，2010，23（8）：577-580.

[7]張嶸，蘇品璨，田力，等.昆明地區(qū)無償獻(xiàn)血者 ABO 亞型的分子遺傳學(xué)分析[J].中國輸血雜志，2012，25（3）：219-223.

[8]趙桐茂.基因分型預(yù)測 ABO 亞型的局限性[J].臨床輸血與檢驗(yàn)，2018，20（2）：113-116.

[9]劉芳，危燕芬，朱仕清.花都區(qū)無償獻(xiàn)血人群 ABO、 Rh 血型分布調(diào)查[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2014，35（13）：1961-1962.

[10]蔡于旭，章雅清.海南地區(qū)無償獻(xiàn)血人群 ABO、Rh 血型分布調(diào)查[J].中國輸血雜志，2012，25（7）：384-683.

[11]黃伯泉，鄭優(yōu)榮，王淏，等.廣州地區(qū)獻(xiàn)血人群 ABO 及 Rh 血型檢測的回顧性分析[J].重慶醫(yī)學(xué)，2021，50（10）：1708-1711.

[12]張韋，馮智慧，張秀錚.濱州地區(qū)供血者 ABO 血型系統(tǒng)亞型分析[J].中國輸血雜志，2017，30（2）：135-138.

[13]黃文娟，劉不盡，鄒海曼，等.重慶地區(qū)無償獻(xiàn)血者 ABO 亞型分布及鑒定淺析[J].中國輸血雜志，2020，33（5）：494-496.

[14]馬曉莉，馬宏偉，金新莉，等.A 抗原減弱表型的基因分析[J].鄭州大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2017，52（2）：191-193.

[15]喻瓊，吳國光，梁延連，等.一個中國漢族 ABO 血型 B 亞型家系中發(fā)現(xiàn)新的 B 等位基因[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2005，22（2）：129-133.

（收稿日期：2021-07-06）